mTOR 激酶抑制劑CC-223抑制乳腺癌細胞增殖的實驗研究*

郭書欣， 周 曉， 潘曉璇， 徐 皓， 郝崗平， 王鳳澤△

[1山東第一醫(yī)科大學(山東省醫(yī)學科學院)生命科學學院， 山東 泰安 271000； 2山東醫(yī)學高等?？茖W校 基礎(chǔ)醫(yī)學教學部， 山東 臨沂 276000]

乳腺癌是發(fā)生在乳腺上皮組織的惡性腫瘤，其發(fā)病率在女性的惡性腫瘤中位居榜首，且呈逐年上升趨勢。據(jù)文獻報道，2015年我國女性新發(fā)乳腺癌病例約26.86萬，新增死亡病例6.95萬[1]。目前，外科手術(shù)仍然是乳腺癌治療的主要手段，化療在術(shù)前縮小病灶、術(shù)后防止復發(fā)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。然而化療耐受性及毒副作用嚴重影響了乳腺癌的綜合治療效果[2]。因此，闡明乳腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機制，同時尋找新的臨床治療藥物仍然是目前亟待解決的重大課題。

磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信號途徑是調(diào)控細胞生理與病理過程的關(guān)鍵通路之一[3],該信號通路在腫瘤中常出現(xiàn)過度激活與突變，促進了腫瘤細胞的增殖與侵襲遷移[4]。CC-223是一種高選擇性的mTOR抑制劑，能夠同時抑制mTOR復合物1(mTORC1)和mTOR復合物2(mTORC2)[5]。研究表明，CC-223通過抑制mTORC1/C2的活性而阻止肝細胞癌和頭頸部鱗狀細胞癌的增殖[6-7]。本項工作以人乳腺侵襲性導管癌細胞株MCF-7和三陰性乳腺癌細胞株MDA-MB-231為實驗用細胞，觀察CC-223對乳腺癌細胞增殖的影響，并探討可能的分子機制。

材 料 和 方 法

1 實驗材料

CC-223購自Selleck Chemicals；胎牛血清購自Gibco；ECL發(fā)光液購自Millipore；CCK-8購自日本同仁化學；RNase A、碘化丙啶(propidium iodide,PI)、β-actin抗體和磷酸化細胞分裂周期蛋白2(phosphory-lated cell division cycle protein 2, p-Cdc2)抗體購自Sigma；p53、cyclin B1、c-Myc和survivin抗體購自Santa Cruz；cyclin D1抗體購自Abcam；辣根過氧化物酶標記的II抗均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

2 實驗方法

2.1細胞株 人乳腺癌細胞株MCF-7和MDA-MB-231均購自上海中國科學院細胞庫，在含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液中，于37℃和5% CO2孵箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細胞進行相關(guān)實驗研究。

2.2CCK-8法測定細胞活力 接種乳腺癌細胞于96孔板中，分別用0.1 μmol/L、0.25 μmol/L、0.5 μmol/L、1 μmol/L、2.5 μmol/L和5 μmol/L的CC-223處理24 h，對照組加入二甲基亞砜。然后每孔加入10 μL的CCK-8繼續(xù)培養(yǎng)1 h，用酶標儀檢測各組細胞在450 nm波長處的吸光度(A)值，并對結(jié)果進行統(tǒng)計分析。實驗重復3次。

2.3細胞周期檢測 乳腺癌細胞經(jīng)CC-223處理24 h后，胰酶消化并離心收集細胞。離心棄去上清后，加入75%乙醇于4℃固定過夜。上機前離心去除乙醇，加入終濃度為10 mg/L的RNase A于37 ℃孵育30 min，接著加入5 mg/L的 PI 避光染色15 min，最后上機檢測細胞周期分布。

2.4Western blot實驗 不同濃度的CC-223作用于乳腺癌細胞24 h后，加入含有蛋白酶抑制劑的RAPI裂解液冰上提取細胞總蛋白，然后定量。取30～40 μg總蛋白進行SDS-PAGE，接著電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將膜置于5%脫脂奶粉中，室溫封閉1 h，加入Ⅰ抗4℃孵育過夜，然后加入Ⅱ抗室溫孵育1 h，最后加入ECL顯色液曝光顯影。實驗重復3次。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，實驗所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間比較應用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 CC-223對乳腺癌細胞活力的抑制作用

從圖1中可以看出，高于0.25 μmol/L的CC-223作用于乳腺癌細胞24 h后，細胞活力顯著降低(P<0.05)，且CC-223對乳腺癌細胞活力的抑制作用呈劑量依賴性，見圖1。

Figure 1. CC-223 reduced the viability of MCF-7 and MDA-MB-231 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L group.

圖1 CC-223對乳腺癌細胞活力的抑制作用

2 CC-223對乳腺癌細胞周期的影響

流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，CC-223作用乳腺癌細胞24 h后，MCF-7細胞發(fā)生G1期阻滯(P<0.05)，同時S期細胞數(shù)量相應減少；同樣1 μmol/L CC-223能夠誘導MDA-MB-231細胞阻滯于G1期(P<0.05)，然而較低濃度的CC-223(0.1 μmol/L)處理MDA-MB-231細胞后，G2/M期細胞數(shù)量顯著增多(P<0.05)，G1期細胞數(shù)目變化不顯著，見圖2。

Figure 2. The effect of CC-223 on the cell cycle distribution in breast cancer cells. A: MCF-7 cells; B: MDA-MB-231 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L group.

圖2 CC-223對乳腺癌細胞周期的影響

3 CC-223對細胞周期相關(guān)蛋白表達的影響

CC-223能夠下調(diào)MCF-7和MDA-MB-231細胞中cyclin B1、cyclin D1和p-Cdc2的表達(P<0.05);同時，CC-223上調(diào)MCF-7細胞中p53的蛋白表達(P<0.05),而MDA-MB-231細胞經(jīng)CC-223作用24 h后，p53的表達水平則部分下調(diào)(P<0.05),見圖3。

4 CC-223抑制乳腺癌細胞中c-Myc的蛋白表達

CC-223處理MCF-7和MDA-MB-231細胞24 h后，c-Myc蛋白的表達下調(diào)(P<0.05)，見圖4。

5 CC-223下調(diào)乳腺癌細胞中survivin蛋白的表達

不同濃度的CC-223作用乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細胞24 h后，與對照組比較，癌蛋白survivin的表達水平顯著降低(P<0.05),見圖5。

討 論

mTOR是一種非典型的絲氨酸/蘇氨酸激酶，與不同的蛋白質(zhì)結(jié)合形成mTORC1和mTORC2兩種復合體，能夠磷酸化底物的Ser/Thr殘基[8]。mTOR 信號通路參與多種生理和病理過程，調(diào)節(jié)細胞生長、凋亡、自噬和衰老等生理過程，同時與多種惡性腫瘤發(fā)生相關(guān)[9]。目前，多種針對mTOR 分子的抑制劑已進入臨床前或臨床實驗研究[10-11]。

本實驗結(jié)果表明，mTOR激酶抑制劑CC-223能夠抑制乳腺癌細胞活力，并誘導細胞周期發(fā)生阻滯。有研究報道CC-223作用于人舌鱗癌SCC-9細胞后， G1期的細胞數(shù)目增加，處于G2/M和S期細胞數(shù)目則相應減少[7]。而在本研究中，相同劑量的CC-223則誘導乳腺癌細胞發(fā)生顯著的G2/M期阻滯，提示CC-223對細胞周期的調(diào)控作用因細胞種類不同而各異。

cyclin、cyclin依賴性蛋白激酶(cyclin-dependent protein kinases,CDKs)和CDK抑制蛋白共同調(diào)控細胞周期進程。在本研究中，CC-223抑制乳腺癌細胞中cyclin B1、cyclin D1和p-Cdc2的表達，提示上述細胞周期調(diào)控因子參與CC-223誘導的細胞周期阻滯。另外，p53表達水平的差異可能是較低濃度CC-223誘導MCF-7和MDA-MB-231細胞周期阻滯于不同階段的機制之一。

c-myc基因是細胞內(nèi)的一種常見原癌基因，在乳腺癌等多種實體腫瘤中高水平表達，參與調(diào)控腫瘤細胞的侵襲遷移、血管生成及放化療耐受等[12-13]。

Figure 3. The effects of CC-223 on the expression of cell cycle-related proteins in breast cancer cells. A: MCF-7 cells; B: MDA-MB-231 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L group.

圖3 CC-223對細胞周期相關(guān)蛋白表達的影響

Figure 4. The effect of CC-223 on the protein expression of c-Myc in the breast cancer cells was determined by Western blot analysis. A: MCF-7 cells; B: MDA-MB-231 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L group.

圖4 Western blot檢測乳腺癌細胞中c-Myc的表達

Figure 5. The effect of CC-223 on the protein expression of survivin in the breast cancer cells was determined by Western blot analysis. A: MCF-7 cells; B: MDA-MB-231 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L group.

圖5 Western blot檢測乳腺癌細胞中survivin的表達

本研究結(jié)果顯示CC-223下調(diào)c-Myc的表達，這可能與其抑制乳腺癌細胞增殖有關(guān)。CC-223抗腫瘤活性的另一可能機制是其對survivin的抑制作用。survivin 是凋亡抑制蛋白家族重要成員之一，在乳腺癌等多種腫瘤中高表達，與腫瘤細胞增殖、凋亡和DNA 修復等過程有關(guān)[14-15]。雖然下調(diào)c-Myc和survivin的表達可能是CC-223抑制乳腺癌細胞增殖的重要機制之一，但CC-223是否通過直接作用于c-Myc與survivin分子而發(fā)揮抗腫瘤活性尚待深入研究。

綜上所述，CC-223能夠通過阻滯細胞周期進程而抑制乳腺癌細胞增殖，并下調(diào)癌蛋白c-Myc和survivin的表達水平。本研究在闡明mTOR抑制劑CC-223體外抗腫瘤活性分子機制的同時，為乳腺癌的臨床用藥提供了參考資料。