與早產(chǎn)臨產(chǎn)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究進(jìn)展

常穎，李雯，李?yuàn)檴?，申永梅，陳?/p>

早產(chǎn)（preterm birth）是一個(gè)全球性的健康問(wèn)題，由多種臨床亞型組成，包括自發(fā)性或醫(yī)源性早產(chǎn)。不論早產(chǎn)亞型如何，一旦早產(chǎn)臨產(chǎn)，目前并無(wú)切實(shí)有效的方法延長(zhǎng)孕周。為了制定有效的預(yù)防和治療策略，應(yīng)更深入地了解控制人類分娩時(shí)機(jī)的基因和途徑。研究證明，早產(chǎn)病理生理機(jī)制不僅復(fù)雜，而且母胎組織間需相互作用才能促進(jìn)分娩發(fā)生[1]。這些組織包括蛻膜、子宮肌層、宮頸、母體血液、胎膜（絨毛和羊膜）、臍帶和胎兒血液等。與早產(chǎn)相關(guān)的主要病因?qū)W因素包括炎癥、出血、母體或胎兒下丘腦-垂體軸激活、免疫失調(diào)、子宮肌層擴(kuò)張和宮頸機(jī)能不全[2]。所有這些病因都有不同的、獨(dú)特的分娩啟動(dòng)方式，但可能有一條共同的途徑，即以促成子宮肌層收縮、細(xì)胞外基質(zhì)成分降解、炎癥、細(xì)胞凋亡的介質(zhì)釋放為終點(diǎn)，從而促進(jìn)胎膜破裂、宮頸成熟和子宮收縮，導(dǎo)致早產(chǎn)發(fā)生。對(duì)這些組織的轉(zhuǎn)錄組研究有助于了解早產(chǎn)分子機(jī)制的發(fā)展。針對(duì)宮頸、子宮肌層和絨毛膜羊膜的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究顯示，分娩是一種生理性炎癥狀態(tài)[3]。然而，找到與早產(chǎn)有關(guān)的特定通路現(xiàn)仍是一個(gè)遙不可及的目標(biāo)。單細(xì)胞RNA測(cè)序技術(shù)（single cell RNA sequencing，ScRNA-seq）可用于推斷母胎界面上不同細(xì)胞類型之間的通訊網(wǎng)絡(luò)[4]。根據(jù)ScRNA-seq技術(shù)檢測(cè)，母體巨噬細(xì)胞和絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞是分娩過(guò)程中轉(zhuǎn)錄變化最大的細(xì)胞類型[5]。與相同胎齡非臨產(chǎn)狀態(tài)相比，早產(chǎn)臨產(chǎn)后自然殺傷（NK）細(xì)胞、活化的T細(xì)胞和成纖維細(xì)胞信號(hào)增加，表明這些免疫細(xì)胞類型在早產(chǎn)病理生理中具有重要作用[6]。

1 早產(chǎn)母胎界面上不同組織細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組研究

目前研究表明，自發(fā)性早產(chǎn)可能涉及的一種機(jī)制是孕婦先天性免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)之間相互作用的失調(diào)。妊娠期間，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞會(huì)增殖，并通過(guò)產(chǎn)生抗炎環(huán)境來(lái)防止胎兒免疫排斥。臨產(chǎn)開(kāi)始和進(jìn)展期，產(chǎn)婦的免疫系統(tǒng)通過(guò)激活促炎性核因子κB信號(hào)傳導(dǎo)途徑而轉(zhuǎn)變?yōu)榇傺谞顟B(tài)，這導(dǎo)致細(xì)胞因子、趨化因子和白細(xì)胞介素（inlerleukin，IL）的產(chǎn)生增加，并通過(guò)激活白細(xì)胞而浸潤(rùn)到母胎界面。有學(xué)者認(rèn)為，妊娠期間過(guò)早的從抗炎狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榇傺谞顟B(tài)，會(huì)破壞先天性和適應(yīng)性免疫平衡關(guān)系，導(dǎo)致早產(chǎn)臨產(chǎn)[7]。妊娠組織尤其胎盤是多種細(xì)胞類型的異質(zhì)復(fù)合物，因而若要闡明母胎界面的相互作用，需了解細(xì)胞水平的轉(zhuǎn)錄活性。研究人員用ScRNA-seq技術(shù)捕獲人類胎盤細(xì)胞亞群的表達(dá)模式[4]，包括一些胎兒細(xì)胞（如絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞和合體滋養(yǎng)層）、母體蛻膜細(xì)胞和混合來(lái)源細(xì)胞（例如T細(xì)胞）。在所有細(xì)胞類型特征中，B細(xì)胞和T細(xì)胞特征性表達(dá)隨胎齡變化最為明顯。B細(xì)胞特異性信號(hào)隨妊娠進(jìn)展呈線性下降，而T細(xì)胞特異性信號(hào)從妊娠早期到妊娠中期下降，然后在妊娠晚期增加。定量分析顯示，足月分娩時(shí)T細(xì)胞特異性基因表達(dá)增加，如顆粒酶H（granzyme H，GZMH）、顆粒溶素（granulysin，GNLY）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白2（fibroblast growth factor binding protein 2，F(xiàn)GFBP2）和顆粒酶 A（granzyme A，GZMA）基因。有較多的證據(jù)支持妊娠婦女T細(xì)胞在足月和早產(chǎn)的病理生理過(guò)程中的作用，包括以母體T細(xì)胞浸潤(rùn)到胎盤組織為特征的組織病理學(xué)病變[8]，母胎界面的細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群與足月分娩的時(shí)機(jī)和早產(chǎn)的發(fā)生有關(guān)[9]。胎兒T細(xì)胞還可以通過(guò)對(duì)母體抗原作出反應(yīng)并釋放促內(nèi)分泌性細(xì)胞因子來(lái)參與自發(fā)早產(chǎn)的機(jī)制[10]?？偟膩?lái)說(shuō)，這些研究表明T細(xì)胞與分娩的生理和病理過(guò)程有關(guān)，因而認(rèn)為T細(xì)胞信號(hào)可作為分娩開(kāi)始的標(biāo)志[11]。

胎齡決定了早產(chǎn)的多種病理機(jī)制。遺傳背景可能在小于28周前的早產(chǎn)新生兒中起更重要的作用。這些早產(chǎn)可能具有獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄組模式，涉及幾種通路和基因在病理狀態(tài)下被打開(kāi)或關(guān)閉。根據(jù)目前的研究顯示，導(dǎo)致分娩的共同途徑主要與母胎界面（主要指絨毛膜、羊膜和蛻膜）發(fā)生的免疫過(guò)程調(diào)節(jié)有關(guān)。母胎界面趨化因子的下調(diào)可以防止免疫細(xì)胞大量涌入從而維持妊娠[12]，而消除這種下調(diào)狀態(tài)可導(dǎo)致臨產(chǎn)分娩。就早產(chǎn)而言，多種途徑激活免疫系統(tǒng)消除了這種下調(diào)，表明早產(chǎn)基因表達(dá)模式與免疫排斥有關(guān)。Pereyra等[13]使用RNA測(cè)序（RNA sequencing，RNA-seq）分析了早產(chǎn)（小于33周）和足月產(chǎn)胎兒的絨毛膜轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)與足月產(chǎn)相比，早產(chǎn)病例中有18個(gè)基因下調(diào)。這些基因潛在地代表早產(chǎn)轉(zhuǎn)錄組模式，因此是了解早產(chǎn)綜合征的候選基因。這18個(gè)下調(diào)基因中，包括胎盤基因胎盤堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALPP）和妊娠相關(guān)血漿蛋白（pregnancyassociated plasma protein A，PAPPA 或 Pappalysin）。與另一項(xiàng)研究結(jié)果類似[14]。另外兩個(gè)多能性調(diào)節(jié)干細(xì)胞信號(hào)途徑的基因——Wnt家族成員1（WNT1）和遠(yuǎn)端無(wú)同源異型盒5（distal-less homeobox 5，DLX5）基因?qū)儆谕痪┒蓟蚝突蚪M百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）途徑。WNT信號(hào)[15]或核因子κB信號(hào)[16]通路受抑制可能導(dǎo)致滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖及侵襲減少，從而導(dǎo)致流產(chǎn)和PTB。DLX5調(diào)節(jié)胚胎和胎盤發(fā)育[17]，在人類胎盤中廣泛表達(dá)。早產(chǎn)胎膜組織的WNT1和DLX5表達(dá)低于足月產(chǎn)胎膜。因此推測(cè)這些下調(diào)的基因可能是決定妊娠終止時(shí)機(jī)的成熟基因。

上調(diào)基因主要與免疫反應(yīng)有關(guān)。與足月分娩相比，早產(chǎn)可以顯著富集免疫過(guò)程。最近研究表明，IL-1β可能通過(guò)激活炎性小體而參與了臨產(chǎn)[18]。極早產(chǎn)時(shí)IL-1β上調(diào)。如果炎癥小體激活導(dǎo)致早產(chǎn)的假說(shuō)是正確的，則可能具有醫(yī)學(xué)意義，即炎癥小體成分可以作為藥物靶標(biāo)，在完全免疫反應(yīng)開(kāi)始之前使用可能會(huì)終止PTB。其他與早產(chǎn)相關(guān)的差異基因還包括CXC型趨化因子配體（CXC motifchemokine ligand，CXCL）。CXCL10與母體抗胎兒排斥反應(yīng)有關(guān)。在這種情況下，早產(chǎn)中CXCL10的過(guò)度表達(dá)可能會(huì)觸發(fā)胎兒的炎癥反應(yīng)，從而導(dǎo)致早產(chǎn)[8]。CXCR3受體是跨膜G蛋白偶聯(lián)受體，屬于CXC趨化因子家族。在活化的T細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞和NK細(xì)胞上表達(dá)。CXCR3及其配體CXCL10途徑調(diào)節(jié)母體免疫細(xì)胞向母胎界面浸潤(rùn)，參與妊娠期間的母胎免疫耐受。該途徑受到破壞則可能導(dǎo)致早產(chǎn)發(fā)生[8]。

然而，人體早產(chǎn)轉(zhuǎn)錄組研究的一個(gè)主要問(wèn)題是無(wú)法收集相同胎齡的健康對(duì)照組織。之前的研究均使用健康足月組織作為病理性早產(chǎn)組織的對(duì)照，但這樣觀察到的差異基因?qū)嶋H上還包括與胎齡相關(guān)的基因，因此導(dǎo)致下游數(shù)據(jù)分析復(fù)雜化。一種潛在的解決方案是使用與人類密切相關(guān)的物種做對(duì)照。Eidem等[19]用此種方法比較了自發(fā)性早產(chǎn)的人類胎盤組織及與之相匹配胎齡的獼猴胎盤組織，確定了29個(gè)自發(fā)性早產(chǎn)特異性候選基因以及37個(gè)胎齡特異性基因。研究人員對(duì)這些候選基因的相對(duì)表達(dá)與人類蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（Protein Altas）進(jìn)行比較，以評(píng)估轉(zhuǎn)錄譜表達(dá)。盡管這些候選基因與公開(kāi)發(fā)表在Protein Altas數(shù)據(jù)庫(kù)中的表達(dá)水平相當(dāng)，但仍有一些差異。如人HtrA絲氨酸肽酶4（Human HtrA Serine Peptidase，HTRA4）自發(fā)性早產(chǎn)轉(zhuǎn)錄組中高表達(dá)，而在足月分娩時(shí)低表達(dá)。但由于獼猴與人之間在妊娠時(shí)長(zhǎng)和發(fā)育時(shí)間有所不同，跨物種的轉(zhuǎn)錄組的比較仍需更詳細(xì)的分類以及消除“遺傳背景的影響”。

2 子宮肌層轉(zhuǎn)錄組研究與早產(chǎn)臨產(chǎn)

在人類妊娠的整個(gè)過(guò)程中，子宮肌層必須適應(yīng)胎兒胎盤生長(zhǎng)所需的肌壁擴(kuò)張，同時(shí)保持功能性靜止。分娩時(shí)則需要?jiǎng)×叶鴧f(xié)調(diào)的子宮收縮，最終胎兒娩出。這個(gè)過(guò)程的轉(zhuǎn)變需要對(duì)影響子宮肌層結(jié)構(gòu)、收縮性和信號(hào)傳導(dǎo)的編碼基因進(jìn)行高度復(fù)雜的調(diào)控[20]。

在過(guò)去的20年中，多項(xiàng)研究發(fā)表了臨產(chǎn)和非臨產(chǎn)狀態(tài)下子宮肌層之間的轉(zhuǎn)錄差異。從早期的微陣列研究到后來(lái)的RNA-seq，研究數(shù)據(jù)顯示臨產(chǎn)與炎癥信號(hào)有關(guān)，包括與細(xì)胞因子、趨化因子和免疫反應(yīng)有關(guān)的基因/通路。盡管這些研究提供了可比較的子宮肌層轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，但仍未能鑒定出可重復(fù)、可靠的有關(guān)人類分娩的轉(zhuǎn)錄標(biāo)志和信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，且缺乏對(duì)數(shù)據(jù)之間變異性和一致性的比較?；谶@些原因，Stanfield等[3]利用了3個(gè)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)并使用2種機(jī)器學(xué)習(xí)算法來(lái)預(yù)測(cè)分娩，發(fā)現(xiàn)在子宮肌層中存在強(qiáng)大的分娩轉(zhuǎn)錄標(biāo)志。在信號(hào)通路水平上也觀察到了這種標(biāo)志，其中與臨產(chǎn)有關(guān)的通路包括經(jīng)由核因子κB、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白1(mammalian target of rampamycin complex 1，MTORC1） 和腫瘤壞死因子 α（tumor necrosis factor α，TNF-α）信號(hào)等。分娩過(guò)程中宮頸、胎膜和子宮肌層的TNF-α表達(dá)增加，刺激花生四烯酸釋放，激活磷脂代謝及子宮肌層中產(chǎn)生前列腺素。Ackerman等[20]通過(guò)整合微小RNA（miRNA）和mRNA轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)信息，發(fā)現(xiàn)肌細(xì)胞增強(qiáng)因子 2（myocyte enhancer factor 2，MEF2）家族的 2 個(gè)同工型MEF2A和MEF2C可能在整個(gè)妊娠過(guò)程中都有助于維持子宮肌層處于靜止?fàn)顟B(tài)。此外，有證據(jù)表明MEF2C可以抑制炎癥并降低內(nèi)皮細(xì)胞中核因子κB的活性[21]。鑒于核因子κB是子宮肌層臨產(chǎn)相關(guān)的主要炎性調(diào)節(jié)因子，MEF2轉(zhuǎn)錄因子也可能通過(guò)對(duì)抗促炎信號(hào)而促進(jìn)子宮靜止。以上子宮肌層轉(zhuǎn)錄組研究表明，自發(fā)性早產(chǎn)具有足月臨產(chǎn)時(shí)的許多共同特征，可能從孕中期開(kāi)始共享同一機(jī)制[20]。雖然自發(fā)性早產(chǎn)和足月臨產(chǎn)的啟動(dòng)基因不同，但最終合并為人類臨產(chǎn)子宮肌層的共同效應(yīng)途徑。

雙胎比單胎早產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)更高。在對(duì)比單胎早產(chǎn)和雙胎早產(chǎn)的子宮肌層轉(zhuǎn)錄組時(shí)發(fā)現(xiàn)，盡管誘發(fā)雙胎早產(chǎn)的因素與單胎可能不同，感染或?qū)m頸短可能在雙胎孕婦中更常見(jiàn)，其他因素如子宮（過(guò)度）擴(kuò)張、過(guò)早激活收縮通路、內(nèi)分泌差異等也可能更為顯著，但針對(duì)單胎妊娠和雙胎妊娠子宮肌層轉(zhuǎn)錄組分析研究表明，與分娩啟動(dòng)相關(guān)的關(guān)鍵炎癥介質(zhì)，如環(huán)氧合酶 2（cyclooxygenase 2，COX-2）、催產(chǎn)素受體（oxytocin receptor，OTR）、促炎因子IL-8以及從子宮內(nèi)膜中釋放的細(xì)胞因子等，在雙胎與單胎間幾乎沒(méi)有差異，至少在控制妊娠時(shí)長(zhǎng)方面沒(méi)有差異[22]。但此項(xiàng)研究存在局限性，如這些子宮肌層組織均在未臨產(chǎn)時(shí)選擇性剖宮產(chǎn)過(guò)程中獲得，與真正臨產(chǎn)時(shí)的轉(zhuǎn)錄變化可能有差別。另外，早產(chǎn)往往存在影響母嬰健康的因素，可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄組學(xué)的結(jié)果不同。對(duì)嚙齒類動(dòng)物子宮肌層組織分析中也發(fā)現(xiàn)，早產(chǎn)發(fā)生時(shí)炎癥性基因上調(diào)，包括 TNF-α、IL-1B、IL-6、15-羥前列腺素脫氫酶和COX-2等，IL-1B和TNF-α誘導(dǎo)COX-2合成前列腺素，導(dǎo)致肌肉收縮[23]。

綜上所述，早產(chǎn)臨產(chǎn)時(shí)轉(zhuǎn)錄組學(xué)變化也體現(xiàn)出促炎因子的過(guò)早激活。但由于缺乏足夠有效的與胎齡相匹配的早產(chǎn)子宮肌層組織，因而早產(chǎn)臨產(chǎn)時(shí)子宮肌層轉(zhuǎn)錄組學(xué)變化是否與足月時(shí)相同，還需進(jìn)一步研究。

3 與早產(chǎn)有關(guān)的母體外周血轉(zhuǎn)錄組研究

在過(guò)去的10年中，尋找非侵入性方法替代標(biāo)準(zhǔn)組織活檢引起了學(xué)者們的極大關(guān)注。細(xì)胞游離DNA（cell free DNA，cfDNA）技術(shù)的進(jìn)展為臨床應(yīng)用鋪平了道路。然而，cfDNA分析在很大程度上依賴于突變、多態(tài)性或結(jié)構(gòu)變異，在與遺傳差異無(wú)關(guān)的疾病和生理場(chǎng)景中影響了其使用。相比之下，細(xì)胞游離RNA（cell free RNA，cfRNA）轉(zhuǎn)錄組可直接獲取遺傳信息，并反映所來(lái)源組織的生理學(xué)信息。cfRNA反映與細(xì)胞活動(dòng)相關(guān)的隨時(shí)間的動(dòng)態(tài)功能變化[24]。與其他非侵入性生物標(biāo)志物相比，cfRNA表達(dá)譜可以提供更豐富的分子內(nèi)容。已有研究顯示cfRNA可以反映胎兒生長(zhǎng)發(fā)育、預(yù)測(cè)早產(chǎn)等[25]。

由于與早產(chǎn)有關(guān)的胎盤RNA和與妊娠有關(guān)的miRNA轉(zhuǎn)錄本通常會(huì)釋放到血液循環(huán)中，因而有研究檢測(cè)到早產(chǎn)患者外周血中最穩(wěn)定的458個(gè)外顯子（395個(gè)基因）。這395個(gè)基因中，有12個(gè)通路過(guò)度表達(dá)[26]，包括B細(xì)胞活化、T細(xì)胞活化、趨化因子和細(xì)胞因子介導(dǎo)的炎癥通路、胎兒生長(zhǎng)因子（fetal growth factor，F(xiàn)GF）和內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（epidemal growth factor，EGF）受體信號(hào)傳導(dǎo)通路以及整合素通路。FGF家族成員在胚胎發(fā)育的最早階段和器官發(fā)生期間起作用，以維持祖細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、存活。EGF受體信號(hào)傳導(dǎo)途徑是調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)、存活、增殖和分化的最重要途徑之一。整合素蛋白在細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)和細(xì)胞外基質(zhì)之間提供聯(lián)系，并參與各種信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程以促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。因此，以上通路過(guò)度表達(dá)表明妊娠和早產(chǎn)分別與免疫調(diào)節(jié)及炎癥有關(guān)。Gomez-Lopez等[27]對(duì)49例孕婦自妊娠8周開(kāi)始采集外周血，整個(gè)孕期約采集4～6次血樣，對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組動(dòng)力學(xué)及其與血漿蛋白組的相關(guān)性進(jìn)行了系統(tǒng)生物學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)在正常妊娠過(guò)程中，14號(hào)染色體是轉(zhuǎn)錄本差異表達(dá)最豐富的；與宿主免疫應(yīng)答相關(guān)的基因，如基質(zhì)金屬蛋白酶8（matrix metalloproteinase 8，MMP8）、防御素 A1B（defensin Alpha 1B，DEFA1B）、DEFA4、乳鐵蛋白（lactotransferrin，LTF），在妊娠 10～40周時(shí)表達(dá)穩(wěn)定增加；妊娠期T細(xì)胞、B細(xì)胞、紅細(xì)胞的mRNA信號(hào)表達(dá)呈獨(dú)特的模式，表明正常妊娠是免疫生物學(xué)過(guò)程。另一項(xiàng)研究招募了31例妊娠婦女每周檢測(cè)外周血直至分娩，共521個(gè)樣本，通過(guò)建立隨機(jī)forest模型鑒定出7個(gè)胎盤特定cfRNA與早產(chǎn)有關(guān)，分別是 CLCN3、DAPP1、PPBP、MAP3K7CL、MOB1B、RAB27B和RGS18。與宮頸長(zhǎng)度測(cè)量和胎兒纖維連接蛋白的預(yù)測(cè)價(jià)值相比，cfRNA預(yù)測(cè)早產(chǎn)的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值可達(dá)到80%[14]。因而研究者認(rèn)為，與胎盤基因相關(guān)的外周血cfRNA可能對(duì)胎兒生長(zhǎng)發(fā)育和胎齡提供較好的評(píng)估手段。

4 結(jié)語(yǔ)與展望

早產(chǎn)是全球新生兒死亡的主要原因。迄今為止，仍沒(méi)有找到有效的預(yù)測(cè)方法。使用RNA-seq分析方法可以鑒定既往報(bào)道的基因和通路以及篩選新的候選基因。母胎轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的薈萃分析表明，自發(fā)性早產(chǎn)可能涉及到妊娠婦女先天性免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)之間相互作用的失調(diào)[7]。但目前所分析的數(shù)據(jù)還存在局限性。未來(lái)依靠系統(tǒng)生物學(xué)分析，可開(kāi)發(fā)和完善妊娠基因表達(dá)譜模型，以識(shí)別早產(chǎn)和足月分娩的分子過(guò)程。對(duì)母體外周血進(jìn)行組學(xué)研究，以期實(shí)現(xiàn)早產(chǎn)等母胎并發(fā)癥的早期預(yù)測(cè)。總之，隨著系統(tǒng)生物學(xué)的發(fā)展，可以優(yōu)化選擇更接近疾病過(guò)程的生物樣本進(jìn)行早產(chǎn)機(jī)制研究及預(yù)測(cè)。