黃芩苷通過調(diào)控TGF-β1/TAK-NF-κB通路對(duì)胰腺纖維化的防治作用*

范建偉， 許小凡， 辛嘉萁， 段麗芳， 熊慧敏， 姜盛楠， 楊 娟， 彭青俠， 魏圓圓， 張 紅△

(陜西中醫(yī)藥大學(xué) 1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 2醫(yī)學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心， 陜西 咸陽(yáng) 712046)

慢性胰腺炎(chronic pancreatitis，CP)病因復(fù)雜，起始過程各異，持續(xù)進(jìn)展的慢性炎癥最終導(dǎo)致胰腺組織結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，并逐漸被纖維組織所取代，引起不同程度的胰腺內(nèi)、外分泌功能障礙[1]。胰腺纖維化已被視為各種原因所致CP的共同病理學(xué)特征，是慢性胰腺炎病理過程中的核心事件和關(guān)鍵靶標(biāo)[2-3]。

CP多采用對(duì)癥治療，而對(duì)于胰腺纖維化缺乏針對(duì)性治療[4]。近年有研究發(fā)現(xiàn)中醫(yī)經(jīng)方大柴胡湯可以減輕CP患者的臨床癥狀[5]。我們課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，大柴胡湯可以減輕CP小鼠胰腺纖維化[6]。黃芩苷(baicalin，C21H18O11)是大柴胡湯組方中臣藥黃芩的重要成分，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)黃芩苷可下調(diào)胰腺組織轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)的表達(dá)水平，減少膠原纖維的沉積，對(duì)CP大鼠胰腺纖維化具有治療作用[7]。但是，黃芩苷在抑制TGF-β1后又是如何調(diào)控其下游機(jī)制進(jìn)而發(fā)揮防治CP胰腺纖維化的作用，目前尚不清楚。

核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)作為重要的轉(zhuǎn)錄因子，近年來研究發(fā)現(xiàn)其活化程度與胰腺纖維化進(jìn)展密切相關(guān)[8-9]。有學(xué)者在大鼠急性肝損傷的研究中發(fā)現(xiàn)，黃芩苷可通過抑制NF-κB信號(hào)通路活化，進(jìn)而抑制卵圓細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)已增殖的卵圓細(xì)胞向成熟的肝細(xì)胞及膽管細(xì)胞分化，發(fā)揮對(duì)肝臟的保護(hù)作用[10]。那么，黃芩苷對(duì)CP胰腺纖維化進(jìn)展中NF-κB信號(hào)通路是否具有調(diào)控作用，其具體調(diào)控機(jī)制是否與TGF-β1有關(guān)，目前尚不明確。本研究通過腹腔注射20% L-精氨酸誘導(dǎo)小鼠CP模型，觀察黃芩苷對(duì)CP小鼠胰腺組織TGF-β1、磷酸化轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β活化激酶1(phosphorylated TGF-β-activated kinase 1，p-TAK1)及NF-κB的影響，探討黃芩苷防治CP胰腺損傷及胰腺纖維化的作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供可靠依據(jù)，并為CP的防治提供新的思路。

材 料 和 方 法

1 藥品及試劑

黃芩苷(21967-41-9)購(gòu)于笛柏生物科技試劑公司；L-精氨酸(A6969-100G)購(gòu)于Sigma-Aldrich；抗NF-κB p65抗體(SC-8008)和抗轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子βⅠ型受體(transforming growth factor-β receptor type Ⅰ，TGF-βRⅠ)抗體(SC-402)購(gòu)于Santa Cruz；抗纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)抗體(bsm-33143M)和抗p-TAK1抗體(bs-5435R)購(gòu)于博奧森試劑公司；TGF-β1 ELISA檢測(cè)試劑盒(EK0515)、抗GAPDH抗體(BM1623)、HRP標(biāo)記的羊抗小鼠(BA1050)及羊抗兔II抗(BA1054)購(gòu)于博士德試劑公司；RNA提取試劑盒(9767)、反轉(zhuǎn)錄試劑(RR036A)及實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑(RR820A)購(gòu)于TaKaRa；特超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑購(gòu)于碧云天試劑公司；Masson染色試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所；其它試劑由當(dāng)?shù)厣镏苿┕咎峁┑姆治黾兓瘜W(xué)試劑。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及造模 健康雄性昆明小鼠58只，6～8周齡，體重20～25 g，購(gòu)于空軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(合格證號(hào)0014945)，在(22±2)℃的環(huán)境中自由取食飲水，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。隨機(jī)分為3組：空白對(duì)照(control)組、CP模型(CP)組和黃芩苷治療(baicalin)組(對(duì)照組n=18，每時(shí)點(diǎn)6只；CP模型組n=24，每時(shí)點(diǎn)8只；黃芩苷治療組n=16，每時(shí)點(diǎn)8只)。CP模型組及黃芩苷治療組小鼠均給予腹腔注射20% L-精氨酸(每次3 g/kg，每周1次，每次2輪，間隔1 h，持續(xù)6周)；空白對(duì)照組給予腹腔注射與L-精氨酸等體積的生理鹽水。治療組于造模2周后開始腹腔注射黃芩苷(每次100 mg/kg，每次1次，每周6天，持續(xù)4周)；空白對(duì)照組及CP模型組分別給予腹腔注射與黃芩苷等體積的生理鹽水。

2.2標(biāo)本的采集與處理 分別在造模后各時(shí)間點(diǎn)麻醉處死動(dòng)物，下腔靜脈取血并分離血清，凍存于-20 ℃用于后續(xù)ELISA檢測(cè)。完整摘除胰腺，均勻分配胰腺頭、體、尾部，將部分胰腺組織置于10%中性甲醛溶液浸泡固定；另一部分胰腺組織迅速放入液氮中速凍，再轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存，用于后續(xù)提取蛋白及RNA。

2.3胰腺組織病理學(xué)的觀察 甲醛固定后的胰腺組織進(jìn)行脫水、石蠟包埋、3 μm切片，HE及Masson染色觀察胰腺組織形態(tài)學(xué)改變及纖維化程度。

2.4ELISA檢測(cè)血清TGF-β1濃度的變化 使用ELISA試劑盒檢測(cè)各組小鼠血清TGF-β1濃度，按照試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)方法，檢測(cè)并記錄血清樣本所測(cè)濃度。

2.5免疫組織化學(xué)染色觀察胰腺組織FN和NF-κB的表達(dá) 胰腺組織3 μm切片常規(guī)脫蠟至水，枸櫞酸緩沖液抗原修復(fù)15 min，PBS洗3次，每次5 min,3%過氧化氫室溫孵育10 min，5% BSA室溫孵育1 h，滴加I抗[抗FN抗體(1∶200)或抗NF-κB p65抗體(1∶150)]于4 ℃過夜，滴加即用型生物素化羊抗小鼠IgG II抗，室溫孵育1 h，滴加SABC室溫孵育40 min，DAB顯色劑顯示3 min，蘇木素復(fù)染、脫水透明及封片。

2.6Western blot檢測(cè)胰腺組織FN、TGF-βRⅠ、p-TAK1及NF-κB的蛋白水平 取凍存胰腺組織，加入適量蛋白裂解液，充分機(jī)械勻漿，冰上孵育30 min，4 ℃離心10 min，提取離心上清液，BCA法蛋白定量，加入loading buffer將樣品稀釋至4 g/L，上樣至SDS-PAGE，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，封閉1 h，滴加I抗分別為GAPDH(1∶1 000)、FN(1∶400)、TGF-βRⅠ(1∶400)、p-TAK1(1∶400)及NF-κB(1∶400)，4 ℃搖床孵育過夜。TBST漂洗3次，每次5 min。HRP標(biāo)記的II抗(羊抗兔或羊抗小鼠IgG 1∶2 000)，室溫孵育1 h。TBST漂洗3次,每次5 min。滴加ECL，在Protein Simple化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中，選取適當(dāng)時(shí)間曝光并拍照。

2.7real-time PCR檢測(cè)胰腺組織基質(zhì)金屬蛋白酶1(matrix metalloproteinase-1，MMP-1)及金屬蛋白酶組織抑制物1(tissue inhibitor of metalloprotease-1，TIMP-1)的mRNA表達(dá) MMP-1/TIMP-1引物序列見表1，按試劑盒操作步驟提取胰腺組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行PCR，反應(yīng)體系為:SYBR 10 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL,ROX reference dye Ⅱ 0.08 μL,cDNA(20 μg/L)7 μL,ddH2O 1.32 μL。擴(kuò)增條件為:50 ℃循環(huán)預(yù)熱2 min;95 ℃循環(huán)預(yù)變性10 min;95 ℃變性5 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt法定量比較Ct值，計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 Real-time PCR引物序列

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 黃芩苷可以減輕胰腺組織損傷及胰腺纖維化

與空白對(duì)照組相比，在造模后2周，CP模型組小鼠胰腺組織出現(xiàn)水腫，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，腺泡萎縮及少量壞死，并可見少量膠原纖維的沉積；4周時(shí)胰腺損傷持續(xù)加重，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)增多，并出現(xiàn)管狀化結(jié)構(gòu)，膠原纖維沉積加重；6周時(shí)胰腺小葉結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，腺泡進(jìn)一步萎縮，被大量的管狀化結(jié)構(gòu)所取代，甚至出現(xiàn)類似空泡樣結(jié)構(gòu)，胰腺纖維化明顯，可見大量膠原纖維沉積。黃芩苷治療組小鼠胰腺損傷程度明顯輕于同時(shí)點(diǎn)的CP模型組，僅見部分腺泡萎縮及少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，膠原纖維的沉積明顯減輕，見圖1、2。

胰腺組織纖維化指標(biāo)FN免疫組化結(jié)果顯示，空白對(duì)照組胰腺組織結(jié)構(gòu)良好，胰腺小葉間無膠原纖維的沉積，CP模型組在造模4和6周時(shí)胰腺組織間隙可見明顯陽(yáng)染的膠原纖維，并隨造模時(shí)間的延長(zhǎng)，F(xiàn)N的陽(yáng)染表達(dá)呈上升趨勢(shì)；而黃芩苷治療組在4和6周時(shí)FN的陽(yáng)染表達(dá)明顯低于同時(shí)間點(diǎn)的CP模型組，見圖3。通過Western blot檢測(cè)胰腺組織FN的表達(dá)顯示類似的結(jié)果，CP模型組在4和6周時(shí)FN的蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)；而黃芩苷治療組胰腺組織FN的蛋白表達(dá)水平顯著低于CP模型組(P<0.01)，見圖4。

Figure 1. The pancreatic morphological changes of mice induced by 20% L-arginine (HE staining, ×200). w: weeks.

圖1 胰腺組織的病理學(xué)改變

Figure 2. The degree of fibrosis in pancreatic tissues (Masson staining, ×200). w: weeks.

圖2 胰腺組織的纖維化程度的改變

2 黃芩苷可抑制TGF-β1、TGF-βRⅠ及p-TAK1的表達(dá)

通過ELISA檢測(cè)血清TGF-β1濃度的變化。在造模后2和4周時(shí)血清TGF-β1的表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)；而黃芩苷治療組血清TGF-β1的表達(dá)水平明顯低于CP模型組(P<0.01),見圖5。

通過Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在造模后4周時(shí)胰腺組織TGF-βRⅠ及p-TAK1的蛋白水平顯著升高(P<0.01)，6周時(shí)較前有所下降，但仍較空白對(duì)照組高；而黃芩苷治療組胰腺組織的TGF-βRⅠ及p-TAK1的蛋白水平明顯低于CP模型組(P<0.01)，見圖6。

3 黃芩苷可以抑制胰腺組織NF-κB的表達(dá)

造模后4和6周，在胰腺腺泡細(xì)胞、浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞和胰腺星狀細(xì)胞(pancreatic stellate cells, PSC)可見大量NF-κB陽(yáng)性表達(dá),并且NF-κB的蛋白表達(dá)量明顯高于空白對(duì)照組；而黃芩苷治療組NF-κB的表達(dá)水平則顯著低于相同時(shí)點(diǎn)的模型組(P<0.01)，見圖7、8。

4 黃芩苷對(duì)MMP-1/TIMP-1平衡的調(diào)控作用

與空白組相比，CP模型組小鼠在造模2周時(shí)胰腺組織MMP-1 mRNA表達(dá)水平開始下降，在4周時(shí)降低更為顯著(P<0.01)，6周時(shí)仍處于較低水平(P<0.01)；而黃芩苷治療組在造模4和6周時(shí)胰腺組織MMP-1的mRNA表達(dá)水平較CP模型組明顯升高(P<0.01),見圖9。

Figure 3. The expression of FN in the pancreas of mice (IHC, ×400). w: weeks.

圖3 免疫組化染色觀察胰腺組織FN表達(dá)的變化

Figure 4. The protein level of FN in the pancreas of mice determined by Western blot. w: weeks. Mean±SD.n=4.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsCP group.

圖4 Western blot檢測(cè)胰腺組織FN蛋白表達(dá)的變化

與空白組相比，CP模型組小鼠胰腺組織TIMP-1的mRNA表達(dá)水平在造模2和4周時(shí)顯著升高(P<0.01)，并持續(xù)高表達(dá)，在6周時(shí)TIMP-1 的mRNA表達(dá)水平雖有所下降，但仍明顯高于空白對(duì)照組(P<0.01)；與CP模型組比較，黃芩苷治療組胰腺組織TIMP-1的mRNA表達(dá)水平則相對(duì)較低，見圖10。

Figure 5. The serum level of TGF-β1 in mice. w: weeks. Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsCP group.

圖5 血清TGF-β1含量的變化

討 論

慢性胰腺炎是臨床上常見的消化系統(tǒng)疾病，主要表現(xiàn)為胰腺實(shí)質(zhì)的慢性炎癥，胰腺漸進(jìn)性慢性炎癥反應(yīng)最終導(dǎo)致胰腺纖維化，引起胰腺內(nèi)、外分泌功能缺陷，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[11]。因此，深入探討胰腺纖維化進(jìn)展中的相關(guān)分子機(jī)制，有效遏制CP病程進(jìn)展，是臨床上迫切需要解決的難題。

近年來多項(xiàng)臨床研究顯示，以大柴胡湯為基本組方的中藥治療CP臨床療效確切[4-5]。課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)[6, 12-13]，大柴胡湯對(duì)小鼠CP模型胰腺纖維化具有抑制作用，而黃芩作為復(fù)方大柴胡湯的臣藥，具有清熱解毒之功效。黃芩苷是從黃芩的干燥根中提取的一種黃酮類化合物，具有廣泛的藥理作用，包括抗炎、抗纖維化及清除氧自由基等作用[14-15]。

Figure 6. The protein levels of TGF-βRⅠ and p-TAK1 in the pancreas of mice. w: weeks. Mean±SD.n=4.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsCP group.

圖6 胰腺組織TGF-βRⅠ及p-TAK1蛋白水平的變化

本實(shí)驗(yàn)采用腹腔注射20% L-精氨酸成功誘發(fā)小鼠CP模型，模擬出CP病程進(jìn)展中胰腺組織的病理變化。予以腹腔注射黃芩苷干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，黃芩苷治療組小鼠的胰腺損傷程度明顯輕于CP模型組，僅見部分腺泡萎縮及少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，膠原纖維的沉積明顯減輕，胰腺組織FN的表達(dá)也顯著降低，提示黃芩苷可明顯減輕CP小鼠胰腺組織損傷程度，減少膠原纖維的沉積，從而發(fā)揮抗胰腺纖維化的作用。

研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β是重要的促纖維化細(xì)胞因子，在CP病程進(jìn)展中，胰腺組織中TGF-β表達(dá)上調(diào)，可刺激胰腺微環(huán)境中胰腺星狀細(xì)胞活化，促使細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的合成，從而導(dǎo)致胰腺纖維化[16]。我們研究發(fā)現(xiàn)，在復(fù)制CP模型后小鼠血清的TGF-β1表達(dá)水平顯著升高，而黃芩苷可降低TGF-β1的表達(dá)水平。但是，黃芩苷在降低TGF-β1的產(chǎn)生后是如何調(diào)控其下游機(jī)制，進(jìn)而發(fā)揮抗胰腺纖維化的作用，目前尚不清楚。

有學(xué)者在心肌纖維化的研究中發(fā)現(xiàn)，TGF-β1可激活其下游底物TAK1，進(jìn)而啟動(dòng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致膠原纖維的沉積[17]。亦有研究發(fā)現(xiàn)[18-19]，TAK1的過度表達(dá)可促進(jìn)NF-κB信號(hào)通路的活化，而NF-κB的活化程度與胰腺纖維化進(jìn)展密切相關(guān)[8-9]。

NF-κB以同源或異源二聚體形式存在，由NF-κB1(p50/p105)、NF-κB2(p52/p100)、RelA/p65、Re1B及c-Rel 5種Rel家族成員組成[20]。有研究發(fā)現(xiàn)，RelA/p65是NF-κB最常見的異源二聚體，也是NF-κB信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白[21]。在靜息狀態(tài)下，胞質(zhì)中的NF-κB與其抑制蛋白(inhibitor of NF-κB，IκB)相結(jié)合形成三聚體，使其呈非活化狀態(tài)。當(dāng)機(jī)體在各種損傷因素作用下，IκB激酶(IκB kinase，IKK)誘導(dǎo)IκB發(fā)生磷酸化，磷酸化的IκB在泛素介導(dǎo)下被蛋白酶降解，使NF-κB二聚體得以進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，從而啟動(dòng)和調(diào)控相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[22]。

Figure 7. The expression of NF-κB in the pancreas of mice (IHC, ×400). w: weeks.

圖7 免疫組化染色觀察胰腺組織NF-κB表達(dá)的變化

Figure 8. The protein level of NF-κB in the pancreas of mice determined by Western blot. w: weeks. Mean±SD.n=4.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsCP group.

圖8 Western blot檢測(cè)胰腺組織NF-κB蛋白的表達(dá)變化

Figure 9. The mRNA expression of MMP-1 in the pancreas of mice. w: weeks. Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsCP group.

圖9 胰腺組織MMP-1的mRNA表達(dá)變化

Figure 10. The mRNA expression of TIMP-1 in the pancreas of mice. w: weeks. Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsCP group.

圖10 胰腺組織TIMP-1的mRNA表達(dá)變化

我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，胰腺組織TGF-βRⅠ及p-TAK1表達(dá)水平升高的同時(shí)，胰腺組織NF-κB p65的表達(dá)水平亦明顯升高。因此本研究提示，在胰腺纖維化病程進(jìn)展中，TGF-β1可能通過與TGF-βRⅠ相結(jié)合，促進(jìn)TAK1的磷酸化，進(jìn)而激活NF-κB信號(hào)通路。而經(jīng)黃芩苷治療后，血清TGF-β1表達(dá)水平降低的同時(shí)，胰腺組織TGF-βRⅠ、p-TAK1及NF-κB的蛋白水平均顯著下降，表明黃芩苷可能通過調(diào)控TGF-β1/TAK-NF-κB信號(hào)通路活性，發(fā)揮抗胰腺纖維化的作用。

大量研究證實(shí)，胰腺纖維化的發(fā)生與ECM的合成增多、降解減少有關(guān)[23-24]，而ECM降解受到基質(zhì)金屬蛋白酶和金屬蛋白酶組織抑制物的調(diào)控[25]。我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，造模后CP模型組胰腺組織MMP-1的mRNA表達(dá)水平下降，并維持較低水平，而TIMP-1的mRNA表達(dá)水平則顯著升高，兩者的表達(dá)呈現(xiàn)失衡狀態(tài)，提示在CP病程進(jìn)展中伴隨著MMP-1的表達(dá)下調(diào)及TIMP-1的過度表達(dá)，影響ECM的降解而導(dǎo)致其過度沉積，最終表現(xiàn)為胰腺纖維化的加重。黃芩苷治療組胰腺組織各時(shí)間點(diǎn)MMP-1的mRNA表達(dá)水平較CP模型組升高，而TIMP-1的mRNA表達(dá)水平較CP模型組有所下降，MMP-1/TIMP-1的失衡狀態(tài)有所糾正，ECM沉積明顯減少。關(guān)于MMP-1/TIMP-1失衡的調(diào)控機(jī)制，目前認(rèn)識(shí)還不夠清楚。我們課題組在PSC離體實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)TGF-β1可以明顯誘導(dǎo)PSC活化，而采用siRNA干擾NF-κBp65基因后，PSC活化程度及其分泌炎性細(xì)胞因子的能力明顯降低，同時(shí)發(fā)現(xiàn)MMP-1/TIMP-1的失衡狀態(tài)得以改善，提示NF-κB信號(hào)通路活化與MMP-1/TIMP-1的失衡有關(guān)，抑制NF-κB信號(hào)通路可能通過調(diào)控MMP-1/TIMP-1平衡，遏制PSC活化，從而發(fā)揮抗胰腺纖維化的作用[26]。

綜上所述，CP進(jìn)展中過度生成的TGF-β1可能通過與TGF-βRⅠ結(jié)合，引發(fā)TAK-NF-κB信號(hào)通路活化，進(jìn)而導(dǎo)致胰腺纖維化。黃芩苷可以抑制TGF-β1生成，使TGF-β1/TAK-NF-κB信號(hào)通路的活化程度減低，進(jìn)而調(diào)控MMP-1/TIMP-1的平衡，減少ECM沉積，抑制胰腺纖維化的進(jìn)展，通過多靶點(diǎn)干預(yù)胰腺纖維化，有效遏制了CP病程進(jìn)展。