不同海拔嶺頭單樅茶的分類研究

魏建華 陸奕娜 黃學(xué)泓 韓建欣

摘要?應(yīng)用高效液相色譜法研究不同海拔嶺頭單樅茶的指紋圖譜，采用相似度分析軟件進(jìn)行分析比較，獲得21個(gè)共有特征峰;根據(jù)相對(duì)峰面積，采用判別分析法進(jìn)行分類研究，初步建立嶺頭單樅茶產(chǎn)地海拔鑒定方法，從而間接反映茶葉的品質(zhì)。結(jié)果表明，該方法簡(jiǎn)單、實(shí)用，是指紋圖譜技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量法在鳳凰單樅茶葉分類鑒定中的一個(gè)有益嘗試。

關(guān)鍵詞?嶺頭單樅茶;高效液相色譜;色譜指紋圖譜;判別分析法

中圖分類號(hào)?TS272.7文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼?A

文章編號(hào)?0517-6611（2020）02-0204-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.02.059

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Classification Studies of Lingtou Dancong Tea in Different Altitudes

WEI Jian-hua，LU Yi-na，HUANG Xue-hong et al?（1.Shantou Customs Technology Center， Shantou， Guangdong 515031;2. Shanxi Biological Research Institute Co.， Ltd.，Taiyuan，Shanxi 030006）

Abstract?The chromatographic fingerprint of Lingtou Dancong tea was studied by high performance liquid chromatography（HPLC）. The similarity analysis software was used to analyze and compare the fingerprints.Twenty-one common characteristic peaks for identification were obtained. According to the relative peak area， the discriminant analysis method was used for classification research， and the method for identifying the elevation of Lingtou Dancong tea origin was established， which indirectly reflected the quality of tea.The results showed that the method was simple and practical， and it was a useful attempt in the classification and identification of Fenghuang Dancong tea by the combination of fingerprint technology and stoichiometry.

Key words?Lingtou Dancong tea;High performance liquid chromatography;Chromatographic fingerprint;Identifying analysis method

嶺頭單樅是國(guó)家地理標(biāo)志產(chǎn)品——鳳凰單樅茶中的一個(gè)重要品種，其產(chǎn)地主要是廣東鳳凰山區(qū)[1]。茶的立地條件有很大差異，海拔為300～1 000m。依照茶園所處海拔將鳳凰單叢茶分為低山茶（海拔 300～400 m）、中山茶（海拔 500～700 m ）和高山茶（海拔800～1 100 m ）。無(wú)論是品質(zhì)還是經(jīng)濟(jì)價(jià)值均以高山茶居首，中山茶次之，低山茶居末[2]。由于經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)動(dòng)，市場(chǎng)上會(huì)出現(xiàn)以低產(chǎn)地海拔假冒高產(chǎn)地海拔現(xiàn)象，嚴(yán)重侵害消費(fèi)者的利益。

由于種植的產(chǎn)地海拔不同導(dǎo)致氣候、環(huán)境等因素不同，造成嶺頭單樅的化學(xué)成分的種類和含量不同，進(jìn)而有不同的口感和品質(zhì)[3]。筆者通過(guò)高效液相法指紋圖譜，結(jié)合試驗(yàn)分析與化學(xué)計(jì)量法，嘗試建立一種基于高效液相指紋圖譜和判別分析法的不同海拔嶺頭單樅的快速鑒定方法，對(duì)嶺頭單樅的產(chǎn)地海拔進(jìn)行快速客觀的判定，從而間接鑒定其品質(zhì)[4-7]。對(duì)于茶葉交易市場(chǎng)、茶葉經(jīng)銷商、消費(fèi)者、公安機(jī)關(guān)、海關(guān)和科研機(jī)構(gòu)等具有很強(qiáng)的應(yīng)用價(jià)值。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?儀器與設(shè)備。

Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國(guó)）：DAD檢測(cè)器，四元梯度泵;Millipore Advantage A10超純水系統(tǒng)（美國(guó)）;梅特勒-托利多AL204-IC電子分析天平（瑞士）;CBL photoelectron TECHNOLOGY Model C9860A型超聲波清洗器。

1.1.2?試劑。液相用乙腈、甲酸為色譜純;液相用水為超純水;其余試劑均為分析純?；瘜W(xué)試劑（標(biāo)準(zhǔn)品）：沒(méi)食子酸（GA）、表沒(méi)食子酸兒茶素（EGC）、沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（GCG）、兒茶素（C）、表兒茶素（EC）、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）、表兒茶素沒(méi)食子酸酯（ECG）、兒茶素沒(méi)食子酸酯（CG），北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。

1.1.3?試材。該試驗(yàn)材料是向茶農(nóng)直接購(gòu)買的已知產(chǎn)地海拔30個(gè)嶺頭單樅春茶樣品，來(lái)自廣東省潮州市饒平縣浮濱鎮(zhèn)產(chǎn)區(qū)，分別為海拔 400 m以下的低山茶10個(gè)樣品、海拔 600 m左右的中山茶 10個(gè)樣品和海拔1 000 m左右的高山茶10個(gè)樣品。

1.2?方法

1.2.1?供試品的制備。稱取3.00 g（粉碎）干茶樣，用50%乙醇在室溫下浸提15 min，過(guò)濾并洗滌濾渣3次，合并濾液，冷卻后定容100 mL;0.22 μm濾膜過(guò)濾后備用。

1.2.2?色譜條件。

色譜柱：Phenomenex Synergi MAX-RP C12 80A（250 mm×4.6 mm，4 μm）;柱溫30 ℃;流動(dòng)相A相為1%甲酸，B為乙腈;B相梯度從10%到30%;流速：1 mL/min，60 min;檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm[8]。

1.2.3?樣品測(cè)定。

吸取“1.2.1”所得供試品溶液，注入高效液相色譜儀中進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)，進(jìn)樣量為20 μL。按照“1.2.2”色譜條件分析測(cè)定，采集60 min色譜數(shù)據(jù)。

1.3?數(shù)據(jù)分析軟件

色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件選用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2012.130723版本）;判別分析用的統(tǒng)計(jì)軟件是SPSS 20.0。

2?結(jié)果與分析

2.1?方法學(xué)考察

2.1.1?精密度試驗(yàn)。取同一供試品溶液（編號(hào)為20160402-1的嶺頭單樅茶），依據(jù)“1.2.2”色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣5次。采用色譜相似度評(píng)價(jià)軟件進(jìn)行指紋圖譜相似度分析，與生成的對(duì)照指紋圖譜對(duì)比，各圖譜的相似度均等于1，表明儀器穩(wěn)定，精密度良好。

2.1.2?重現(xiàn)性試驗(yàn)。取同一批供試品（編號(hào)為20160402-1的嶺頭單樅茶），精密稱取5份，按“1.2.1”方法平行制備5份供試品溶液，分別依據(jù)“1.2.2”色譜條件進(jìn)樣，同法進(jìn)行檢測(cè)。選用相似度軟件對(duì)其指紋圖譜進(jìn)行分析，與生成的對(duì)照指紋圖譜相比，發(fā)現(xiàn)5份樣品的相似度均等于1，表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.1.3?穩(wěn)定性試驗(yàn)。

取同一份供試品溶液（編號(hào)為20160402-1的嶺頭單樅茶），依據(jù)“1.2.2”色譜條件進(jìn)樣，分別于0、3、6、9、15、24 h進(jìn)樣檢測(cè)。選用相似度軟件對(duì)其指紋圖譜進(jìn)行分析，與生成的對(duì)照指紋圖譜相比，發(fā)現(xiàn)6份樣品的相似度均大于0.990，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2?色譜指紋圖譜的建立

分別將屬于低山茶、中山茶、高山茶的樣品的高效液相色譜圖導(dǎo)入色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件中進(jìn)行指紋圖譜相似度分析，每類茶相似度大于0.9，生成對(duì)照?qǐng)D譜，使用匹配數(shù)據(jù)功能獲得每類嶺頭單樅中10個(gè)樣品都具有的共有峰;將3類嶺頭單樅茶的對(duì)照?qǐng)D譜使用相似度分析軟件進(jìn)行相似度分析，相似度大于0.9，通過(guò)匹配數(shù)據(jù)功能，獲得3類嶺頭單樅茶指紋圖譜所具有的共有峰;確定共有特征峰的數(shù)量及與共有特征峰對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間。

2.3?數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化

2.3.1?確定基峰及指紋圖譜中相同色譜峰的認(rèn)定范圍。

分析該研究收集的所有茶葉的高效液相色譜圖，發(fā)現(xiàn)在保留時(shí)間為（17.204±0.250） min內(nèi)峰面積最大峰，是整個(gè)指紋圖譜中峰面積最大或次大峰。經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)，該峰為表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）的色譜峰。以下數(shù)據(jù)處理都選擇該峰為基峰，進(jìn)行保留時(shí)間和峰面積的標(biāo)準(zhǔn)化。以該峰為基峰，求得8個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品在每次上機(jī)時(shí)的保留時(shí)間和相對(duì)保留時(shí)間，具體見表1。

由表1可見，對(duì)于8個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)說(shuō)，同樣的儀器和色譜條件下，不同次的檢測(cè)，其相對(duì)保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于2%。因此該研究設(shè)定對(duì)于不同茶樣品指紋圖譜中是否含有相同的峰的標(biāo)準(zhǔn)方法是保留時(shí)間為（17.204±0.250）min內(nèi)峰面積最大峰，即表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）的色譜峰，以該峰為基峰，計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間，設(shè)定相對(duì)保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2%，處于該設(shè)定范圍，認(rèn)為是相同的色譜峰。避免了保留時(shí)間數(shù)據(jù)漂移和色譜檢測(cè)儀器造成的峰不一致問(wèn)題，提高鑒定模型的準(zhǔn)確性和實(shí)用性。

2.3.2?保留時(shí)間和峰面積的標(biāo)準(zhǔn)化。將每類樣品指紋圖譜中共有特征峰的保留時(shí)間和峰面積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，獲得數(shù)據(jù)預(yù)處理文件。保留時(shí)間標(biāo)準(zhǔn)化：分別計(jì)算每類嶺頭單樅的指紋圖譜中的共有特征峰保留時(shí)間與基峰的保留時(shí)間的比值，作為相對(duì)保留時(shí)間。峰面積數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化：分別計(jì)算每個(gè)鳳凰單樅的指紋圖譜中的共有特征峰峰面積與基峰峰面積的比值，作為相對(duì)峰面積。

2.4?篩選用于識(shí)別的共有特征峰?從“2.2”中獲得的共有峰中，根據(jù)共有特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積篩選共有特征峰，相對(duì)保留時(shí)間一致的且穩(wěn)定出現(xiàn)的峰作為用于識(shí)別嶺頭單樅不同海拔的共有特征峰。

對(duì)于每類嶺頭單樅茶具體篩選步驟：①相對(duì)峰面積排序，去除與最大峰面積比小于0. 01%的共有峰。②相對(duì)保留時(shí)間，將經(jīng)過(guò)上一步驟保留下的峰的相對(duì)保留時(shí)間，根據(jù)每類嶺頭單樅的共有特征峰的相對(duì)保留時(shí)間一一進(jìn)行匹配，設(shè)定相對(duì)保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍為2%，各類嶺頭單樅的共有特征峰的相對(duì)保留時(shí)間處于該設(shè)定范圍，認(rèn)為每類嶺頭單樅指紋圖譜與此峰的相對(duì)保留時(shí)間一致的，保留該峰，否則棄去。如表2所示，共獲得鳳凰單樅產(chǎn)地海拔識(shí)別用共有特征峰21個(gè)。將這21個(gè)峰對(duì)應(yīng)的相對(duì)保留時(shí)間進(jìn)行集中排序，以用于識(shí)別的共有特征峰作為列，每個(gè)樣品作為行，所述相對(duì)峰面積填入相應(yīng)的單元格，獲得嶺頭單樅茶產(chǎn)地海拔鑒定的數(shù)據(jù)預(yù)處理文件。

2.5?判別分析

上述數(shù)據(jù)集中包含3組30條單茶葉樣品數(shù)據(jù)，用變量T作為樣品標(biāo)識(shí)。每條樣品數(shù)據(jù)都由21個(gè)變量信息（記為x1，x2，…，x21）構(gòu)成。選取每組數(shù)據(jù)其分類情況已知，并用分類變量P記錄類別，P值為1代表產(chǎn)地海拔為400 m 以下，P值為2代表產(chǎn)地海拔為600 m左右，P值為3代表產(chǎn)地海拔為800～1 000 m的樣品。使用SPSS 20.0軟件將典則判別分析源文件輸入統(tǒng)計(jì)軟件中進(jìn)行典則判別分析，以P為分組變量，對(duì)數(shù)據(jù)集進(jìn)行判別分析。線性判別函數(shù)中選取了2個(gè)較大的特征值，累計(jì)方差達(dá)到100%，保留了變量的所有信息量（表3）。

從3組不同海拔的嶺頭單樅茶樣品散點(diǎn)圖（圖1）可以看到，在以典則判別函數(shù)1為X軸、典則判別函數(shù)2為Y軸的坐標(biāo)圖中，3個(gè)產(chǎn)地海拔范圍的嶺頭單樅茶有明顯的分類，第1類即海拔為400 m以下的嶺頭單樅茶樣品明顯聚集在坐標(biāo)圖的右側(cè)，第2類即海拔為600 m左右的嶺頭單樅茶樣品明顯聚集在坐標(biāo)圖的左側(cè)上半部分，第3類即海拔為800～1 000 m的鳳凰單樅茶樣品明顯聚集在坐標(biāo)圖的左側(cè)下半部分，3組樣品界限分明。

3組共30個(gè)樣品的分類結(jié)果顯示，樣本中的第1類即產(chǎn)地海拔為400 m以下的鳳凰單樅茶中有10個(gè)樣品，沒(méi)有誤判;第2類即海拔為600 m左右的鳳凰單樅茶有10個(gè)樣品，沒(méi)有誤判;第3類即海拔為800～1 000 m的鳳凰單樅茶有10個(gè)樣品，沒(méi)有誤判;對(duì)已知產(chǎn)地海拔的鳳凰單樅茶樣本正確分類率為100%。

3?結(jié)論與討論

茶葉提取物在給定試驗(yàn)條件下所得到的色譜指紋圖譜反映了該茶葉的化學(xué)組成及其含量分布狀況，嘗試?yán)闷涮卣鞣彖b別茶葉產(chǎn)地海拔的不同，從而間接反映茶葉的品質(zhì)[8-9]。根據(jù)相似度軟件進(jìn)行相似度分析，發(fā)現(xiàn)同一海拔的嶺頭單樅茶指紋圖譜的相似度大于0.9，不同海拔的嶺頭單樅茶的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜進(jìn)行的相似度分析，相似度也都大于0.9，說(shuō)明對(duì)于嶺頭單樅茶來(lái)說(shuō)，所含有的化學(xué)成分相似，化學(xué)成分的含量也大致相似，無(wú)法通過(guò)相似度軟件直接區(qū)分不同海拔的嶺頭單樅茶。但是海拔的不同是影響嶺頭單樅茶品

質(zhì)的非常重要的因素。通過(guò)共有峰的識(shí)別，篩選出21個(gè)用

于判別分析的共有特征峰，采用判別分析方法建立不同海拔嶺頭單樅茶的鑒別模型。對(duì)海拔不同的鳳凰單樅茶的分析結(jié)果表明，對(duì)于海拔400 m以下、600 m左右和800～1 000 m的3類春茶，通過(guò)判別分析建立的鑒別模型鑒別準(zhǔn)確率為100%。驗(yàn)證了基于化學(xué)指紋圖譜的嶺頭單樅茶以產(chǎn)地海拔分級(jí)判別研究是可行的。

在茶葉成分復(fù)雜、品種鑒定的依據(jù)成分不完全明確的前提下，利用色譜指紋圖譜來(lái)鑒別嶺頭單樅茶的品種是切實(shí)可行的，并為不同品種及不同產(chǎn)地樣品之間的鑒別提供了科學(xué)依據(jù)[10]。該研究在此基礎(chǔ)上利用指紋圖譜技術(shù)和化學(xué)計(jì)量法軟件對(duì)產(chǎn)地海拔嶺頭單樅的茶葉進(jìn)行研究，獲得21個(gè)判別用共有特征峰，進(jìn)行判別分析，判別結(jié)果鑒別準(zhǔn)確率為100%，一定程度上反映了該鑒別方法的應(yīng)用前景，以改變?nèi)斯じ泄僭u(píng)審的方法，使茶葉審評(píng)客觀化、科學(xué)化和標(biāo)準(zhǔn)化[11-12]。該研究雖然只針對(duì)嶺頭單樅茶進(jìn)行產(chǎn)地海拔的分類與鑒定，但仍然可以作為其他鳳凰單叢茶研究的參考。

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