microRNAs與角膜新生血管

張曉萍，王 琛，狄國虎

0 引言

角膜的透明性對于維持眼睛正常屈光非常重要，某些病理條件下，如先天性疾病、炎癥、化學(xué)燒傷、角膜緣干細胞缺乏、感染性角膜炎、自身免疫性疾病以及角膜移植排斥反應(yīng)等，促血管和抑制血管因素之間的平衡被打破，引起血管內(nèi)皮細胞增殖并遷移到角膜基質(zhì)，發(fā)生角膜新生血管引起視力下降甚至致盲[1]。角膜疾病是重要的致盲原因，每年有約1400萬角膜新生血管患者需要治療[2]。

正常角膜處于富含血管的環(huán)境中，卻能保持無血管化，歸因于內(nèi)源性血管抑制因子。microRNAs(miRs)是一類內(nèi)源性小分子非編碼RNA，長度約22個核苷酸。1993年最先在秀麗隱干線蟲中發(fā)現(xiàn)miRs[3]，隨后關(guān)于miRs的研究迅速發(fā)展，miRs幾乎存在于所有多細胞動物和植物，其表達具有組織特異性，且隨著發(fā)育進程也發(fā)生變化。miRs在人體中分布廣泛，具有重要的生物學(xué)功能，近年研究發(fā)現(xiàn)，某些miRs在角膜新生血管的形成中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[4-6]。

1 miRs在角膜的表達

角膜上皮細胞層對于預(yù)防角膜感染、維持角膜正常功能發(fā)揮重要作用[7]，角膜中特異性表達的miRs有助于維持角膜無血管化。Ryan等[8]對成年小鼠的角膜上皮、晶狀體、睫狀體和視網(wǎng)膜進行微陣列分析，發(fā)現(xiàn)miRs在眼部各結(jié)構(gòu)中的表達并不相同，超過31種miRs在角膜中高表達。同一種miR在角膜各層的分布也不完全一致，如miR-184主要表達于角膜基底上皮層，而表層上皮層很少表達，在角膜緣及結(jié)膜上皮層不表達[8-9]，miR-205和miR-217在全角膜、角膜緣及結(jié)膜上皮中均有表達，miR-182在角膜上皮及角膜緣上皮中低表達[8]。在生理和病理情況下，同一部位的miRs表達發(fā)生變化，在正常角膜中miR-204主要高表達于上皮層，發(fā)生角膜新生血管后，角膜上皮中miR-204降低，而角膜基質(zhì)的miR-204表達并無明顯變化[10-11]，這些差異表達的miRs對角膜新生血管具有重要的調(diào)控作用。角膜中有豐富的神經(jīng)分布，正常的神經(jīng)支配對于維持角膜上皮層的完整性非常重要，在糖尿病性角膜病變中，角膜敏感性和神經(jīng)分布異常，角膜損傷后修復(fù)時間延長，體外研究發(fā)現(xiàn)miR-182能夠促進糖尿病鼠的三叉神經(jīng)元生長，外源性增強miR-182表達有助于小鼠角膜上皮修復(fù)[7]。另有研究發(fā)現(xiàn)miR-183/96/182在角膜和三叉神經(jīng)節(jié)中表達，抑制miR-183/96/182表達使角膜神經(jīng)密度降低，此外，miR-183/96/182通過調(diào)控角膜神經(jīng)支配和固有免疫而參與綠膿桿菌性角膜炎的病理過程[12]。

2 miRs參與調(diào)控免疫和炎癥反應(yīng)

角膜化學(xué)損傷是引起角膜新生血管的常見原因，急性期內(nèi)各種細胞因子高度聚集，小鼠角膜堿損傷后6～72h內(nèi)角膜水腫逐漸加重，角膜中miR-206表達明顯升高，miR-206直接靶向調(diào)控連接蛋白43(Cx43)的表達，Cx43廣泛分布于哺乳動物的各個組織器官中，與角膜損傷引起的炎癥損傷關(guān)系密切，Cx43在角膜損傷后24h～3wk，先低表達再高表達，到損傷3wk時再次低表達，Cx43表達增高有助于抑制炎癥反應(yīng)、促進角膜損傷修復(fù)[13-15]。在堿燒傷后72h內(nèi)抑制miR-206表達有助于抑制角膜炎癥反應(yīng)，減輕堿燒傷引起的角膜損傷[15]。在大鼠角膜堿燒傷過程中，骨髓間充質(zhì)干細胞中高表達的miR-146a有助于抑制細胞凋亡，由于miR-146a降低p65核因子-κB(p65 NF-κB)和增殖細胞核抗原的表達、減少炎癥因子分泌，進而抑制大鼠角膜堿燒傷引起的角膜新生血管形成[16]。

單純皰疹病毒(HSV)感染引起角膜慢性免疫炎癥反應(yīng)，反復(fù)發(fā)作后引起角膜新生血管生長、炎癥細胞浸潤。近期研究發(fā)現(xiàn)，病毒編碼的miRs參與腫瘤發(fā)生[17]，人巨細胞病毒與細胞miRs協(xié)同發(fā)揮作用，使病毒免受免疫系統(tǒng)清除，獲得免疫逃逸[18]。角膜病毒感染引起某些miRs改變，如角膜HSV感染2d時，miR-132明顯升高，miR-132靶向調(diào)控血管相關(guān)因子Ras1的活性，進而發(fā)揮抑制角膜新生血管的作用[19]。研究發(fā)現(xiàn)，HSV1感染可引起角膜高表達miR-155，這種高表達主要出現(xiàn)在巨噬細胞和CD4+T細胞中，少量出現(xiàn)在中性粒細胞，小鼠敲除miR-155后，眼部及淋巴器官的Th1和Th17被抑制，淋巴結(jié)中活化CD4+T細胞的磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸肌醇5-磷酸酶1和IL-γ受體a鏈水平增高，這有助于減輕病毒性角膜炎的基質(zhì)損傷，而抑制miR-155表達可使HSV1感染引起的角膜基質(zhì)炎減輕，并且角膜新生血管也減少，表明miR-155參與基質(zhì)性角膜炎的病理過程[20]?，F(xiàn)已證實，一些促炎癥相關(guān)的miRs，如miR-155、miR-132、miR-223等也參與基質(zhì)性角膜炎的病理過程，且與角膜新生血管形成有關(guān)[21]。

真菌性角膜炎是常見的角膜感染類型，角膜潰瘍發(fā)生過程中往往伴有嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，糖皮質(zhì)激素雖然能很好地抑制炎癥反應(yīng)，但是會加重真菌感染，與正常角膜相比，真菌感染的角膜中miR-204、miR-184、miR-511-5p、miR-142-3p、miR-155-5p、miR-451a等表達明顯下降，其中miR-451a可通過靶向調(diào)控巨噬細胞遷移抑制因子而影響細胞凋亡、炎癥、細胞增殖及損傷修復(fù)[22]。

在角膜新生血管的形成過程中，角膜新生淋巴管經(jīng)常與新生血管同時出現(xiàn)，尤其在角膜移植后排斥反應(yīng)中[23]。Grimaldo等[24]對miR-184與角膜淋巴管的關(guān)系進行了研究，發(fā)現(xiàn)角膜炎癥性淋巴管中miR-184表達降低，提示miR-184可能作為天然的角膜淋巴管抑制劑而發(fā)揮作用；通過結(jié)膜下注射miR-184模擬物增強其表達后，淋巴管的侵襲面積明顯減少；進一步以miR-184模擬物轉(zhuǎn)染人淋巴管內(nèi)皮細胞后，細胞的遷移、成管性都明顯下降；因此證實miR-184與角膜淋巴管密切相關(guān)。由于角膜中淋巴管增多引起巨噬細胞浸潤，巨噬細胞作為血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的重要來源[25-26]，容易誘發(fā)新生血管形成，因此抑制角膜淋巴管也有助于減輕角膜新生血管[27]。

角膜受到病毒感染、真菌感染、化學(xué)傷等損傷后，往往伴有明顯的炎癥因子和免疫細胞浸潤，同時多種miRs的表達發(fā)生變化，在某些有糖皮質(zhì)激素使用禁忌的角膜炎癥中，外源性改變miRs的表達可靶向調(diào)控參與炎癥反應(yīng)、免疫細胞分化、宿主免疫過程的細胞因子和蛋白質(zhì)表達，抑制角膜炎癥反應(yīng)，阻止角膜新生血管的發(fā)生[22]。

3 miRs參與調(diào)控促血管生成因子的表達

生理情況下，促血管生成因素和抑制血管生成因素保持平衡，使角膜透明、無血管化。常見的促血管生成介質(zhì)有VEGF、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)等，其中VEGF-A是最重要的促血管生成因子，其與VEGFR1/R2結(jié)合后發(fā)揮促血管形成作用。角膜上皮細胞、基質(zhì)細胞和內(nèi)皮細胞均可產(chǎn)生VEGF，當(dāng)角膜發(fā)生新生血管、炎癥和瘢痕時，VEGF表達上調(diào)。近年研究發(fā)現(xiàn)某些miRs可通過調(diào)控VEGF的表達參與角膜新生血管形成。

miR-21是let-7家族的成員之一，在內(nèi)皮細胞中高表達。年輕人內(nèi)皮祖細胞中miR-21和miR-10A高表達，兩者抑制高遷移率族蛋白A2(Hmga2)表達，引起內(nèi)皮祖細胞衰老，而且內(nèi)皮祖細胞的血管生成能力也降低；而老年人內(nèi)皮祖細胞miR-21和miR-10A表達低，Hmga2水平升高，使內(nèi)皮祖細胞更富活力，細胞的血管形成能力提高[28]。人支氣管上皮細胞經(jīng)過亞砷酸鹽處理后miR-21表達升高，引起VEGF高表達，最終促進新生血管形成[29]。與之不同的是，在角膜新生血管的發(fā)生過程中，miR-21能抑制VEGF的表達，發(fā)揮抑制新生血管的作用。研究發(fā)現(xiàn)，堿燒傷后角膜新生血管開始生長的同時，miR-21、VEGF-A和缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)明顯增高，miR-21抑制劑能完全抑制p-ERK活性，消除HIF-1α聚集，降低VEGF-A表達，抑制角膜新生血管的面積和血管數(shù)量[30]。

由于VEGF可促使miR-296表達，后者靶向肝細胞生長因子調(diào)節(jié)的酪氨酸激酶底物(hepatocyte growth factor-regulated tyrosine kinase substrate，HGS)，使VEGFR2和血小板源性生長因子β(PDGF-β)受體水平升高，提高其對VEGF的反應(yīng)性。將人原代腦微血管內(nèi)皮細胞與神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞共培養(yǎng)或用血管生長因子刺激，在促進細胞成管的同時，miR-296表達水平升高，故抑制miR-296的表達能抑制血管生成，高表達則起相反的作用[31]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-296不僅調(diào)控腫瘤新生血管生長，也參與角膜新生血管的形成。小鼠堿燒傷誘導(dǎo)角膜新生血管模型中，局部進行左氧氟沙星加FK506或左氧氟沙星加地塞米松處理對角膜新生血管均有明顯的抑制作用，而且miR-296表達明顯下降的同時，伴有FGF23蛋白水平降低，說明miR-296是調(diào)控角膜新生血管形成的重要因素[32]。

在經(jīng)典的縫線誘導(dǎo)角膜新生血管模型中，縫線周圍角膜水腫、炎癥細胞浸潤，引起VEGF高表達，miR-184能降低VEGF和β-catenin表達水平，抑制人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(HUVEC)和人角膜上皮細胞的增殖、遷移以及抑制RF/6A細胞的成管性能，因而高表達miR-184使角膜新生血管面積減少[33]。PDGF-β、FOG2(friend of Gata 2)和磷脂酸磷酸酶2b(PPAP2B)都是促血管生成因子，F(xiàn)OG2調(diào)節(jié)VEGF表達，而PDGF-β調(diào)節(jié)Akt活性。miR-184直接靶向抑制FOG2、PDGF-β及PPAP2B，通過降低VEGF表達和抑制Akt信號通路而發(fā)揮抑制角膜新生血管的作用。miR-184高表達能抑制細胞MMP2表達水平，敲除miR-184使MMP2水平升高。由于MMP2是Akt信號通路的下游因子，并由Akt直接調(diào)控，故認為miR-184具有抑制促進血管生成因子Akt活性的作用[9]。

在堿燒傷以及縫線誘導(dǎo)小鼠角膜新生血管模型中，miR-204表達下降，隨著角膜新生血管的消退，miR-204表達又有回升，通過角膜基質(zhì)注射或結(jié)膜下注射方法增強miR-204的作用后，角膜VEGF-A和血管生成素1表達明顯降低，因此新生血管明顯減少[10，34]。

目前治療角膜新生血管的藥物和方法較多，其中抗VEGF藥物在某些視網(wǎng)膜新生血管性疾病中取得了一定療效，有學(xué)者提出使用抗VEGF藥物治療角膜新生血管。但是，動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，貝伐單抗可損害角膜神經(jīng)，結(jié)膜下注射貝伐單抗使角膜敏感性下降、角膜損傷后修復(fù)時間延遲[35]。另外，不同類型的角膜新生血管對抗VEGF藥物的敏感性并不一致，新發(fā)生的血管存在動態(tài)的病理過程，抗VEGF藥物效果較明顯，而靜止的成熟血管對抗VEGF藥物并不敏感，而且抗VEGF藥物對深層血管的療效也不明顯[36]。越來越多的研究證實，miRs在角膜新生血管的形成中發(fā)揮重要的作用，這為尋找治療角膜新生血管的新策略提供了依據(jù)。

4 miRs在基因敲除鼠中的作用

由于KLEIP(Kelch-like Ect 2-interacting protein)對于角膜結(jié)構(gòu)和透明性非常重要，KLEIP-/-小鼠可自發(fā)角膜營養(yǎng)不良和角膜新生血管[37]。Kather等[38]研究發(fā)現(xiàn)，KLEIP-/-小鼠發(fā)生角膜營養(yǎng)不良的早期，血管和淋巴管自角膜緣發(fā)出，晚期血管長至角膜中央，多數(shù)血管位于上皮下，幾乎沒有血管位于基質(zhì)中，新生血管的生長方向提示在角膜上皮中存在引導(dǎo)血管生長的因素。在KLEIP-/-小鼠角膜營養(yǎng)不良晚期，經(jīng)典的血管生長因子VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C和FGF2均無明顯上調(diào)，但是在從2期進展到3期的過程中，血管生成素-1及其受體Tie2均明顯增高。以miR-204-5p模擬物轉(zhuǎn)染血管內(nèi)皮細胞后，血管緊張素-1蛋白水平明顯下降，表明miR-204可通過調(diào)控血管緊張素-1引起KLEIP-/-小鼠角膜營養(yǎng)不良、角膜新生血管形成。

5 其它

目前治療角膜新生血管的藥物較多，部分藥物可通過調(diào)控某些miRs表達發(fā)揮抑制角膜新生血管的作用。姜黃素對大鼠堿燒傷角膜新生血管具有抑制作用[39]，進一步研究發(fā)現(xiàn)姜黃素引起HUVEC細胞高表達miR-1275和miR-1246，外源性改變miR-1275和miR-1246的表達，可引起與新生血管相關(guān)的VEGF-B和NF-κB表達變化[40]。舒尼替丁和貝伐單抗是常用的抗VEGF藥物，分別局部使用舒尼替丁和貝伐單抗治療大鼠角膜新生血管后，VEGF-A和VEGFR2降低，同時miR-15b、miR-16、miR-126表達降低，而miR-210表達增高，提示舒尼替丁和貝伐單抗可能通過調(diào)控miRs的表達發(fā)揮抑制新生血管的作用[41]。

6 miRs在角膜新生血管中的研究前景

角膜內(nèi)源性miRs在維持角膜無血管化中發(fā)揮極其重要的作用，但由于角膜新生血管形成過程復(fù)雜，尚需更多研究證實miRs的調(diào)控作用。miRs之間能相互影響，一種miR可通過調(diào)節(jié)另一種miR的表達而發(fā)揮作用[42]，目前以單一miR在角膜新生血管中的研究居多，在角膜新生血管形成過程中，多個miRs之間是否有協(xié)同作用仍有待于進一步研究。此外，角膜miRs模擬物和拮抗劑能靶向增強或抑制miRs的作用，有望成為治療角膜新生血管性疾病的新方法。