獼猴桃潰瘍病防治藥劑拮抗性的室內(nèi)試驗①

閆書貴 劉 原

（1四川省蒼溪縣職業(yè)高級中學(xué) 四川蒼溪 628400；2四川蒼溪獼猴桃研究所 四川蒼溪 628400）

獼猴桃潰瘍病是一種傳播速度快，危害非常嚴(yán)重的毀滅性細菌性病害。由于勞動力成本高，果農(nóng)為了省錢，經(jīng)常將各種防治潰瘍病的藥劑與其他防治病蟲害的藥劑進行混合施用，由于藥劑之間的拮抗作用，大大降低了潰瘍病防治藥劑的有效性。為了摸清潰瘍病防治藥劑與其他病蟲害防治藥劑的拮抗性，從而篩選出更加科學(xué)的獼猴桃病蟲害防治藥劑配伍，針對性開展試驗。

1 供試獼猴桃潰瘍病菌的分離與鑒定

1.1 供試病樣采集

病枝、病葉是在四川省蒼溪縣中土鎮(zhèn)“紅陽”獼猴桃園采取，枝條上病斑占枝條周長1/2～2/3，葉片病斑總面積占葉面積1/2以上。

1.2 供試培養(yǎng)基

LB固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，瓊脂粉10～15 g，氯化鈉10 g，酵母粉5 g，蒸餾水1 L。

LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，氯化鈉10 g，酵母粉5 g，蒸餾水1 L。

1.3 病原菌的分離與純化

病原菌樣品的分離：從采集的枝或葉上選擇發(fā)病典型的病斑，用剪刀在病健結(jié)合部剪取邊長3～4 mm的方形小塊病組織，依次放入75%酒精中浸泡15 s和0.1%升汞液中浸泡40 s進行消毒，無菌水連續(xù)漂洗3～5次，用無菌濾紙去除病組織上殘留水分，放入無菌離心管中用鑷子搗爛，加入無菌水浸泡15 min待用。用接種環(huán)蘸取浸泡液在培養(yǎng)基上進行劃線培養(yǎng)（25℃人工智能氣候箱），待菌落長出后，取疑似單菌落進行PCR鑒定，鑒定為獼猴桃潰瘍病菌的單菌落。

病原菌的純化：經(jīng)3次劃線法純化后作為試驗菌種保存?zhèn)溆?。將純化菌種用液體培養(yǎng)基從平板上用三角涂布棒清洗下來，再將40%的甘油與帶菌的液體培養(yǎng)基按1∶1混合，然后分裝于凍存管內(nèi)，移至-80℃冰箱保存。

1.4 病原菌的分子鑒定

（1）引物：根據(jù)Rees-George等[1]利用細菌16S-23S rDNA ITS內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列設(shè)計篩選的獼猴桃潰瘍病菌（Pseudomonas syringae pv.actinidiae）特異性引物對PsaF1/PsaR2：

PsaF1： 5＇-TTTTGCTTTGCACACCCGATTTT-3＇

PsaR2： 5＇-CACGCACCCTTCAATCAGGATG-3＇

由上海生工生物工程有限公司合成。

（2）PCR擴增反應(yīng)體系：取少量菌作為模板，2×Taq mastermix 12.5μL，上下引物（10μmol/L）各1μL，用無菌超純水補足體積到25μL，混勻后進行PCR反應(yīng)，無菌超純水做對照。

（3）PCR擴增條件：94℃弱變性4 min，94℃變性30 s，55℃退火30s，72℃延伸1 min，34個循環(huán)，72℃總延伸10 min，12℃保存。

PCR反應(yīng)產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行電泳分離，1×TAE作為電泳緩沖液，電泳結(jié)束后在凝膠成像系統(tǒng)下成像并分析，預(yù)期產(chǎn)物為280 bp。

1.5 結(jié)果與分析

采集、分離的病原菌，通過引物PsaF1/ PsaR2對分離菌種進行PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳分離，得到大小約280 bp的特異性片段，片段大小與引物設(shè)計大小相符合，其屬于獼猴桃潰瘍病菌（Pseudomonas syringae pv.actinidiae）。

1.6 試驗結(jié)論

本試驗利用Rees-George等篩選的獼猴桃潰瘍病菌特異性引物，對分離得到的病原菌進行PCR擴增、瓊脂糖電泳檢測，確定分離的病原菌為獼猴桃潰瘍病菌-丁香假單胞桿菌獼猴桃致病變種（Pseudomonas syringae pv.actinidiae），這與劉瑤等[2]對四川省獼猴桃潰瘍病菌分離鑒定的結(jié)果一致。

2 藥劑拮抗性的室內(nèi)試驗

2.1 供試藥劑

課題組從蒼溪縣獼猴桃潰瘍病防治常用藥劑中篩選出8種常用藥劑，篩選常用殺真菌劑1種和殺蟲劑1種，共10種。

表1 供試的10種藥劑

2.2 供試病菌

獼猴桃潰瘍病菌（Pseudomonas syringae pv.actinidiae），上述分離純化保存的菌種。

2.3 培養(yǎng)基

LB固體培養(yǎng)基：10 g氯化鈉，10 g胰蛋白胨，5 g酵母粉，10～15 g瓊脂粉，1 L蒸餾水。

2.4 試驗方法

2.4.1 菌懸液的配制

將上述保存菌株轉(zhuǎn)到培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)48 h后，用無菌水沖洗稀釋，根據(jù)文獻OD600=0.3～0.4，細菌的濃度約為2×108CFU/ mL[3]，用紫外分光光度計在波長600 nm處測菌懸液的吸光值范圍在0.3～0.4即可，無菌水調(diào)零。

2.4.2 藥劑對獼猴桃潰瘍病菌的室內(nèi)抑菌測定

參照焦紅紅[4]濾紙片抑菌圈法改進進行試驗。

（1）在超凈工作臺上，將融化后冷卻至60℃左右的LB培養(yǎng)基倒入直徑9 cm的培養(yǎng)皿內(nèi)約25 mL備用。用移液槍取上述配制好的菌懸液200 μL加入培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)基凝固之前迅速將二者充分混勻制成帶菌平板，每個平板放置直徑6 mm的滅菌濾紙片1-3個。

（2）將10種藥劑按用藥指導(dǎo)說明配成比生產(chǎn)使用濃度大10倍的溶液（表2），用移液槍取藥液200 μL依次加入到濾紙片上，以無菌水浸泡的濾紙片為對照。試驗重復(fù)3次，25℃恒溫培養(yǎng)中培養(yǎng)48 h后，觀察濾紙片周圍有無明顯的抑菌現(xiàn)象。

（3）用直尺測量抑菌圈直徑，記錄數(shù)據(jù)，計算抑制率。

抑制率/%=（處理菌落直徑-對照菌落直徑）/處理菌落直徑×100%

2.4.3 藥劑配伍對獼猴桃潰瘍病菌的室內(nèi)抑菌測定

將上述配制的8種潰瘍病防治藥劑分別與藥劑A嘧霉胺按1∶1配伍，與藥劑B螺蟲乙酯按1∶1配伍，以及與藥劑A和B按1∶1∶1配伍，按上述2.4.2方法進行抑菌試驗。

表2 供試10種藥劑產(chǎn)品的稀釋濃度

2.5 拮抗性試驗結(jié)果與分析

8種防治獼猴桃潰瘍病的藥劑分別與殺真菌劑嘧霉胺和殺蟲劑螺蟲乙酯進行兩兩配伍，以及三大類藥劑配伍時，除了四霉素和螺蟲乙酯配伍抑菌效果略有增強，其余藥劑配伍抑菌效果均不如單劑的抑菌效果，抑制率均有下降。其中，熒光假單胞桿菌單劑與不同類藥劑配伍抑菌效果下降不顯著，抑制率下降比例不超過6.7%；其次四霉素與嘧霉胺配伍抑制率下降8.16%，與螺蟲乙酯配伍抑菌效果略微增強1.02%，但三大類藥劑配伍抑制率下降16.8%；銅制劑春雷·王銅與不同類藥劑配伍抑菌效果下降最顯著；潰瘍病防治藥劑單劑配伍后抑制率下降幅度依次是：熒光假單胞桿菌＜四霉素＜中生菌素＜春雷·王銅；總體下降幅度呈現(xiàn)與螺蟲乙酯配伍＜與殺真菌劑嘧霉胺配伍＜三大類藥劑配伍；中生菌素、春雷·王銅與嘧霉胺、螺蟲乙酯三大類藥劑配伍后完全無抑菌作用（如表3）。

表3 8種藥劑產(chǎn)品對獼猴桃潰瘍病菌的抑制作用

2.6 拮抗性試驗結(jié)論與討論

2.6.1 生產(chǎn)上個別常用獼猴桃潰瘍病防治藥劑室內(nèi)抑菌效果差

通過本次室內(nèi)抑菌試驗發(fā)現(xiàn)，春雷霉素、噻唑鋅、氫氧化銅、噻菌銅等生產(chǎn)上常用潰瘍病防治藥劑的室內(nèi)抑菌作用不明顯，分析可能是由于連年使用些藥劑，造成獼猴桃潰瘍病菌發(fā)生變異，或產(chǎn)生抗藥性。

2.6.2 不同類型的藥劑配伍會增加拮抗性

通過該試驗發(fā)現(xiàn)，獼猴桃潰瘍病防治單劑與其他防治病蟲害藥劑配伍后，會顯著增加藥劑間的拮抗性，從而影響其對潰瘍病菌的抑制作用。建議果農(nóng)在防治潰瘍病時將殺細菌劑單獨施用，盡量避免混合后降低藥效，尤其是銅制劑作為堿性藥劑更不能與其它藥劑混用。