長鏈非編碼RNA與非酒精性脂肪性肝病

張賀 楊立英 黃雯莉 王文昭 陳素鳳 任路平

1河北醫(yī)科大學(xué)，石家莊 050017; 2河北省人民醫(yī)院內(nèi)分泌代謝病一區(qū)，石家莊 050051

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一種常見的慢性肝臟疾病，目前已經(jīng)成為全球最常見的肝病之一。肝細胞脂代謝失衡是NAFLD發(fā)生、發(fā)展的主要原因，長鏈非編碼RNA (lncRNA)主要通過調(diào)控基因，進而對肝臟脂代謝發(fā)揮作用[1]。本文綜述了lncRNA與NAFLD的相關(guān)研究，對臨床治療和疾病預(yù)防具有重要意義。

1 NAFLD概述

NAFLD主要包括4個組織學(xué)階段，即簡單脂肪變性、非酒精性脂肪性肝炎、纖維化和肝硬化。簡單脂肪變性是良性肝臟疾病，可以在幾十年里緩慢惡化，而非酒精性脂肪性肝炎則可在短期內(nèi)進展為肝硬化甚至肝細胞癌。肝細胞癌的發(fā)病率正在上升，在西方國家，肝細胞癌患者中NAFLD比率可能占到病例的25%，而且這種關(guān)聯(lián)可能更高[2]。

NAFLD發(fā)病機制復(fù)雜，單純性脂肪肝發(fā)病機制主要包括胰島素抵抗和脂代謝紊亂。最普遍、最流行的假設(shè)是所謂的“二次打擊”學(xué)說[3]。第一次打擊源于胰島素抵抗伴隨著脂肪蓄積，在此基礎(chǔ)上誘發(fā)的各種炎性細胞因子(腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-1、白細胞介素-6等)，以及脂肪因子(瘦素、脂聯(lián)素、抵抗素)，從而導(dǎo)致肝臟炎性反應(yīng)和肝細胞損傷，稱為第二次打擊[4]。

2 LncRNA概述

LncRNA是一組具有有限編碼能力的長度超過200個核苷酸的RNA分子，具有多種功能并通過各種分子機制調(diào)節(jié)不同的生物過程[5]。研究表明，lncRNA可以通過調(diào)節(jié)microRNA，在人類的各種疾病中發(fā)揮關(guān)鍵作用[6]。根據(jù)lncRNA基因在基因組上的位置,可將其分為3類：(1)位于基因間區(qū)的lncRNA，又被稱作lincRNA。(2)天然反義鏈lncRNA。(3)內(nèi)含子區(qū)長鏈非編碼RNA[7]。近年來研究表明，lncRNA是多種生物過程的重要調(diào)控因子，廣泛參與了許多生物學(xué)過程。

3 LncRNA與NAFLD

3.1 通過抑制脂肪酸β-氧化促進肝臟脂肪變性 LncRNA類固醇受體RNA激活劑(LncRNA-SRA)是一種lncRNA，在調(diào)節(jié)細胞增殖中起關(guān)鍵作用。LncRNA-SRA作為一種RNA共激活劑，可增強類固醇核受體依賴基因的表達[8]。在肌細胞生成、類固醇受體生成、乳腺腫瘤發(fā)生、心肌病等方面發(fā)揮重要作用。脂肪甘油三酯脂肪酶(ATGL)是主要的肝臟甘油三酯水解酶，它在游離脂肪酸的分解和信號控制中起著不可或缺的作用[9-10]。ATGL可調(diào)節(jié)細胞中甘油三酯水解酶的活性，是血脂異常和脂肪肝的可能治療靶點[11]。為了評估lncRNA-SRA在體內(nèi)的功能，Chen等[12]建立了SRA1基因敲除(SRA KO)小鼠模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SRA KO小鼠在高脂飲食和正常食物喂養(yǎng)下肝臟ATGL的基因和蛋白表達上調(diào)。表明lncRNA-SRA缺乏會上調(diào)ATGL在肝臟的表達。此外，在SRA KO小鼠肝細胞中誘導(dǎo)ATGL表達，使肝細胞酮體生成增加，而酮體是脂肪酸β氧化的產(chǎn)物和指標，從而改善了肝脂肪變性。在肝細胞Hepa1-6細胞系中，內(nèi)源性SRA的敲低也得到了類似的結(jié)果。相反，SRA的過表達抑制了ATGL的表達并減少了脂肪酸β氧化。并且小鼠肝臟ATGL缺乏可引起進行性肝臟脂肪變性。

3.2 通過促進肝臟脂質(zhì)合成，導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)沉積 固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c(SREBP-1c)是具有甘油三酯合成轉(zhuǎn)錄活性的SREBP家族成員，參與編碼了催化脂肪酸和甘油三酯合成途徑中各個步驟的酶，如脂肪酸合成酶(FAS)和乙酰輔酶A羧化酶(ACC)1[13]。SREBP-1c促進脂肪酸合成，異常表達的SREBP-1c可引起肝臟甘油三酯升高和肝脂肪變性[14]。

肝臟脂代謝與脂質(zhì)攝取、脂質(zhì)從頭合成、脂肪酸氧化和脂蛋白分泌有關(guān)。在NAFLD中，脂質(zhì)從頭合成通路的功能障礙與原發(fā)性疾病有關(guān)。LncARSR是近期發(fā)現(xiàn)的具有591個核苷酸的lncRNA，其在腫瘤中扮演著重要角色。為了闡明lncARSR影響的機制，Zhang等[15]使用腺病毒通過尾靜脈注射入小鼠體內(nèi)，建立了lncARSR過表達和敲低小鼠模型，與對照組相比，lncARSR過表達組小鼠臟肝甘油三酯含量增加，脂肪生成相關(guān)的關(guān)鍵基因[SREBP-1c、FAS、ACC1、硬脂酰輔酶A去飽和酶(SCD-1)]的mRNA表達水平增加，而lncARSR敲低組呈現(xiàn)相反的趨勢。表明lncARSR可通過促進肝臟脂質(zhì)合成導(dǎo)致NAFLD。

富含棕色脂肪的lncRNA 1(Blnc1)具有調(diào)節(jié)棕色和米色脂肪細胞分化的能力[16]。Zhao等[17]發(fā)現(xiàn)高脂飲食喂養(yǎng)的小鼠肝臟中Blnc1表達顯著升高，通過免疫印跡和實時定量PCR分析顯示Blnc1可以誘導(dǎo)SREBP-1c的前體以及脂質(zhì)合成基因的表達，包括SREBP-1c、FAS和SCD-1。分別對對照組和高脂飲食組小鼠進行Blnc1基因敲除，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，Blnc1基因敲除小鼠的肝臟重量、甘油三酯和膽固醇含量顯著降低。肝基因表達分析表明，參與脂質(zhì)合成關(guān)鍵基因的mRNA水平顯著降低，脂質(zhì)合成相關(guān)基因受到明顯抑制。這些結(jié)果表明，Blnc1是肥胖相關(guān)的脂肪形成活化以及高脂飲食誘導(dǎo)的肝脂肪變性發(fā)展的必要條件。

3.3 通過調(diào)節(jié)microRNA在NAFLD中發(fā)揮作用 目前，很多研究發(fā)現(xiàn)lncRNA可以通過調(diào)節(jié)microRNA對下游靶基因起調(diào)控作用，從而影響脂代謝通路的上游或下游因子的表達，最終導(dǎo)致脂質(zhì)沉積。核富集豐富的轉(zhuǎn)錄物1(NEAT1)是一種lncRNA，Sun等[18]采用高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠和游離脂肪酸處理的HepG2細胞，建立體內(nèi)外模型。評估兩種NAFLD模型中NEAT1的mRNA水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NEAT1和miRNA-140均在兩種NAFLD模型中上調(diào)。表明miRNA-140-NEAT1軸在NAFLD中被激活。動物實驗發(fā)現(xiàn)miRNA-140或NEAT1沉默可緩解NAFLD。為進一步驗證這些結(jié)論，他們將sh-miRNA-140轉(zhuǎn)染到HepG2細胞來抑制miRNA-140的表達，發(fā)現(xiàn)sh-miRNA-140在降低細胞內(nèi)miRNA-140的表達同時，也可降低NEAT1的表達。此外，轉(zhuǎn)染sh-NEAT1可顯著降低miRNA-140的表達，同時細胞內(nèi)甘油三酯含量明顯下降，油紅O染色顯示細胞內(nèi)脂滴空泡減少，脂質(zhì)合成上下游因子蛋白表達降低。提示lncRNA NEAT1通過調(diào)節(jié)miRNA-140在NAFLD中發(fā)揮了一定作用。

LncRNA-H19是第一個被發(fā)現(xiàn)的lncRNA，具有多種多樣的生物學(xué)功能，參與細胞增殖、分化和代謝的調(diào)控[19]。Liu等[20]研究發(fā)現(xiàn)，在HepG2和Huh-7細胞中用H19 shRNA對H19進行抑制，發(fā)現(xiàn)miRNA-130a在H19敲低細胞中增加。為了確定H19是否直接調(diào)節(jié)miRNA-130a，構(gòu)建了野生型H19的熒光素酶報告載體(H19-WT)和突變體形式(H19-MUT)以進行雙重熒光素酶報道試劑測定。結(jié)果表明，H19與miRNA-130a在這個假定的結(jié)合位點直接相互作用，并且H19可以負調(diào)控miRNA-130a的表達。為了探索miRNA-130a對肝脂肪變性的作用，他們使用miRNA-130a模擬物和miRNA-130a抑制劑處理游離脂肪酸誘導(dǎo)的HepG2和Huh-7細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與游離脂肪酸組相比，在用miRNA-130a模擬物處理的游離脂肪酸誘導(dǎo)的細胞中，與脂肪生成相關(guān)的基因包括過氧化物酶體增殖物活化受體γ、SREBP-1c、SCD-1、ACC1和FAS均下調(diào)，而在miRNA-130a抑制劑組中則顯著上調(diào)。因此，認為lncRNA-H19通過下調(diào)miRNA-130a的表達來促進脂質(zhì)沉積，從而導(dǎo)致NAFLD。

3.4 LncRNA基因表達譜與NAFLD Sookoi等[21]利用第二代測序技術(shù)對與基因組中隨機選擇的lncRNA區(qū)域相關(guān)的遺傳變異進行全面分析，發(fā)現(xiàn)lncRNA(lnc-JAM2-6)中rs2829145A/G與NAFLD嚴重程度相關(guān)。

Sun等[22]通過對10例膽囊結(jié)石患者肝臟取樣進行微陣列分析，發(fā)現(xiàn)在正常對照和NAFLD組肝臟中l(wèi)ncRNA表達譜存在差異。GO和pathway分析表明，這些差異表達的lncRNA可能參與了NAFLD的發(fā)生、發(fā)展，可能有助于闡明NAFLD的分子機制。隨后他們選取7個lncRNA進行驗證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，基因芯片數(shù)據(jù)與PCR定量一致，提示這些lncRNA可能作為NAFLD診斷的生物標志物。

綜上所述，lncRNA對NAFLD影響途徑廣泛，包括直接調(diào)節(jié)靶基因?qū)ο掠沃|(zhì)合成、脂肪酸β氧化基因產(chǎn)生作用，亦或是通過microRNA調(diào)節(jié)靶基因?qū)ο掠沃x因子發(fā)揮作用，還是對基因表觀遺傳的調(diào)節(jié)，都可以影響NAFLD的發(fā)生、發(fā)展進程。然而NAFLD的發(fā)病機制復(fù)雜，目前最廣泛的是“二次打擊”學(xué)說，其發(fā)病機制尚不清楚。人們對lncRNA的認識也十分有限，對其功能和作用機制仍不完全清楚。LncRNA從實驗室走向臨床應(yīng)用仍需要一段探索過程，對于lncRNA與NAFLD關(guān)系的研究近年來雖然有了快速的發(fā)展, 但仍有大量的問題亟待解決。