1,6-二磷酸果糖三鈉鹽復(fù)方制劑的毒理學(xué)研究

李 卓 陳燕娟 劉士華

作者單位：張家港市華天藥業(yè)有限公司 215600

1,6-二磷酸果糖三鈉鹽(英文名稱D-Fructose 1,6-diphosphate trisodium salt)，簡稱FDP，別名1,6-二磷酸果糖，為一種重要的細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物，能直接調(diào)節(jié)很多代謝途徑，尤其對于能量代謝和某些酶活性可發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[1]。臨床上主要用于提高對心肌缺血造成缺氧的耐受能力和改善糖代謝[2]，具有明顯的抗疲勞、耐缺氧、降低血糖等作用[3]。FDP在國內(nèi)外已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、保健食品等方面。目前，國內(nèi)對1,6-二磷酸果糖三鈉鹽(FDP)復(fù)方制劑的毒理學(xué)研究尚未報(bào)道。本試驗(yàn)1,6-二磷酸果糖三鈉鹽(FDP)復(fù)方制劑是某企業(yè)研制的保健食品復(fù)方產(chǎn)品，為確保其食用安全性，根據(jù)《食品安全性毒理學(xué)評價(jià)程序和方法》，對1,6-二磷酸果糖三鈉鹽復(fù)方制劑進(jìn)行了急性毒性試驗(yàn)、遺傳毒性試驗(yàn)。

1.材料與方法

1.1 樣品 1,6-二磷酸果糖三鈉鹽復(fù)方制劑：由1,6-二磷酸果糖三鈉鹽、維生素B1、維生素B6、L-天門冬氨酸制成的保健食品，膠囊內(nèi)容物為微黃色粉末，由某企業(yè)提供。人體推薦量為每日4粒，共1.6g，其中每粒含有1,6-二磷酸果糖三鈉鹽300mg，維生素B130mg、維生素B630mg、L-天門冬氨酸40mg。

1.2 動物 昆明種小鼠，均由南京鐵道醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.3 方法

1.3.1 急性毒性試驗(yàn)：昆明種小鼠20只，雌雄各半，體重為18～22g，隨機(jī)分為4個(gè)劑量組(2.15g/kg、4.46g/kg、10.00g/kg、21.5g/kg)，采用霍恩氏法，灌胃給予受試物，連續(xù)觀察14天，記錄動物中毒癥狀及死亡情況。

1.3.2 Ames試驗(yàn)：采用平板摻入法，用經(jīng)鑒定符合要求的鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型TA97、TA98、TA100、TA102試驗(yàn)菌株,試驗(yàn)劑量設(shè)0.2μg/皿、5μg/皿、50μg/皿、500μg/皿、1000μg/皿，同時(shí)設(shè)空白對照、陽性對照組。在活化與非活化條件下37℃培養(yǎng)48小時(shí)，計(jì)數(shù)每皿回變菌落數(shù)。

1.3.3 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)：昆明種小鼠，25～30g，50只，隨機(jī)分為5組，每組10只，雌雄各半。劑量分別為1000mg/kg、2000mg/kg、4000mg/kg，、陰性對照組(蒸餾水)、陽性對照組(環(huán)磷酰胺組，40mg/kg)。采用間隔24小時(shí)兩次灌胃給受試物，第二次灌胃后6小時(shí)處死動物，取胸骨骨髓制片，甲醇固定，Giemsa染色。每組觀察計(jì)數(shù)1000個(gè)完好嗜多染紅細(xì)胞，計(jì)算微核率。

1.3.4 小鼠精子畸形試驗(yàn)：選雄性小鼠25只，隨機(jī)分為5組。設(shè)2500mg/kg、5000mg/kg、10000mg/kg體重3個(gè)劑量組、陰性對照組(蒸餾水)、陽性對照組(環(huán)磷酰胺組，40mg/kg)。灌胃給予受試物，連續(xù)5天，至第35天頸椎脫臼法處死小鼠，取出二側(cè)附睪，常規(guī)制片，甲醇固定，用1%的伊紅染色，于顯微鏡下觀察形態(tài)。每鼠計(jì)數(shù)1000個(gè)結(jié)構(gòu)完整的精子，紀(jì)錄精子畸形數(shù)并統(tǒng)計(jì)精子畸形率(%)。

2.結(jié)果

2.1 急性毒性試驗(yàn) 14天觀察期內(nèi)，各劑量組雌、雄小鼠均無死亡及中毒癥狀。小鼠急性經(jīng)口LD50大于21.5g/kg。根據(jù)急性毒性分級，該復(fù)方制劑屬無毒物質(zhì)。

2.2 遺傳毒性試驗(yàn)

2.2.1 Ames試驗(yàn)：由表1可見，各濃度無論是否加入S-9混合液各皿回變菌落均未大于自然回變數(shù)的2倍，也無劑量反應(yīng)關(guān)系。而各陽性對照組均顯示強(qiáng)烈的誘變作用。結(jié)果判斷，1,6-二磷酸果糖三鈉鹽復(fù)方制劑無致突變作用。

表1 1,6-二磷酸果糖三鈉鹽復(fù)方制劑Ames試驗(yàn)結(jié)果

注：*陽性對照物：TA97(-S9)：米帕林，TA98(-S9)：柔紅霉素，TA100(-S9)：疊氮鈉，TA102(-S9)：絲裂霉素C，TA97(+S9)、TA98(+S9)、TA100(+S9)、TA102(+S9):2-乙烯氨基芴。

2.2.2 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)：由表2可見，試驗(yàn)組動物在各試驗(yàn)劑量下，PCE微核出現(xiàn)率，PCE/RBC均與陰性對照組一致，而陽性對照顯示強(qiáng)烈的致突變作用。根據(jù)該試驗(yàn)結(jié)果，1,6-二磷酸果糖三鈉鹽復(fù)方制劑在上述劑量下未見致突變作用。

表2 1,6-二磷酸果糖三鈉鹽復(fù)方制劑對小鼠骨髓細(xì)胞微核發(fā)生率的影響

2.2.3 小鼠精子畸形試驗(yàn)：由表3可見，陰性對照組的精子畸變率為1.44%，屬于小鼠正?；兎秶鷥?nèi)，陽性對照組(環(huán)磷酰胺組)的精子畸變率為6.36%，顯著高于陰性對照組(P<0.01)。3個(gè)劑量下的樣品組的精子畸變率分別為1.38%、1.34%和1.52%。與陰性對照組的1.44%比較，未見顯著差異(P>0.05)，而且無劑量反應(yīng)關(guān)系，說明本次檢測的1,6-二磷酸果糖三鈉鹽復(fù)方制劑對小鼠精子無致突變作用。

表3 1,6-二磷酸果糖三鈉鹽復(fù)方制劑對小鼠精子畸形率的影響

3.討論

1,6-二磷酸果糖三鈉鹽(FDP)是葡萄糖代謝過程中的重要中間產(chǎn)物，可以影響機(jī)體ATP的供能[5]。它在缺氧條件下，能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，激活細(xì)胞內(nèi)磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶，并作為底物,通過糖酵解途徑提供能量[6]。目前1,6-二磷酸果糖三鈉鹽(FDP)主要研究方向在缺氧缺血性腦病、心肌缺血所致的心律失常、改善心供能[7]、急性心力衰竭[8]、運(yùn)動能力的影響[9]等。

1,6-二磷酸果糖三鈉鹽(FDP)的臨床應(yīng)用主要是靜脈注射，口服用制劑報(bào)道很少。本試驗(yàn)通過對復(fù)配維生素B1、維生素B6、L-天門冬氨酸制成的口服用復(fù)方制劑，進(jìn)行了毒理學(xué)研究。維生素B1、維生素B6、L-天門冬氨酸作為食品添加劑都是安全的。維生素B1的輔酶形式焦磷酸硫胺素(TPP)是丙酮酸脫氫酶、α-酮戊二酸脫氫酶、轉(zhuǎn)酮醇酶的輔酶。缺氧時(shí)自身TPP不能滿足機(jī)體代謝需要，額外補(bǔ)充維生素B1有助于促進(jìn)丙酮酸氧化脫羧，從而使三羧酸循環(huán)正常運(yùn)轉(zhuǎn)，促進(jìn)糖的有氧氧化。維生素B6的主要輔酶活性形式是5-磷酸吡哆醛(PLP)和5-磷酸吡哆胺(PMP)。PLP通過參與轉(zhuǎn)氨作用將體內(nèi)的蛋白質(zhì)、糖類和脂肪代謝聯(lián)系起來[10]。L-天門冬氨酸可刺激缺血心肌丙酮酸轉(zhuǎn)氨作用,將乳酸通過丙酮酸轉(zhuǎn)變?yōu)楸彼?從而解除因乳酸堆積而導(dǎo)致糖酵解關(guān)鍵酶的抑制[11]。1,6-二磷酸果糖三鈉鹽(FDP)是糖代謝的中間產(chǎn)物,它能反饋刺激糖酵解限速酶磷酸果糖激酶(PFK)和丙酮酸激酶(PK)的活性,而促進(jìn)糖酵解,并能繞過PFK反應(yīng)步驟直接進(jìn)入糖代謝途徑,參與ATP合成代謝[12]。維生素B1、維生素B6、L-天門冬氨酸可以協(xié)同1,6-二磷酸果糖三鈉鹽(FDP)發(fā)揮在糖代謝過程中的生理功能，對開發(fā)1,6-二磷酸果糖三鈉鹽(FDP)口服用復(fù)方制劑有參考作用。

在本次試驗(yàn)中，對1,6-二磷酸果糖三鈉鹽復(fù)方制劑進(jìn)行了小鼠經(jīng)口急性毒性試驗(yàn)、Ames試驗(yàn)、小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)、小鼠精子畸形試驗(yàn)。小鼠經(jīng)口LD50>20g/kg體重，根據(jù)急性毒性(LD50)劑量分級標(biāo)準(zhǔn)，該樣品為無毒級；Ames試驗(yàn)無論加與不加S9活化系統(tǒng)均為陰性結(jié)果；小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)為陰性結(jié)果，表明該樣品無細(xì)胞毒性作用；小鼠精子畸形試驗(yàn)為陰性結(jié)果，表明該樣品對生殖細(xì)胞無致突變。因此，我們認(rèn)為1,6-二磷酸果糖三鈉鹽復(fù)方制劑為無毒級，亦無致突變作用，是安全的。