丹參-黃芪配伍對(duì)急性心肌缺血模型小鼠的影響及作用機(jī)制※

張立新 段立楠 劉曉麗 焦麗璇 李茜茜 耿艷華 陳 燕

(石家莊醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校中醫(yī)教研室，河北 石家莊 050599)

藥對(duì)是以一定證候特點(diǎn)及相應(yīng)治法為前提，根據(jù)藥物的性味歸經(jīng)、升降沉浮，選擇性地將2味中藥進(jìn)行配對(duì)[1]。藥對(duì)是組成中藥復(fù)方的基礎(chǔ)，其組成雖簡(jiǎn)單，但具備配伍的基本特點(diǎn)，是聯(lián)接單味中藥與復(fù)方的橋梁，復(fù)方研究常從藥對(duì)入手。丹參-黃芪是臨床常用藥對(duì)，其中丹參為活血化瘀藥，黃芪為補(bǔ)氣升陽藥，兩藥配伍有益氣活血的功效，常用于冠心病、心絞痛的治療[2]。本研究通過復(fù)制急性心肌缺血小鼠模型，觀察丹參-黃芪配伍對(duì)其的影響，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步探討，結(jié)果如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 C57BL/6小鼠50只，購(gòu)自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：1103241911029433，體質(zhì)量(18±2) g，雄性，SPF級(jí)。飼養(yǎng)于恒溫恒濕，獨(dú)立通氣籠具(IVC)中，滅菌飼料飼養(yǎng)，自由飲用滅菌雙蒸水。

1.1.2 試劑與試藥 丹參、黃芪藥材均購(gòu)自河北省中醫(yī)院，由主任中藥師鑒定為正品來源。丹參組、黃芪組分別取相應(yīng)藥材，加水煎煮2次并濃縮成1 g生藥/mL藥液；配伍組為丹參、黃芪藥材等比配伍，合煎并濃縮成1 g生藥/mL藥液。垂體后葉注射液(安徽宏業(yè)藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H34022977，批號(hào)190314)。膠原蛋白酶，美國(guó)ROCHE公司；細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光探針Fluo-4 AM，美國(guó)Sigma公司；肌球蛋白輕鏈20(myosin light chain 20，MLC20)抗體(貨號(hào)ab94730)、磷酸化肌球蛋白輕鏈(Phospho-MLC20，p-MLC20)抗體(貨號(hào)ab2480)，美國(guó)Abcam公司；蛋白裂解液，上海貝博生物科技有限公司；超敏電致化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒，蘇州新賽美生物科技有限公司；蛋白上樣緩沖液，北京普利萊基因技術(shù)有限公司；十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)，美國(guó)Sigma公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 激光共聚焦顯微鏡，美國(guó)Leica公司；體式顯微鏡，日本Olympus公司；迷你電泳儀，美國(guó)Bio-Rad公司；ECL儀，法國(guó)Vilber Lourmat公司；Ion Optix單細(xì)胞邊緣檢測(cè)系統(tǒng)，美國(guó)Ion Optix公司；ECG6511心電圖機(jī)，廣州艾迪科遜醫(yī)療器械有限公司；HW-400恒溫平滑肌槽，成都泰盟科技有限公司；迷你電泳槽、042BR-06571電泳儀，伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司；FR0149多功能成像分析儀，普諾森生物科技(上海)有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1 分組、給藥及造模 將50只C57BL/6小鼠，隨機(jī)分為空白組、模型組、丹參組(20 g生藥/kg體質(zhì)量)、黃芪組(20 g生藥/kg體質(zhì)量)和配伍組(丹參、黃芪配伍20 g生藥/kg體質(zhì)量)，每組10只。丹參組、黃芪組和配伍組分別予相應(yīng)藥液20 mL/kg體質(zhì)量灌胃，空白組和模型組予等容積蒸餾水灌胃。給藥1 h后，模型組和各給藥組分別予垂體后葉注射液25 U/kg體質(zhì)量腹腔注射，空白組予等容積0.9%氯化鈉注射液腹腔注射，每日1次，連續(xù)7 d。

1.2.2 心電圖檢測(cè) 末次給藥20 min后，各組小鼠予烏拉坦10 mg/kg體質(zhì)量腹腔注射麻醉，用心電圖機(jī)檢測(cè)小鼠心電圖ST段J點(diǎn)上移幅度和心率。

1.2.3 心肌細(xì)胞急性分離 將麻醉后的各組小鼠仰面固定，開胸，剪取帶有主動(dòng)脈的心臟組織，在體式顯微鏡下將周圍血管和脂肪清除干凈，保留主動(dòng)脈弓。將心臟懸掛于灌流裝置下端，37 ℃恒溫Ⅱ型膠原酶液循環(huán)灌流30 min，待心臟體積增加，質(zhì)地變軟后取下，剪去動(dòng)脈、心耳及心房等組織，將剩余的心室組織置于KB液中，撕成碎片。碎片組織用吸管反復(fù)吹打?yàn)閱渭?xì)胞后，用200目篩網(wǎng)過濾，靜置30 min，備用。

1.2.4 心肌細(xì)胞收縮檢測(cè) 將分離好的心肌細(xì)胞置于1.8 mmol/L Ca2+Tyrode′s solution中孵育10 min，置于顯微鏡下，予10 V、1 Hz的電場(chǎng)刺激，以Ion Optix單細(xì)胞邊緣檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)并計(jì)算心肌細(xì)胞肌小節(jié)長(zhǎng)度收縮百分率，以評(píng)價(jià)心肌細(xì)胞的收縮舒張功能。

1.2.5 心肌細(xì)胞鈣瞬變幅度和鈣回收速率檢測(cè) 配制游離Ca2+熒光探針孵育液，在1.8 mmol/L Ca2+Tyrode′s solution中加入Pluronic F-127和Fluo-4 AM。將急性分離的小鼠心肌細(xì)胞室溫孵育游離Ca2+熒光探針30 min。在激光共聚焦顯微鏡下每組隨機(jī)選擇細(xì)胞，觀測(cè)細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度及其變化情況，即心肌細(xì)胞鈣瞬變幅度和鈣回收速率。

1.2.6 心肌細(xì)胞MLC20磷酸化水平檢測(cè) 取小鼠心肌細(xì)胞200 μL，加入蛋白裂解液裂解0.5 mL，用破碎儀勻漿，離心后取上清，并用酶標(biāo)儀蛋白定量，5×蛋白上樣緩沖溶液，煮沸5 min使蛋白變性，采用Western blotting法檢測(cè)心肌細(xì)胞中MLC 20磷酸化蛋白和總蛋白表達(dá)。取細(xì)胞裂解液進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。將電泳后的蛋白25 V恒壓30 min轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙稀(PVDF)膜，8%脫脂奶粉常溫封閉2 h，加入相應(yīng)的一抗(1∶1 000)4 ℃過夜。洗膜后，加入稀釋的二抗(1∶10 000)常溫1 h，再次洗膜后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光，并掃描、拍照，分析相應(yīng)蛋白條帶的灰度值，p-MLC20與MLC20灰度值比值即為MLC20磷酸化水平。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠心電圖ST段J點(diǎn)上移幅度和心率比較 見表1。

由表1可見，與空白組相比，模型組小鼠心電圖ST段J點(diǎn)上移幅度顯著增大(P<0.01)，心率顯著加快(P<0.01)。與模型組相比，丹參組、黃芪組和配伍組小鼠心電圖ST段J點(diǎn)上移幅度均顯著減小(P<0.01)，心率減慢(P<0.01，P<0.05)。與配伍組相比，丹參組心電圖ST段J點(diǎn)上移幅度增大(P<0.05)，心率無明顯變化(P>0.05)；黃芪組心電圖ST段J點(diǎn)上移幅度顯著增大(P<0.01)，心率加快(P<0.05)。

表1 各組小鼠心電圖ST段J點(diǎn)上移幅度和心率比較

2.2 各組小鼠心肌細(xì)胞肌小節(jié)長(zhǎng)度收縮百分率比較 見表2。

表2 各組小鼠心肌細(xì)胞肌小節(jié)長(zhǎng)度收縮百分率比較

由表2可見，與空白組相比，模型組小鼠肌小節(jié)長(zhǎng)度收縮百分率明顯升高(P<0.05)。與模型組相比，丹參組、配伍組小鼠肌小節(jié)長(zhǎng)度收縮百分率降低(P<0.05，P<0.01)，黃芪組雖無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但也有降低趨勢(shì)。配伍組小鼠肌小節(jié)長(zhǎng)度收縮百分率與丹參組、黃芪組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但也有降低趨勢(shì)。

2.3 各組小鼠心肌細(xì)胞鈣瞬變幅度和鈣回收速率比較 見表3。

表3 各組小鼠心肌細(xì)胞鈣瞬變幅度和鈣回收速率比較

由表3可見，與空白組相比，模型組小鼠心肌細(xì)胞鈣瞬變幅度明顯增大(P<0.05)，鈣回收速率明顯加快(P<0.05)。與模型組相比，丹參組、黃芪組和配伍組小鼠心肌細(xì)胞鈣瞬變幅度均明顯降低(P<0.05)；丹參組和配伍組鈣回收速率均明顯減慢(P<0.05)，黃芪組雖無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但也有減慢趨勢(shì)。配伍組小鼠心肌細(xì)胞鈣瞬變幅度和鈣回收速率與丹參組、黃芪組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但有減小趨勢(shì)。

2.4 各組小鼠心肌細(xì)胞MLC20磷酸化水平比較 見圖1，表4。

圖1 各組小鼠心肌細(xì)胞MLC 20磷酸化水平比較

表4 各組小鼠心肌細(xì)胞MLC 20磷酸化水平比較

由圖1、表4可見，與空白組相比，模型組小鼠心肌細(xì)胞中MLC20的磷酸化水平顯著升高(P<0.01)。與模型組相比，丹參組、黃芪組和配伍組小鼠心肌細(xì)胞MLC20磷酸化水平均顯著降低(P<0.01)。配伍組小鼠心肌細(xì)胞MLC20磷酸化水平顯著低于丹參組和黃芪組(P<0.01)。

3 討 論

急性心肌缺血是由多種原因引起的心肌相對(duì)或絕對(duì)供血不足，心肌細(xì)胞缺氧，臨床表現(xiàn)為急性心肌梗死、突發(fā)心絞痛，可危及患者生命[3]。急性心肌缺血屬中醫(yī)學(xué)“胸痹”“心痛”范疇，基本病機(jī)為氣滯血瘀，多以活血化瘀、益氣活血為法治療[4]。張仲景《傷寒雜病論》云“干血不去，則足以留新血而灌溉不周”。氣為血之帥，血為氣之母，血液在脈中循行有賴于心氣的鼓動(dòng)，故而在治療血瘀證時(shí)多以活血藥和補(bǔ)氣藥配伍[2]。本研究項(xiàng)目組通過對(duì)近年的臨床文獻(xiàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，丹參-黃芪是治療冠心病心絞痛使用頻率最高的藥對(duì)之一[5-6]。丹參味苦性微寒，具有活血調(diào)經(jīng)、祛瘀止痛、涼血消癰、除煩安神的功效，為活血化瘀的要藥。黃芪味甘性微溫，具有補(bǔ)氣升陽、行滯通痹、利水消腫的功效，為升陽補(bǔ)氣之圣藥。兩藥等比配伍，益氣活血之功力宏，常用于冠心病、心絞痛的治療，臨床上治療此類疾病的芪參益氣滴丸、芪參膠囊均為丹參-黃芪的配伍[7-8]。藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，丹參、黃芪抑制心肌收縮、缺血時(shí)心臟保護(hù)的作用皆與鈣拮抗有關(guān)[9-10]。因此，本研究對(duì)丹參-黃芪配伍抗急性心肌缺血的作用進(jìn)行評(píng)價(jià)，并從鈣調(diào)控、抑制心肌細(xì)胞收縮的角度對(duì)兩藥配伍抗心肌缺血的作用機(jī)制進(jìn)行探討。

垂體后葉素能夠作用于加壓素受體，引起冠狀動(dòng)脈痙攣，導(dǎo)致心肌供血不足和心肌損傷，全身小血管收縮，造成心臟后負(fù)荷加重，引起心肌缺血[3]。本研究連續(xù)7 d給小鼠腹腔注射垂體后葉可復(fù)制急性心肌缺血模型。模型組小鼠心電圖表現(xiàn)出明顯的ST段J點(diǎn)抬高，心率加快(P<0.05)。予丹參、黃芪及兩藥配伍水煎液干預(yù)后，小鼠心電圖ST段J點(diǎn)降低，心率減慢，且兩藥配伍的效果優(yōu)于單獨(dú)使用。

本研究還從心肌細(xì)胞收縮和鈣調(diào)控角度對(duì)丹參-黃芪配伍抗急性心肌缺血的作用機(jī)制進(jìn)行初步的研究。研究發(fā)現(xiàn)，丹參、黃芪和兩藥配伍干預(yù)均能顯著降低小鼠心肌細(xì)胞收縮力，表現(xiàn)為肌小節(jié)長(zhǎng)度收縮百分率降低(P<0.05)。現(xiàn)代生理學(xué)研究顯示，心肌細(xì)胞漿內(nèi)Ca2+濃度的變化與細(xì)胞收縮密切相關(guān)。心肌興奮時(shí)，細(xì)胞外Ca2+通過L型鈣通道進(jìn)入胞漿，并觸發(fā)肌漿網(wǎng)內(nèi)鈣釋放，使胞漿中Ca2+濃度迅速上升[11]。繼而，Ca2+又被鈣泵泵回肌漿網(wǎng)或排出細(xì)胞，使胞漿內(nèi)Ca2+濃度降低。胞漿內(nèi)Ca2+濃度升高能夠與鈣調(diào)蛋白(calmodulin，CaM)形成復(fù)合體，通過激活肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinase，MLCK)使MLC20發(fā)生磷酸化，引發(fā)肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白相互作用，導(dǎo)致心肌收縮[12]?？梢?，心肌細(xì)胞漿內(nèi)的Ca2+濃度與細(xì)胞收縮程度有關(guān)，Ca2+濃度變化速率與細(xì)胞收縮頻率有關(guān)。因此，本研究以鈣瞬變幅度和鈣回收速率評(píng)價(jià)心肌細(xì)胞漿內(nèi)Ca2+濃度的變化情況。其中，鈣瞬變幅度用F/F0(即鈣瞬變曲線的峰值與基線的比值)表示，比值越大說明鈣瞬變幅度越大，心肌細(xì)胞漿內(nèi)的Ca2+最高濃度越大；心肌細(xì)胞鈣回收速率則與鈣回收的速度有關(guān)，該值越大，表明鈣回收速率越慢[13-15]。本研究發(fā)現(xiàn)，丹參、黃芪和兩藥配伍均可降低鈣瞬變幅度，減慢鈣回收速率，使MLC20的磷酸化程度降低，且兩藥配伍效果更好。進(jìn)一步證實(shí)丹參、黃芪有鈣拮抗作用，且兩藥能夠協(xié)同生效。

綜上所述，丹參、黃芪均對(duì)小鼠實(shí)驗(yàn)性急性心肌缺血有較好的改善作用，且兩藥配伍應(yīng)用的效果更好。其機(jī)制與降低鈣瞬變幅度，減慢鈣回收速率，降低MLC20的磷酸化程度，從而抑制心肌細(xì)胞收縮，減慢心率有關(guān)。