外泌體miRNA在卵巢癌中的研究進(jìn)展

張莉，袁夢(mèng)琴，王艷清，劉詩(shī)意，楊瀟，程艷香

卵巢癌（ovarian cancer，OC）是婦科腫瘤中致死率最高的一種惡性腫瘤，由于其解剖位置較深，早期無(wú)典型的臨床表現(xiàn)，大多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已屬晚期[國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO）分期Ⅲ～Ⅳ]，并常伴盆腹腔甚至遠(yuǎn)處器官的轉(zhuǎn)移。OC的治療多選擇腫瘤切除術(shù)并輔以順鉑為基礎(chǔ)的化療，80%患者首次化療反應(yīng)良好，但常于6~12個(gè)月內(nèi)復(fù)發(fā)，導(dǎo)致患者因化療耐藥而死亡。雖然近年來(lái)關(guān)于OC的研究越來(lái)越多，但患者的5年生存率沒(méi)有明顯改善，仍為30%左右[1]。因此，尋找有效的早期診斷標(biāo)志物和合適的治療靶點(diǎn)是當(dāng)前亟需解決的問(wèn)題。

外泌體（exosome）為直徑 30～150 nm 的微泡[2]，富含脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、RNA和DNA，這些物質(zhì)源于原始細(xì)胞，但表達(dá)水平可能與其來(lái)源細(xì)胞有所不同，表明外泌體在不同狀態(tài)下可能具有不同的功能[3]。各種細(xì)胞均可分泌外泌體，并通過(guò)與細(xì)胞膜融合將內(nèi)容物釋放到細(xì)胞外環(huán)境中，介導(dǎo)相鄰或遠(yuǎn)處細(xì)胞之間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[4-5]。目前在大多數(shù)體液中發(fā)現(xiàn)了外泌體，表明其在體內(nèi)可以循環(huán)。外泌體參與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，多項(xiàng)研究報(bào)道癌細(xì)胞比正常細(xì)胞分泌更多的外泌體，可調(diào)節(jié)與腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為（如增殖[6]、轉(zhuǎn)移[7-8]、耐藥[9]和免疫[10]等）相關(guān)的廣泛生物學(xué)過(guò)程，其中微小RNA（microRNA，miRNA）扮演了重要角色。研究表明miRNA在腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞來(lái)源的外泌體中也存在差異性，提示外泌體miRNA（exomiRNA）參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。目前與OC相關(guān)的exo-miRNA備受關(guān)注，現(xiàn)對(duì)其研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 外泌體簡(jiǎn)介

外泌體在1983年被發(fā)現(xiàn)[11]，1987年由Johnstone等首次命名為“exosome”，具有經(jīng)典的“杯”或“碟形”形態(tài)[12]。最初學(xué)者們認(rèn)為外泌體是細(xì)胞丟棄細(xì)胞內(nèi)廢物的方式，但是目前已有大量研究表明外泌體可以介導(dǎo)細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)。此外，外泌體在腫瘤患者的血液、尿液、腹水等體液中富集，在腫瘤診斷、療效監(jiān)測(cè)等方面具有易于獲得、簡(jiǎn)便快捷等優(yōu)點(diǎn)。隨著外泌體分離提取方式的改進(jìn)與創(chuàng)新，對(duì)外泌體的研究日趨增加。

2 exo-miRNA在OC中的作用

外泌體通過(guò)將原始細(xì)胞內(nèi)的miRNA傳遞到受體細(xì)胞中，影響腫瘤及腫瘤微環(huán)境中基質(zhì)細(xì)胞的生物學(xué)行為，從而影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。關(guān)于exo-miRNA在OC中的研究涵蓋了多個(gè)方面。

2.1 exo-miRNA參與OC的早期診斷 目前多采用盆腔檢查、經(jīng)陰道超聲和血清腫瘤標(biāo)志物糖類(lèi)抗原 125（CA125）和人附睪蛋白 4（HE4）水平的監(jiān)測(cè)判斷OC是否發(fā)生或復(fù)發(fā)。但CA125僅在50%早期OC患者中升高，在70%~90%晚期患者中升高[13]；HE4對(duì)OC的診斷也具有限制性，因?yàn)槠湓谠l(fā)性輸卵管癌等多發(fā)性腹部腫瘤中的表達(dá)也升高[14]。因此，亟需新的診斷標(biāo)志物。由于miRNA表達(dá)紊亂是腫瘤發(fā)生的早期事件，miRNA在外泌體中是高度穩(wěn)定的，不受RNase的影響[15]，因此exo-miRNA可作為許多惡性腫瘤的生物學(xué)標(biāo)志物。

Zhou等[16]收集了39例卵巢漿液性腺癌患者、26例良性婦科疾病患者和30例健康對(duì)照者的尿液樣本，通過(guò)miRNA微陣列分析發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照者相比，卵巢漿液性腺癌患者的尿液中只有miR-30a-5p上調(diào)，并且尿miR-30a-5p的上調(diào)與早期卵巢漿液性腺癌以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。此外，當(dāng)手術(shù)切除腫瘤組織時(shí)，來(lái)自O(shè)C患者的尿miR-30a-5p明顯減少，提示尿miR-30a-5p可反映腫瘤負(fù)荷。該研究同時(shí)檢測(cè)到胃癌和結(jié)腸癌患者尿液中miR-30a-5p的表達(dá)水平較低，提示尿miR-30a-5p的上調(diào)可能對(duì)卵巢漿液性腺癌的診斷具有特異性。miR-30a-5p在來(lái)自O(shè)C細(xì)胞上清液的外泌體中也富集，支持exomiR-30a-5p排泄到尿液中的途徑。

Su等[17]發(fā)現(xiàn)miR-1307和miR-375穩(wěn)定存在于OC患者的血清外泌體中，與卵巢良性腫瘤和健康對(duì)照組相比，兩者表達(dá)均顯著上調(diào)。當(dāng)miR-1307、miR-375與CA-125和HE4聯(lián)合時(shí)具有更高的診斷能力，可成為區(qū)分良性與惡性的標(biāo)志物。此外，miR-1307和miR-375還分別與腫瘤分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移正相關(guān)。

Li等[18]從10例腹腔轉(zhuǎn)移的OC患者和良性疾病對(duì)照組中分離出腹膜液中的外泌體，通過(guò)新一代測(cè)序法以尋找表達(dá)差異的miRNA，并通過(guò)GO和KEGG通路富集分析進(jìn)行差異miRNA的靶基因分類(lèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-149-3p和miR-222-5p表達(dá)上調(diào)，通過(guò)Kaplan-Meier法分析發(fā)現(xiàn)兩者與患者5年生存率和總生存率呈正相關(guān)，表明miR-149-3p和miR-222-5p可能是評(píng)估OC患者預(yù)后的新型生物學(xué)標(biāo)志物。

Hang等[19]通過(guò)分析13種OC細(xì)胞系和3株正常細(xì)胞系及其上清液中外泌體的miRNA表達(dá)差異發(fā)現(xiàn)，OC細(xì)胞系與OC細(xì)胞來(lái)源的外泌體共享16種上調(diào)和6種下調(diào)的miRNA。在這些差異性miRNA中，hsa-miR-145-5p在OC中表達(dá)降低，其低表達(dá)與預(yù)后不良和分期較高顯著相關(guān)。在OC及其外泌體中hsa-miR-145的表達(dá)降低可能是診斷和治療OC的關(guān)鍵生物學(xué)標(biāo)志物。Kobayashi等[20]發(fā)現(xiàn)與健康對(duì)照組相比，OC患者血清中miR-1290顯著過(guò)表達(dá)，并且在OC晚期miR-1290的表達(dá)高于早期。此外，術(shù)后miR-1290表達(dá)顯著下降，提示miR-1290可反映腫瘤負(fù)荷。該研究還發(fā)現(xiàn)，與非上皮性O(shè)C相比，miR-1290在上皮性O(shè)C中高表達(dá)，提示其與組織類(lèi)型有關(guān)。受試者工作特征曲線（ROC曲線）分析顯示，miR-1290與CA125的特異度和敏感度沒(méi)有顯著差異。因此，exo-miR-1290可作為一種新的潛在的診斷OC的生物學(xué)標(biāo)志物。

2.2 exo-miRNA參與免疫 腫瘤免疫微環(huán)境對(duì)于OC的進(jìn)展是至關(guān)重要的，主要是由腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated macrophages,TAMs）和T細(xì)胞如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）和T輔助細(xì)胞17（Th17）組成，TAMs占多數(shù)，并在腫瘤生長(zhǎng)、侵襲、血管生成和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[21]。通常，TAMs被認(rèn)為是M2型巨噬細(xì)胞，具有抗炎和原始腫瘤表型，在重塑腫瘤免疫微環(huán)境中發(fā)揮重要作用[22]。

Zhou等[23]和Wang等[24]研究發(fā)現(xiàn)OC患者的腹膜中含有豐富的免疫細(xì)胞，TAMs約占70%，T細(xì)胞約25%，其中Treg/Th17比值在OC原位和轉(zhuǎn)移性腹膜組織中顯著高于良性卵巢腫瘤和良性腹膜，而且Treg/Th17比值與組織學(xué)分級(jí)相關(guān)，是OC患者總體生存率的獨(dú)立預(yù)后因素。通過(guò)進(jìn)行TAMs來(lái)源外泌體的miRNA微陣列分析發(fā)現(xiàn)，miR-29a-3p和miR-21-5p在外泌體中富集。將M2型巨噬細(xì)胞來(lái)源的外泌體與CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)，Treg/Th17比值增加，并且miR-29a-3p和miR-21-5p的靶基因STAT3表達(dá)下調(diào)，兩者對(duì)STAT3具有協(xié)同抑制作用。STAT3參與CD4+T細(xì)胞向Treg或Th17細(xì)胞的分化，并促進(jìn)白細(xì)胞介素 10（IL-10）的表達(dá)，降低 IL-4、IL-6 和腫瘤壞死因子α（TNF-α）的表達(dá)水平[25]。這表明miR-29a-3p和miR-21-5p可能共同引起OC免疫微環(huán)境的不平衡，最終導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展。

Wu等[26]從OC患者腹水中分離TAMs并培養(yǎng)，隨后從TAMs上清液中提取外泌體，與人臍靜脈內(nèi)皮 細(xì) 胞 （human umbilical vein endothelial cell，HUVECs）共培養(yǎng)，可明顯抑制HUVECs遷移，并且miR-146b-5p在HUVECs中表達(dá)升高。此外，TAMs來(lái)源的外泌體和SKOV3來(lái)源的外泌體聯(lián)合刺激HUVECs，并克服了由TAMs來(lái)源的外泌體引起的內(nèi)皮細(xì)胞遷移的抑制。提示TAMs來(lái)源的外泌體在OC的血管生成中具有抑制作用，但可被OC細(xì)胞來(lái)源的外泌體抵消。

Hu等[27]觀察到TNF超家族的成員之一——TNF樣弱凋亡誘導(dǎo)因子（tumor necrosis factor like weak inducer of apoptosis,TWEAK）刺激巨噬細(xì)胞分泌的外泌體可被OC細(xì)胞內(nèi)吞并抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)移。通過(guò)miRNA微陣列分析，共發(fā)現(xiàn)有19種miRNA在用或不用TWEAK處理的巨噬細(xì)胞來(lái)源的外泌體中差異表達(dá)。TWEAK不僅使巨噬細(xì)胞及其分泌的外泌體中miR-7的水平升高，還導(dǎo)致受體OC細(xì)胞中miR-7水平升高，降低細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力。向TAMs中預(yù)先轉(zhuǎn)染antagomiR-7可顯著降低巨噬細(xì)胞及其分泌的外泌體以及受體細(xì)胞中miR-7的水平，同時(shí)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)。表明TAMs來(lái)源的exo-miR-7參與調(diào)節(jié)OC細(xì)胞轉(zhuǎn)移。

Zhu等[28]發(fā)現(xiàn)缺氧OC細(xì)胞募集巨噬細(xì)胞，并誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞成為T(mén)AM；反之，缺氧巨噬細(xì)胞來(lái)源的外泌體可促進(jìn)OC細(xì)胞的惡性表型，miR-223在缺氧巨噬細(xì)胞來(lái)源的外泌體中富集，可轉(zhuǎn)移至共培養(yǎng)的OC細(xì)胞，增強(qiáng)癌細(xì)胞的耐藥性。并且與低表達(dá)缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）的OC患者相比，高表達(dá)HIF-1α患者具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上更高的CD163+細(xì)胞浸潤(rùn)和miR-223的水平。提示exo-miR-223水平與OC的復(fù)發(fā)密切相關(guān)。Chen等[29]發(fā)現(xiàn)缺氧可誘導(dǎo)miR-940在OC細(xì)胞來(lái)源的外泌體中高表達(dá)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)化，進(jìn)一步誘導(dǎo)OC細(xì)胞增殖和遷移。

2.3 exo-miRNA參與OC細(xì)胞的耐藥 exo-miRNA可能影響癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，如Lasagna等[30]發(fā)現(xiàn)miR-501-5p在對(duì)阿霉素耐藥的胃癌細(xì)胞SGC7901/ADR來(lái)源的外泌體中富集，其可傳遞至敏感細(xì)胞SGC7901，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞耐藥?；熌退幨荗C治療的主要障礙，如何提高患者對(duì)藥物的敏感性是亟需解決的問(wèn)題。

晚期OC細(xì)胞通常擴(kuò)散到網(wǎng)膜內(nèi)臟脂肪組織。Au Yeung等[31]使用新一代測(cè)序法發(fā)現(xiàn)，從腫瘤相關(guān)脂肪細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分離的外泌體和組織裂解物中的miR-21水平顯著高于OC細(xì)胞。exo-miR-21從腫瘤相關(guān)脂肪細(xì)胞或成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)移到OC細(xì)胞，可抑制OC細(xì)胞凋亡，促進(jìn)OC細(xì)胞耐藥。因此，抑制基質(zhì)細(xì)胞miR-21的轉(zhuǎn)移可能是OC轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)治療中的一種有效方式。

Kanlikilicer等[32]發(fā)現(xiàn)miR-6126在來(lái)自化療敏感 （HeyA8，SKOV3-ip1，A2780） 和耐藥 OC 細(xì)胞（HeyA8-MDR，SKOV3-TR，A2780-CP20）的外泌體中表達(dá)均顯著升高。exo-miR-6126過(guò)表達(dá)與OC患者的生存期較長(zhǎng)和預(yù)后較好呈正相關(guān)，且miR-6126的高表達(dá)抑制OC細(xì)胞耐藥，并降低癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的能力，提示OC細(xì)胞通過(guò)外泌體將miR-6126從胞內(nèi)排出，維持細(xì)胞耐藥。此外，Kanlikilicer等[33]還發(fā)現(xiàn)miR-1246在OC細(xì)胞來(lái)源的外泌體中大量表達(dá)，miR-1246在紫杉醇耐藥性O(shè)C細(xì)胞來(lái)源的外泌體中的表達(dá)顯著高于敏感株，當(dāng)OC細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，它們能夠?qū)xo-miR-1246轉(zhuǎn)移到M2型巨噬細(xì)胞，進(jìn)而影響腫瘤免疫抑制微環(huán)境的形成，促進(jìn)OC進(jìn)展。

Weiner-Gorzel等[34]發(fā)現(xiàn) miR-433在 A2780細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，并且可誘導(dǎo)細(xì)胞衰老。進(jìn)一步在miR-433表達(dá)水平更高的PEO1和PEO4細(xì)胞中進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)在紫杉醇處理后生存的PEO1和PEO4細(xì)胞中miR-433表達(dá)水平各上調(diào)15倍和12倍，但紫杉醇處理后細(xì)胞miR-433的表達(dá)未增加，說(shuō)明miR-433在紫杉醇處理后存活的細(xì)胞中富集可能與細(xì)胞衰老有關(guān)。此外，通過(guò)將高表達(dá)miR-433的細(xì)胞來(lái)源的外泌體與A2780細(xì)胞共孵育，發(fā)現(xiàn)miR-433在A2780細(xì)胞中表達(dá)更高，并且細(xì)胞凋亡減少，對(duì)紫杉醇的耐藥性提高，提示miR-433通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞衰老效應(yīng)促進(jìn)OC細(xì)胞對(duì)紫杉醇的耐藥。

2.4 exo-miRNA參與OC增殖、凋亡和遷移 Zhang等[35]發(fā)現(xiàn)與正常卵巢組織相比，miR-124在OC組織中表達(dá)下調(diào)，并且在腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞中的表達(dá)低于正常成纖維細(xì)胞。將人卵巢表面上皮細(xì)胞來(lái)源的exo-miR-124轉(zhuǎn)移至腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞，導(dǎo)致腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞標(biāo)志物α-平滑肌肌動(dòng)蛋白和成纖維細(xì)胞活化蛋白表達(dá)降低，細(xì)胞遷移能力減弱，而OC細(xì)胞來(lái)源的外泌體轉(zhuǎn)移至正常成纖維細(xì)胞后，促進(jìn)正常成纖維細(xì)胞表現(xiàn)出腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的特征。提示miR-124可能是治療OC的新靶點(diǎn)。

Pan等[36]從106例OC患者、8例卵巢囊腺瘤患者和29例健康女性血漿中提取外泌體，隨后使用含有48種miRNA的TaqMan探針?lè)y(cè)定miRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)與健康女性相比，miR-21、miR-100、miR-200b和miR-320在OC患者中表達(dá)顯著升高，miR-16、miR-93、miR-126和 miR-223的表達(dá)顯著降低。進(jìn)一步觀察外泌體中的miR-200b和miR-320對(duì)卵巢增殖和凋亡的影響發(fā)現(xiàn)，miR-200b在SKOV3中作用不明顯，但在OVCAR3細(xì)胞中抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并且效果優(yōu)于喜樹(shù)堿；而miR-320雖然在OC細(xì)胞來(lái)源的外泌體中過(guò)表達(dá)，但對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡沒(méi)有顯著影響。此外，外泌體中miR-200b的表達(dá)水平與患者總體生存率相關(guān)。

Xu 等[37]檢測(cè)了 6 種候選 miRNA（miR-101、miR-21、miR-210、miR-30a、miR-34a 和 miR-125b）在 36例OC患者癌組織、癌旁組織以及血清外泌體中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)與癌旁組織相比，癌組織中有4種miRNA（miR-101和 miR-30a下調(diào)；miR-21和miR-210上調(diào)）表達(dá)具有差異，而在OC患者和健康對(duì)照者的血清中僅有miR-101表達(dá)水平有差異，且miR-101低表達(dá)可促進(jìn)癌細(xì)胞遷移。因此檢測(cè)血清外泌體中的miR-101含量可作為OC的潛在診斷標(biāo)志物。

Yoshimura等[38]發(fā)現(xiàn)與良性腫瘤患者與健康志愿者相比，OC患者血清miR-99a-5p水平顯著升高?；颊咝g(shù)后血清miR-99a-5p表達(dá)水平顯著降低，表明miR-99a-5p可反映腫瘤負(fù)荷。采用OC細(xì)胞來(lái)源的外泌體處理人腹膜間皮細(xì)胞（human peritoneal mesothelial cells，HPMCs）可顯著增加其 miR-99a-5p表達(dá)，反之高表達(dá)miR-99a-5p的HPMCs促進(jìn)OC侵襲。此外，ROC曲線分析顯示，miR-99a-5p和CA125的ROC曲線下面積（AUC）之間沒(méi)有顯著差異；當(dāng)CA125與miR-99a-5p組合時(shí)，作為診斷標(biāo)記物的作用顯著增強(qiáng)。

3 結(jié)語(yǔ)

目前沒(méi)有足夠精確的檢測(cè)方法用于監(jiān)測(cè)OC的發(fā)生、發(fā)展，exo-miRNA在腫瘤中穩(wěn)定存在，并且exo-miRNA特征與組織miRNA的特征具有一定的相似性，為了解OC相關(guān)機(jī)制提供了新視角，有望為OC治療和早期診斷提供新的方向，并可能成為可靠和非侵入性的替代方案，從而監(jiān)測(cè)疾病復(fù)發(fā)和個(gè)體對(duì)治療的反應(yīng)。