動靜態(tài)小鼠胚胎培養(yǎng)方法的囊胚獲得率的對比▲

李 楠 張名媛 陽曉敏 林 忠

(1 廣西柳州市婦幼保健院生殖醫(yī)學中心/柳州市生殖與遺傳研究所/廣西科技大學附屬婦產醫(yī)院、兒童醫(yī)院，柳州市 545001,電子郵箱：linan520672@126.com；2 廣西醫(yī)科大學實驗動物中心，南寧市 530021；3 廣西壯族自治區(qū)生殖醫(yī)院婦產科，南寧市 530021)

人類輔助生育技術(assisted reproductive technology，ART)已成為治療各種原因導致不孕不育的主要手段，但是ART的臨床妊娠率僅約為30%，仍有很大的提高空間。移植高質量的胚胎是提高臨床妊娠率的關鍵，因此如何提高早期體外培養(yǎng)胚胎(第3天、第5天或第6天囊胚)的質量成為ART的重點研究課題之一。

目前，有關ART的研究都集中在優(yōu)化培養(yǎng)液體上，如改進培養(yǎng)液的成分、補充能量、增加生長因子等。如何利用現(xiàn)在的培養(yǎng)液、氣體等條件，更加準確地模擬輸卵管內早期胚胎生長發(fā)育的環(huán)境，給胚胎一個更加接近或者相似的母體內培養(yǎng)環(huán)境，從而提高早期胚胎質量，是我們所面臨的主要問題。雖然相關技術不斷成熟，培養(yǎng)液(序貫培養(yǎng)液和階段培養(yǎng)液)、培養(yǎng)箱(單氣和三氣)等方面的優(yōu)化仍未得到很好的改進，導致ART的妊娠率未能提高。在靜態(tài)微滴培養(yǎng)下，隨著胚胎代謝活動的逐漸增強，各類代謝產物、胚胎毒性物質不斷積累，而營養(yǎng)物質不斷被消耗，導致胚胎的發(fā)育能力受到阻礙[1]。有學者對早期胚胎在輸卵管內的發(fā)育過程及輸卵管內的生理表現(xiàn)進行研究，發(fā)現(xiàn)輸卵管內的纖毛細胞通過擺動引導胚胎向子宮移動，在這個過程中纖毛細胞還會產生6～20 Hz持續(xù)性的脈沖力，他們認為胚胎在體內的發(fā)育環(huán)境是動態(tài)的，是向子宮腔內移動的，其中早期胚胎周圍的化學環(huán)境和物理環(huán)境在不斷地發(fā)生變化[2]。本研究利用Viboviduct 1500胚胎微脈沖震動儀，模擬輸卵管內的動態(tài)環(huán)境，促進胚胎與培養(yǎng)液中物質的交換，觀察胚胎的體外發(fā)育情況，為提高早期體外培養(yǎng)胚胎的質量提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 20只昆明雌鼠，8～10周齡，體重40～45 g，10只昆明雄鼠，10～12周齡，體重50～55 g，動物及飼料、墊料均購自廣西醫(yī)科大學的實驗動物中心(動物許可證號SCXK桂2014-0002)。昆明鼠在12/12 h晝夜交替，濕度為45%～70%的25℃飼養(yǎng)環(huán)境中喂養(yǎng)，自主飲水和攝食，適應性飼養(yǎng)1周后按照程序進行超排卵。

1.2 主要藥品與試劑 人絕經期促性腺激素(human menopausal gonadotropin，HMG；批號：180908)、絨促性素(批號：180902)均購自麗珠藥業(yè)公司，均在有效期內使用。精子梯度分離液(批號：上層為99257190704，下層為99258190705)、人輸卵管液(human tubal fluid,HTF；批號：90126180603)操作液、血清蛋白替代品(批號：99193180302)、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS；批號：9235171121)、胚胎培養(yǎng)礦物油(批號：507333)均購自美國Irvine公司。洗精液(批號：507573)、受精液(批號：507573)、卵裂培養(yǎng)液(G1，批號：507674)和囊胚培養(yǎng)液(G2，批號：507675)購自瑞典Vitrolife公司。

1.3 方法

1.3.1 超排卵干預：適應性喂養(yǎng)1周后，實驗第1天5：00 PM給雌性小鼠腹腔注射0.1 mL(10 U)HMG，48 h后，注射0.1 mL(10 U)絨促性素。

1.3.2 體外受精及胚胎培養(yǎng)：(1)卵母細胞的獲取。注射絨促性素14 h后，脫頸處死雌鼠，剖取輸卵管，用PBS洗滌后置于平皿內。無菌環(huán)境下，于解剖顯微鏡下用解剖針輕輕刺破輸卵管的膨大部，使卵母細胞自然流出，使用巴斯德管分離卵母細胞，將卵母細胞放入60 mm的4孔培養(yǎng)皿中。(2)精液的獲取。參照文獻[3]獲取精液，脫頸處死雄鼠，截取附睪尾，用PBS洗滌后置于平皿內。在無菌環(huán)境下，于解剖顯微鏡下用解剖針刺破附睪，釋放出精子，將精子挑到200 μL平衡過夜的受精液滴中，置于相應的培養(yǎng)箱(6.0%二氧化碳、37℃、100%濕度)中培養(yǎng)約1 h，精子獲能。(3)胚胎培養(yǎng)：將5～10 μL獲能的精子加入含有卵母細胞的60 mm 4孔培養(yǎng)皿中，置于培養(yǎng)箱(6.0%二氧化碳、37℃、100%濕度)中培養(yǎng)6 h后洗卵，將受精卵挑出放入含有卵裂液的培養(yǎng)皿中、置于培養(yǎng)箱(6.0%二氧化碳、37℃、100%濕度)再培養(yǎng)24 h，收集受精胚胎。將獲得的胚胎隨機分為靜態(tài)培養(yǎng)組和動態(tài)胚胎培養(yǎng)組。靜態(tài)培養(yǎng)組將胚胎分別放置于含卵裂培養(yǎng)液和囊胚培養(yǎng)液微滴的胚胎培養(yǎng)皿中，靜置于6%二氧化碳，100%濕度、37℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)114 h。動態(tài)胚胎培養(yǎng)組則將胚胎培養(yǎng)皿放置于Viboviduct 1500胚胎微脈沖震動儀(德國SimSoTec公司)上，Viboviduct 1500的設置參數(shù)為42 Hz,6 s/60 min，其他操作與靜態(tài)培養(yǎng)組相同，實驗所用的液體均需要過夜平衡處理，胚胎培養(yǎng)及受精所用液體均在6.0%二氧化碳、37℃、100%濕度環(huán)境中過夜平衡處理。

1.4 觀察指標 將獲得的胚胎置于培養(yǎng)箱中，以完成絨促性素注射后計算時間，經72 h和114 h分別得到8細胞期的胚胎和囊胚，記錄靜態(tài)培養(yǎng)及動態(tài)培養(yǎng)的卵裂胚胎數(shù)和囊胚數(shù)。

1.5 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示，組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

共110個胚胎行靜態(tài)培養(yǎng)，卵裂胚胎數(shù)102個，囊胚數(shù)89個，囊胚率為80.9%；共120個胚胎行動態(tài)培養(yǎng)，卵裂胚胎數(shù)113個，囊胚數(shù)111個，囊胚率為92.5%。動態(tài)培養(yǎng)的囊胚率高于靜態(tài)培養(yǎng)(χ2=6.798,P=0.009)。

3 討 論

培養(yǎng)出高質量的胚胎，是行體外受精-胚胎移植后獲得妊娠的主要因素之一。雖然體外胚胎培養(yǎng)技術已取得很大的進步，但目前所使用的靜止微滴培養(yǎng)系統(tǒng)仍無法完全模擬哺乳動物雌性生殖道的生理及環(huán)境條件[4]。靜態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)所獲胚胎與體內生長發(fā)育的胚胎相比仍存在較多缺點，如有較高的染色體倍型異常率，RNA活性存在差異，大量輔助因子的基因出現(xiàn)異常表達，冷凍保存后解凍復蘇效果較差等，導致移植后獲得的胚胎存在較多問題。研究顯示，體內的胚胎在發(fā)育過程中處于一個動態(tài)的環(huán)境：著床前的胚胎是獨立的，在輸卵管內自由浮動，借助液體的流動不斷移動到達子宮并植入子宮[5]。但培養(yǎng)箱內的環(huán)境則是靜態(tài)的。

為解決靜態(tài)培養(yǎng)所面臨的問題，有學者提出了動態(tài)培養(yǎng)，認為其可以更好地模擬女性輸卵管內的生理環(huán)境和體內動態(tài)環(huán)境，促進胚胎發(fā)育和提高胚胎質量[6]。德國SimsoTec公司推出了Viboviduct 1500微脈沖震蕩儀，該產品可模仿女性輸卵管的振動[7]，通過設置振動的強度、頻率和時間間隔，模擬輸卵管對胚胎的刺激從而提高胚胎體外培養(yǎng)的質量[8]。其還可以避免流體剪切力對細胞的損害，消除代謝物蓄積對胚胎生長發(fā)育的不利影響，有效模擬輸卵管的內部微環(huán)境，激活營養(yǎng)信號通路等，從而促進胚胎發(fā)育和提高胚胎質量[9]。Heo等[10]研究微流控的動態(tài)胚胎培養(yǎng)對小鼠胚胎發(fā)育的影響，發(fā)現(xiàn)動態(tài)胚胎培養(yǎng)的孵化囊胚數(shù)和內細胞團數(shù)均多于靜置培養(yǎng)體系，且與體內來源的囊胚相似。這提示動態(tài)胚胎培養(yǎng)法不僅有利于小鼠植入前胚胎發(fā)育，而且提高了胚胎的種植率和繼續(xù)妊娠率，有效降低了流產率。Hur 等[11]認為，動態(tài)培養(yǎng)可以顯著提高優(yōu)胚率及囊胚細胞數(shù)，以及D5的囊胚率和臨床妊娠率。Isachenko等[12]的研究結果顯示，脈沖振動可以顯著提高胚胎的發(fā)育能力和臨床妊娠率。此外有研究顯示，使用動態(tài)培養(yǎng)可以促進鈣離子的流通，不會影響胚胎的自分泌生長因子，可提高優(yōu)胚率和囊胚率[13]。本研究結果顯示，與靜態(tài)培養(yǎng)相比，動態(tài)培養(yǎng)可以提高囊胚率。這提示基于Viboviduct 1500微脈沖震蕩儀的胚胎動態(tài)培養(yǎng)方法，可通過設置微動力的頻率和時間來調整培養(yǎng)液，同時模擬體內胚胎輸卵管的機械和生化環(huán)境，從而提高胚胎的發(fā)育潛能。

綜上所述，基于Viboviduct 1500微脈沖震蕩儀的胚胎動態(tài)培養(yǎng)方法，可以提高胚胎的發(fā)育潛能，提高囊胚率。但本研究尚處于初級階段，還需要大量的臨床試驗數(shù)據(jù)來證實其應用于人類胚胎培養(yǎng)的可行性。