酪氨酸激酶抑制劑治療老年P(guān)h陽性慢性粒細(xì)胞白血病的臨床觀察

楊嵐，任慧娟，韓艷秋

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院血液科，內(nèi)蒙古呼和浩特市010050

慢性髓性白血?。╟hronic myelogenous leukemia,CML）屬于一種臨床惡性腫瘤，形成于骨髓造血干細(xì)胞克隆性增值，PH 染色體（費(fèi)城染色體） 是CML 細(xì)胞遺傳學(xué)特征性標(biāo)記，與BCR-ABL 融合基因作為臨床診斷該癥的必備條件，具有特殊性影響意義[1]。酪氨酸激酶抑制劑（chronic myelogenous leukemia，TKI）屬于低分子多靶點(diǎn)藥物，治療CML 可使患者8年OS率提升至87%，且TKI 治療時(shí)可將細(xì)胞遺傳學(xué)和分子學(xué)監(jiān)測作為預(yù)測療效及指導(dǎo)臨床用藥方案的觀察性指標(biāo)[2]。但TKI 治療時(shí)仍有30%左右患者因不良反應(yīng)等而未獲得最佳治療效果需更換方案。伴隨病情進(jìn)展，80%CML 患者會伴有克隆演變（CE），為臨床分析慢粒染色體異常的重點(diǎn)問題[3]。雖診療中細(xì)胞遺傳學(xué)CE對CML 而言屬于一類已知風(fēng)險(xiǎn)性因素，且與預(yù)后較差相關(guān)，但預(yù)后重要性在TKI 治療中尚未進(jìn)一步明確。美國血液學(xué)年會（ASH）于2018年研究中報(bào)道無CE 患者6 個(gè)月CCyR 顯著高于伴CE 患者，但2組深層分子學(xué)反應(yīng)相近，且CE 似乎并不對5年臨床結(jié)局產(chǎn)生影響[4-5]。本研究觀察TKI 治療Ph 陽性老年慢性粒細(xì)胞白血病后檢出克隆演變對預(yù)后的影響，為治療老年慢性粒細(xì)胞白血病提供方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2009年7月-2019年10月期間于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院初診為Ph 陽性的慢性髓性白血?。–ML）的老年患者780 例，將一線TKI 治療后檢出CCA/Ph-的32 例老年CML患者作為研究對象，所有患者均符合CML 相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]，確診前均行血常規(guī)、骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)、生化、骨髓活檢、細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)等項(xiàng)目檢查。32 例患者中男性22 例，女性10 例，年齡為62～85 歲，平均年齡為（73.5±5.6）歲。相關(guān)觀察指標(biāo)和研究過程均經(jīng)倫理委員會審批通過，患者均簽署知情同意書。

1.2 納入和排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）均具有完整細(xì)胞遺傳學(xué)資料；（2）患者Ph 染色體及BCR-ABL 融合基因均為陽性；（3）均行規(guī)律性隨訪；（4）臨床依從性均良好；（5）均將TKI 作為一線治療藥，且TKI 治療時(shí)檢出CCA/Ph-。符合上述所有選項(xiàng)者納入本研究[5]。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并其他惡性腫瘤；（2）確診前6 個(gè)月內(nèi)未行伊馬替尼（IM）治療；（3）第1年時(shí)監(jiān)測頻率＜2 次；（4）除TKI 外接受干擾素、骨髓移植或其他抗腫瘤藥物等治療；（5）年齡＜16 歲。符合上述任意1 項(xiàng)者不納入本研究。

1.3 方法

1.3.1 治療方法 患者確診后均行甲磺酸伊馬替尼片（商品名：格列衛(wèi)，瑞士諾華制藥有限公司，注冊證號H20100263，規(guī)格：0.1 g）治療，400 mg/次，1 次/d，治療初期行1～2 次/周血常規(guī)檢查，根據(jù)血象變化酌情增減劑量，直至血象回復(fù)平穩(wěn)或達(dá)到血液學(xué)完全反應(yīng)（CHR）,隨后每1～3 個(gè)月進(jìn)行1 次。第1年治療時(shí)，治療后第3、6 和12 個(gè)月行骨髓細(xì)胞遺傳學(xué)分析，直至到達(dá)CCyR,隨后每12 個(gè)月1 次。采用RQ-PCR進(jìn)行BCR-ABL 融合基因檢測，每3 個(gè)月1 次，直至達(dá)到MMR,隨后每3～6 個(gè)月1 次，若發(fā)現(xiàn)BCR-ABL轉(zhuǎn)錄本升高應(yīng)該每1～3 個(gè)月監(jiān)測1 次。治療反應(yīng)評價(jià)為失敗，警告或疾病進(jìn)展時(shí)需行激酶測序分析突變,評價(jià)患者服用依從性。伊馬替尼（IM）耐藥或不能耐受時(shí)，綜合考慮患者合并癥與用藥史及病史、BCRABL 激酶區(qū)突變類型及經(jīng)濟(jì)情況轉(zhuǎn)換為二代TKI：尼洛替尼膠囊（NL）（商品名：達(dá)希納，瑞士諾華制藥有限公司，注冊證號H20140334，規(guī)格：200 mg 或150 mg）或達(dá)沙替尼片（DAS）（商品名：施達(dá)賽，百時(shí)美施貴寶制藥有限公司，注冊證號H20160433，規(guī)格：20 mg 或50 mg）治療。

1.3.2 檢驗(yàn)方法 進(jìn)行細(xì)胞遺傳學(xué)檢測。骨髓細(xì)胞常規(guī)染色體核型分析:抽取肝素抗凝的骨髓5 mL，計(jì)數(shù)后按1.5×106/mL進(jìn)行直接法制備然后采用G顯帶技術(shù)，方法為使用胰蛋白酶、其他鹽溶液或堿等處理染色體標(biāo)本，后將其于Giemsa 染液中染色，完畢后染色體上會出現(xiàn)類似于與Q 帶但寬度及亮度均不同的橫紋，使用顯微鏡觀察，則深淺相間的帶形橫紋出現(xiàn)在視野中，因Q 帶和G 帶彼此對應(yīng)，因此染色體表現(xiàn)為Q帶亮帶對應(yīng)部分被Giemsa 染液染成深色帶紋，而Q帶暗帶部分呈現(xiàn)為淺色帶紋。分析20 個(gè)細(xì)胞，按《人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制［ISCN （1995）］》[6] 進(jìn)行核型描述，核型分析鑒定至少需2 人共同參與操作。熒光原位雜交技術(shù)（FISH）:抽取肝素抗凝的骨髓5 mL，制備染色體玻片，目標(biāo)探針變性，將變性的DNA探針10L 加至標(biāo)本上，蓋上蓋玻片并封片，制備玻片標(biāo)本，后將其玻片放置于熒光顯微鏡之下，采用20×物鏡掃描樣品雜交區(qū)域，從中選取分散最佳的區(qū)域，后采用40×或100×物鏡，并在三色或多色熒光激發(fā)觀察，視野中出現(xiàn)不同顏色的熒光圖像，后選擇一定方向進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)至少300 個(gè)間期細(xì)胞[7]。分子生物學(xué)監(jiān)測：采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（RQ-PCR）法檢測監(jiān)測BCR-ABL 轉(zhuǎn)錄本水平,檢測標(biāo)本可為外周血（不少于8 mL），后采用紅細(xì)胞裂解液獲取紅細(xì)胞后，收集白細(xì)胞，其后使用TRIzol 試劑（美國Invitrogen 公司）處理，經(jīng)氯仿萃取，后使用異丙醇沉淀獲取RNA。采用基因擴(kuò)增儀（美國Biorad 公司，型號：伯樂T100）及實(shí)時(shí)RQ-PCR 檢測儀（美國羅氏公司，型號：LC480）檢測，設(shè)置內(nèi)參基因?yàn)锳BL。采用BCR-ABL（P210）定量檢測試劑盒（上海源奇生物科技有限公司）獲取標(biāo)準(zhǔn)曲線，后進(jìn)行標(biāo)本檢測及計(jì)算。BCR-ABL 水平檢測值（BCR-ABL/ABL）=BCR-ABL 拷貝數(shù)/ABL 拷貝數(shù)×100%。BCR-ABL 國際標(biāo)準(zhǔn)值（IS）=BCR-ABL 水平檢測值×轉(zhuǎn)換系數(shù)（CF）[8]。

1.3.3 療效判定方法 （1）完全血液學(xué)反應(yīng)：患者的WBC 在10×109/L 以下，PLT 在450×109/L 以下，外周血中無髓性不成熟細(xì)胞,嗜堿粒細(xì)胞＜0.05，脾大消失為完全血液學(xué)反應(yīng)（CHR）；（2）完全和部分細(xì)胞遺傳學(xué)反應(yīng)：患者骨髓中Ph （+） 細(xì)胞數(shù)為0%即為完全細(xì)胞遺傳學(xué)反應(yīng)（CCyR）；患者的Ph（+）細(xì)胞數(shù)≤35%即為部分細(xì)胞遺傳學(xué)反應(yīng)（PCyR）；（3）主要分子學(xué)反應(yīng)：患者的BCR-ABLIS≤0.01%（ABL 拷貝數(shù)＞10 000）稱為主要分子學(xué)反應(yīng)（MMR）；（4）MR4.5：MR4.5 定義為骨髓或外周血標(biāo)本連續(xù)2 次檢測BCRABLIS≤0.0032%（ABL 拷貝數(shù)＞32 000）或ABL 拷貝數(shù)＞32 000 時(shí)無法檢測的疾病微小殘留；（5）穩(wěn)定的 MR4.5：穩(wěn)定的MR4.5定義為 BCR-ABLIS≤0.0032%，持續(xù)至少2年[9-10]。（6）事件定義：總生存（OS） 時(shí)間指的是從TKI 開始治療，到任何誘因致使患者死亡或者最后一次隨訪結(jié)束；（7）無事件生存（EFS） 時(shí)間：從TKI 開始治療，到治療期間發(fā)生下述任何1 項(xiàng)事件結(jié)束：喪失CHR、CCyR 及MMR；病情已進(jìn)展到CML 加速期（AP）或者急變期（BP）；發(fā)展成為Ph 染色體陰性急性髓系白血病（AML）；任何誘使患者死亡因素以及隨訪活動結(jié)束[11]。

1.3.4 隨訪采用門診、微信、電話或訪視等方式從TKI開始治療時(shí)定期隨訪，并與患者預(yù)約復(fù)查時(shí)間[10]。

1.4 觀察指標(biāo)（1）分析檢出CCA/Ph-老年CML 患者基線資料及CCA/Ph-特征；（2）分析32 例老年患者總體療效；（3）分析32 例老年患者生存情況；（4）影響老年CML 患者生存的單因素分析；（5）影響老年CML 患者生存的多因素分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分率表示，采用2檢驗(yàn)。n＜40 或T＜1 時(shí)采用Fisher 檢驗(yàn)。分析生存情況，將單因素中P＜0.05 的影響性因素納入多因素分析，采用Logistic 多元回歸分析影響生存率的因素。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 分析檢出CCA/Ph-老年CML 患者基線資料及CCA/Ph-特征 伴CCA/Ph-老年CML 患者32 例中男性22 例（68.7%）、女性10 例（31.3%）。于TKI 開始治療時(shí)，28 例CP、3 例AP、1 例BP；TKI 治療時(shí)于14 （3～92） 個(gè)月首次出現(xiàn)CCA/Ph-，且有11 例（34.4%）調(diào)整藥物為二線NL 或DAS。首次伴CCA/Ph-的克隆比例≥50%有19 例（59.4%），且12 例（37.5%）反復(fù)性出現(xiàn)CCA/Ph-，20 例（62.5%）CCA/Ph-出現(xiàn)為一過性（隨訪僅1 次）。CCA/Ph-異常類型：以+8 為主有19 例（59.4%），以-7/7q-為主有5 例（15.6%）。見表1。

2.2 分析32 例老年患者總體療效 32 例伴CCA/Ph-老年CML 患者TKI 治療后均獲取CCyR，獲取中位時(shí)間13 （3～59） 個(gè)月，且15 例（46.9%） 于初次給藥3個(gè)月后檢驗(yàn)BCR-ABLIS，其水平≤10%。當(dāng)隨訪中位時(shí)間50 （11 ～132） 個(gè)月時(shí)，患者中75.0% （24/32）療效維持在CCyR；62.5%（20/32）分子學(xué)反應(yīng)為MMR，且獲取中位時(shí)間為31 （4-73） 個(gè)月。-7/7q-為主的5 例老年患者中l(wèi) 例應(yīng)用TKI 治療失敗且首次染色體核型檢出-7、9q-，被確診克隆演變Ph 陰性AML（急性骨髓性白血?。溆? 例患者療效為MMR（2例）及CCyR（1 例）。

2.3 分析生存情況 隨訪中位時(shí)間50 個(gè)月時(shí)32 例患者平均EFS 時(shí)間：45 個(gè)月，且平均2年、5年的EFS 率分別為（83.5±7.1）%、（52.5±9.3）%。32 例患者中總生存中位時(shí)間為50 個(gè)月時(shí)，平均2年、5年的OS率分別為（92.3±5.1）%、（77.3±9.6）%。32 例患者中3 例（9.4%）死亡：2 例死于Ph 陰性AML，l 例BP 患者死于復(fù)發(fā)。

2.4 影響老年CML 患者生存的單因素分析32 例老年患者EFS 率（2年）與性別、TKI 給藥3 個(gè)月BCRABLIS 水平、CCA/Ph-出現(xiàn)頻率相關(guān)（＜0.05），OS率（2年）與CCA/Ph-出現(xiàn)頻率相關(guān)（＜0.05）。CCA/Ph-異常類型組間EFS 率（2年）及OS 率（2年）差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05），但以-7/7q-為主異?；颊叩腅FS 率（2年）及OS 率（2年）相比以+8 為主異?；颊叩腅FS 率（2年）及OS 率（2年）較低。見表2。

2.5 影響老年CML 患者生存的多因素分析 采用TKI治療時(shí)影響老年CML 患者EFS 率的獨(dú)立性危險(xiǎn)因素是反復(fù)出現(xiàn) CCA/Ph- [OR=4.758,95%CI（1.22-18.591），＜0.05]。患者OS 率單因素分析中僅存在1個(gè)因素即CCA/Ph-出現(xiàn)頻率（＜0.05），因此未進(jìn)行OS 率的多因素分析。見表3。

表1 分析檢出CCA/Ph-老年CML 患者基線資料及CCA/Ph-特征

表2 影響老年CML 患者生存的單因素分析

表3 影響老年CML 患者EFS 率的多因素分析

3 討論

CML） 是一種血液惡性腫瘤，其典型特征為Ph陽性染色體出現(xiàn)克隆性增殖演變，其治療主要采用TKI 作為一線藥物，但治療期間伴有Ph 陽性核型反應(yīng)或Ph 陰性克隆演變，出現(xiàn)上述變化則表明治療失敗或病情進(jìn)展，提示預(yù)后較差[11]。臨床大數(shù)據(jù)研究[12] 發(fā)現(xiàn)TKI 治療CML 時(shí)發(fā)生CCA/Ph-的幾率為3.5%～10.0%，而本研究發(fā)現(xiàn)TKI 治療CML 時(shí)CCA/Ph-發(fā)生率為4.1%（32/780），二者研究結(jié)果相符。

臨床研究[13] 發(fā)現(xiàn)在采用TKI 治療CML 時(shí)出現(xiàn)CCA/Ph-的時(shí)間范圍是7～18 個(gè)月，且基本會獲取不同細(xì)胞遺傳學(xué)反應(yīng)（CyR）。本研究發(fā)現(xiàn)TKI 治療32 例老年CML 患者時(shí)于14 個(gè)月首次出現(xiàn)CCA/Ph-，而獲取CCyR 的中位時(shí)間為13 個(gè)月，二者研究結(jié)果一致。本研究采用TKI 治療CML 時(shí)檢出CCA/Ph-的例數(shù)為32 例，CCA/Ph-的染色體異常類型中以+8 為主有19 例（59.4%），以-7/7q-為主有5 例（15.6%），提示本研究780 例CML 患者中檢出CCA/Ph-的克隆演變中以+8 為主，其次為-7/7q-。

大部分臨床研究并未對檢出CCA/Ph-克隆演變對CML 患者預(yù)后的影響價(jià)值進(jìn)行仔細(xì)的探索，研究相對欠缺，且檢出CCA/Ph-對預(yù)后的意義仍處于爭論階段[13-14]。國外臨床研究[15] 報(bào)道采用甲磺酸伊馬替尼治療后，療效為PCyR 的CML 患者中檢出克隆演變患者與未檢出患者的5年OS 率及EFS 率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究隨訪50 個(gè)月時(shí)32 例患者平均EFS 時(shí)間45 個(gè)月，5年EFS 率為（52.5±9.3）%；OS 平均時(shí)間為50 個(gè)月，5年OS 率為（77.3±9.6）%。在影響因素分析中將CCA/Ph-的異常類型、CCA/Ph-的出現(xiàn)頻率、出現(xiàn)CCA/Ph-時(shí)TKI 治療、伴CCA/Ph-的克隆比例、患者性別及TKI給藥3 個(gè)月BCR-ABLIS水平6 項(xiàng)影響因素納入分析，研究上述因素對老年CML 患者2年OS 率及EFS 率的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，32 例老年患者EFS 率（2年）與性別、TKI 給藥3 個(gè)月 BCR-ABLIS 水平及 CCA/Ph-出現(xiàn)頻率相關(guān)（P＜0.05），OS 率（2年）與CCA/Ph-出現(xiàn)頻率相關(guān)（P＜0.05）。CCA/Ph-異常類型組間以+8 為主異常與以-7/7q-為主異常的患者生存率存在差異，其原因可能與不同CCA/Ph-異常類型的增殖、CE 特點(diǎn)存在較大差異及CCA/Ph-異常類型存在一定的不穩(wěn)定性相關(guān)[16-18]。

本研究將影響老年CML 患者EFS 率（2年）的單因素納入多因素分析，并采用多元回歸方程分析后發(fā)現(xiàn)，采用TKI 治療CML 時(shí)影響老年CML 患者EFS率的獨(dú)立性危險(xiǎn)因素是反復(fù)出現(xiàn)CCA/Ph- [OR=4.758,95%CI（1.22-18.591），＜0.05]。TKI 作為一線藥物治療CML 時(shí)老年CML 患者反復(fù)出現(xiàn)CCA/Ph-是影響患者生存的獨(dú)立性風(fēng)險(xiǎn)因素。上述研究中發(fā)現(xiàn)CCA/Ph-具有較強(qiáng)的遺傳學(xué)異質(zhì)性，因此老年CML 患者在采用TKI 作為一線藥物治療時(shí)，若出現(xiàn)CCA/Ph-則需要嚴(yán)格篩查患者染色體異常變化，并與該克隆演變的遺傳學(xué)特征、獲得的細(xì)胞細(xì)胞遺傳學(xué)反應(yīng)及分子生物學(xué)反應(yīng)進(jìn)行綜合性評價(jià)患者病情治療及進(jìn)展情況[19-21]。若治療期間CCA/Ph-反復(fù)性出現(xiàn)即≥2 次，則需警惕病情是否存在進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)，而在染色體核型檢查中出現(xiàn)以-7/7q-為主的CCA/Ph-則要警惕是否存在病情轉(zhuǎn)化的風(fēng)險(xiǎn)，并及時(shí)為患者調(diào)整治療方案[22-24]。

本研究對TKI 作為一線藥物治療CML 且檢出Ph染色體克隆演變的老年CML患者預(yù)后情況進(jìn)行觀察，并綜合細(xì)胞遺傳學(xué)、分子生物學(xué)及臨床檢驗(yàn)多項(xiàng)技術(shù)，分析影響其生存的單因素及多因素，發(fā)現(xiàn)TKI 作為一線藥物治療CML時(shí)老年CML患者反復(fù)出現(xiàn)CCA/Ph-是影響患者生存的獨(dú)立性風(fēng)險(xiǎn)因素。但本研究納入樣本數(shù)量較少，并未將確診后未采用TKI 作為一線藥物治療的老年CML 患者納入研究，且本研究也并未對TKI二線藥物轉(zhuǎn)換治療后能否逆轉(zhuǎn)異?？寺∏闆r進(jìn)行分析，因此在后續(xù)進(jìn)一步的臨床研究中將上述問題納入其中，進(jìn)行深入探討。