長(zhǎng)鏈非編碼RNA影響胰島β細(xì)胞功能的研究進(jìn)展

李勛 李強(qiáng)

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院內(nèi)分泌科 150000

糖尿病是一種由多種病因引起的以高血糖為特征的終身代謝性疾病，近幾十年來，隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展和生活方式的改變，全球糖尿病疫情呈急劇上升趨勢(shì)，據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)盟估計(jì)，2015年有4.15億20～79歲的糖尿病患者，有500萬人死于糖尿病，預(yù)計(jì)到2040年，年齡在20～79歲的糖尿病患者將增加到6.42億。糖尿病的流行、糖尿病所致死亡和糖尿病引起的衛(wèi)生開支在全球范圍內(nèi)繼續(xù)上升，對(duì)社會(huì)、財(cái)政和衛(wèi)生體系產(chǎn)生了重要影響[1]。

1 型、2型糖尿病是兩種典型的糖尿病類型，其發(fā)病與胰島β細(xì)胞功能密切相關(guān)。胰島β細(xì)胞的主要功能是產(chǎn)生、儲(chǔ)存和分泌胰島素。1型糖尿病幾乎完全喪失胰島β細(xì)胞功能，2型糖尿病在胰島素抵抗的背景下表現(xiàn)為胰島β細(xì)胞功能缺乏。研究發(fā)現(xiàn)，久患1型糖尿病的患者β細(xì)胞質(zhì)量缺失約90%[2]，久患2型糖尿病的患者β細(xì)胞質(zhì)量缺失約65%[3]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類長(zhǎng)度超過200個(gè)核苷酸的功能性RNA，但不編碼蛋白質(zhì)。Morán等[4]通過轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)了1 128個(gè)人類胰島細(xì)胞基因的高置信度集合，其中55%的基因間lncRNA和40%的反義lncRNA具有胰島特異性。Ku等[5]通過RNA測(cè)序技術(shù)在小鼠胰島中鑒定出1 000多個(gè)基因間lncRNA，大部分具有β細(xì)胞特異性。其中，lncRNA-XLOC_019089僅在β細(xì)胞組織中檢測(cè)到，并且定位于胰腺和十二指腸同源框1(PDX1)位點(diǎn)的反義位置。Bramswig等[6]使用芯片測(cè)序和RNA序列分析進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了12個(gè)β細(xì)胞特異性和5個(gè)α細(xì)胞特異性lncRNA轉(zhuǎn)錄本。通過對(duì)11個(gè)健康人胰島中純化的β細(xì)胞深層RNA測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)132個(gè)lncRNA在β細(xì)胞中相對(duì)于整個(gè)胰島過度表達(dá)，而148個(gè)lncRNA在β細(xì)胞中相對(duì)于非β細(xì)胞過度表達(dá)[7]。大量β細(xì)胞lncRNA的限制性分布表明它們可能起到高度β細(xì)胞特異性的作用，如調(diào)節(jié)表觀遺傳景觀和基因表達(dá)模式，從而決定β細(xì)胞的特性，進(jìn)一步參與糖尿病的發(fā)生、發(fā)展。

1 LncRNA概述

研究發(fā)現(xiàn)，基因組的大部分被轉(zhuǎn)錄成RNA，但只有1%～2%的人類基因組編碼蛋白質(zhì)[8]?；蛐蛄修D(zhuǎn)錄后主要形成由非編碼RNA(ncRNA)組成的巨大分子網(wǎng)絡(luò)，它們?cè)谡婧松锛?xì)胞活動(dòng)調(diào)節(jié)中發(fā)揮核心作用。ncRNA主要分為短鏈ncRNA和lncRNA兩類[9]。其中，長(zhǎng)度大于200 nt的基因序列為lncRNA，lncRNA與mRNA一樣，是由RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄。根據(jù)lncRNA與mRNA之間的關(guān)系，lncRNA可以分為6類：(1)同義lncRNA：與同一鏈上另一轉(zhuǎn)錄物的一個(gè)或多個(gè)外顯子相重疊。 (2)反義lncRNA：如果與編碼基因反義鏈上的轉(zhuǎn)錄物外顯子相重疊，則稱為反義lncRNA。(3)雙向lncRNA：在相同或反向方向與一個(gè)或多個(gè)外顯子重疊，這類lncRNA的表達(dá)起始位點(diǎn)與其互補(bǔ)鏈上相鄰編碼轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)起始點(diǎn)十分靠近。(4)內(nèi)含子lncRNA:轉(zhuǎn)錄自基因的內(nèi)含子區(qū)域。(5)基因間lncRNA：轉(zhuǎn)錄自兩個(gè)基因之間間隔區(qū)的lncRNA。(6)增強(qiáng)子lncRNA：從蛋白質(zhì)編碼基因的增強(qiáng)子區(qū)域轉(zhuǎn)錄而來[9-10]。

目前對(duì)lncRNA的研究結(jié)果表明，lncRNA主要通過3種途徑在基因調(diào)控中發(fā)揮強(qiáng)大的調(diào)控作用：(1)參與染色質(zhì)修飾：在細(xì)胞核中，lncRNA可以通過募集染色質(zhì)修飾復(fù)合物和轉(zhuǎn)錄因子來沉默或增強(qiáng)靶基因表達(dá)[11]。(2)參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控：來自增強(qiáng)子或啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄本lncRNA在調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄過程中起核心作用，包括結(jié)合、收錄、協(xié)調(diào)轉(zhuǎn)錄激活物或抑制物的支架作用。以正義或反義形式通過多種機(jī)制在轉(zhuǎn)錄水平控制基因的表達(dá)，也是調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子活性的輔助因子，還可調(diào)節(jié)RNA聚合酶(RNAP)Ⅱ的活性。(3)參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控：在轉(zhuǎn)錄后水平，lncRNA依靠識(shí)別互補(bǔ)序列的能力，高效專一地與mRNA相互作用，使lncRNA尤其是反義轉(zhuǎn)錄本能參與調(diào)節(jié)mRNA的剪接、編輯、傳輸、翻譯、降解等過程[12]。

2 LncRNA對(duì)胰島β細(xì)胞的調(diào)節(jié)

2.1 LncRNA與胰島β細(xì)胞分化與成熟 胰島lncRNA經(jīng)常出現(xiàn)在胰島富集基因或胰島特異基因的近端，這些基因在β細(xì)胞功能、發(fā)育和轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮作用[4-5]。Morán等[4]發(fā)現(xiàn)在β細(xì)胞成熟過程中存在階段特異性的lncRNA激活現(xiàn)象。β細(xì)胞選擇性高表達(dá)12個(gè)lncRNA，在人胚胎胰腺前體細(xì)胞中均為沉默或低水平表達(dá)，但后來在成年成熟胰島中變得活躍。在已鑒定的12個(gè)lncRNA中，有一半在體外分化過程中保持沉默或在極低水平表達(dá)，但在體內(nèi)成熟過程中被激活。表明胰島lncRNA是β細(xì)胞分化和成熟的重要組成部分，提示β細(xì)胞特異性lncRNA的異常表達(dá)可能會(huì)影響糖尿病的病理生理學(xué)。Morán等[4]對(duì)55個(gè)2型糖尿病易感位點(diǎn)的分析發(fā)現(xiàn)，9個(gè)易感位點(diǎn)包含胰島lncRNA，其中6個(gè)與β細(xì)胞功能障礙直接相關(guān)。胰島lncRNA-HI-LNC25可正向調(diào)節(jié)GLIS家族鋅指3(GLIS3)的表達(dá)，GLIS3編碼一種胰島轉(zhuǎn)錄因子，其基因發(fā)生突變可導(dǎo)致單基因糖尿病[4, 13-14]。此外，Akermana等[15]發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病或糖耐量減低者胰島中PLUTO和PDX1表達(dá)下調(diào)。在人胰島β細(xì)胞系Endoc-BH1和小鼠β細(xì)胞系MIN6中干擾PLUTO表達(dá)，PDX1 mRNA水平均降低。在PLUTO基因敲除后，兩個(gè)遠(yuǎn)上游的增強(qiáng)子與PDX1啟動(dòng)子接觸減少。LncRNA PLUTO可能通過上調(diào)PDX1，進(jìn)而影響β細(xì)胞的發(fā)育和分化。

已有報(bào)道誘導(dǎo)不同來源的干細(xì)胞在體內(nèi)外分化為胰島β樣細(xì)胞，然后移植到糖尿病患者或動(dòng)物模型中，有助于胰島功能的恢復(fù)。Zou等[16]誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUAECs)定向分化為胰島β樣細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)lncRNA ROR通過與microRNA-145的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，能有效維持干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Sox2基因的表達(dá)，保持HUAECs多能性，并調(diào)節(jié)定向胰島β樣細(xì)胞的分化效率[16]。Arnes等[17]研究發(fā)現(xiàn), lncRNA βlinc1基因敲除后導(dǎo)致鄰近的編碼基因Nkx2.2表達(dá)下調(diào)，βlinc1基因在小鼠體內(nèi)的純合缺失將導(dǎo)致重要的胰島轉(zhuǎn)錄因子(Nkx2.2、Pax6、Mafb、Pdx1和NeuroD1等)表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致胚胎發(fā)育過程中β細(xì)胞功能受損，成年小鼠胰島發(fā)育缺陷和葡萄糖穩(wěn)態(tài)受到破壞。

2.2 LncRNA與胰島β細(xì)胞凋亡及增殖 研究發(fā)現(xiàn),在體內(nèi)外條件下，下調(diào)lncRNA TUG1可增加胰島β細(xì)胞凋亡[18]。免疫組織化學(xué)分析顯示，小鼠胰島面積減小，對(duì)MIN6細(xì)胞的研究顯示，敲除lncRNA TUG1基因后，凋亡蛋白酶-3、凋亡蛋白酶-9、凋亡蛋白酶-12表達(dá)顯著增加，抗凋亡蛋白Bcl2表達(dá)顯著減少，lncRNA TUG1可能影響線粒體/細(xì)胞色素C以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)的凋亡通路。此外，研究人員還發(fā)現(xiàn)，lncRNA Meg3基因敲除后，胰島素陽(yáng)性細(xì)胞面積減少，β細(xì)胞凋亡率增加。Sisino等[19]發(fā)現(xiàn)，在原代β細(xì)胞和MIN6細(xì)胞中沉默lncRNA Lnc03，β細(xì)胞增殖被抑制，而過度表達(dá)則刺激β細(xì)胞增殖，認(rèn)為L(zhǎng)nc03調(diào)節(jié)β細(xì)胞生長(zhǎng)。Ruan等[20]發(fā)現(xiàn)在Min6細(xì)胞和db/db小鼠中過表達(dá)lncRNA p3134，可降低胰島β細(xì)胞凋亡率，部分逆轉(zhuǎn)其對(duì)葡萄糖刺激胰島素分泌(GSIS)功能的毒性作用，恢復(fù)db/db小鼠胰島素合成和分泌能力，增加胰島素陽(yáng)性細(xì)胞面積，并且觀察到PDX1、纖維肉瘤癌基因同源物(Mafa)、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(GLUT2)、2型糖尿病易感基因轉(zhuǎn)錄因子7類似物2(TCF7L2)的表達(dá)水平都上調(diào)，認(rèn)為lncRNA p3134對(duì)維持β細(xì)胞功能具有積極作用，對(duì)β細(xì)胞關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子(PDX-1、Mafa、GLUT2和TCF7L2)具有正向調(diào)節(jié)作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)lncRNA p3134可能通過磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號(hào)通路對(duì)GSIS具有保護(hù)作用。

2.3 LncRNA與胰島素分泌和胰島素敏感性 研究發(fā)現(xiàn)，一些lncRNAs能夠調(diào)節(jié)胰島素的分泌和敏感性。Xu等[21]報(bào)道lncRNA SRA能提高脂肪細(xì)胞的胰島素敏感性和胰島素刺激的葡萄糖攝取。機(jī)制可能是SRA調(diào)節(jié)影響胰島素敏感性的各種因子的表達(dá)：SRA在ST2脂肪細(xì)胞中的過表達(dá)抑制了胰島素敏感性的負(fù)調(diào)控因子如細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子(SOCS)-1和SOCS-3的表達(dá)，而促進(jìn)正調(diào)控因子如SH3結(jié)構(gòu)域的表達(dá)，如含有Sorbs1的SH3結(jié)構(gòu)域。此外，升高的SRA增加胰島素刺激的葡萄糖攝取，這與胰島素刺激的Akt和叉頭框蛋白O1(FOXO1)磷酸化增加相關(guān)；相反，使用慢病毒系統(tǒng)敲除SRA基因?qū)е乱种埔葝u素刺激的葡萄糖攝取和胰島素刺激的Akt和FOXO1磷酸化[21]。

LncRNA TUG1參與調(diào)節(jié)胰島素的分泌。Yin等[18]發(fā)現(xiàn)在體外和體內(nèi)條件下，下調(diào)lncRNA TUG1可減少胰島素分泌。在Min-6細(xì)胞中敲除lncRNA TUG1基因?qū)е屡c胰島素合成/分泌相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子mRNA水平降低，如PDX1、神經(jīng)源性分化因子1(NeuroD1)、Mafa和GLUT2。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，母系表達(dá)的小鼠基因3(Meg3)是胰島β細(xì)胞中胰島素合成和分泌相關(guān)的一種新的lncRNA調(diào)節(jié)因子。Meg3基因敲除通過抑制包括PDX-1和Mafa在內(nèi)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)來減少胰島素的產(chǎn)生[22]。Wang等[23]研究表明，核內(nèi)的Meg3能與胰島細(xì)胞中的一種多梳狀抑制復(fù)合物-2的甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2結(jié)合，從而介導(dǎo)Rad21、Smc3和sin3α啟動(dòng)子上H3K27的三甲基化，抑制這些轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)MafA的表達(dá)，影響胰島素的產(chǎn)生。LncRNA Gas5是哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡和生長(zhǎng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，Jin等[24]發(fā)現(xiàn)，lncRNA Gas5在正常小鼠胰腺中表達(dá)相對(duì)較高，在糖尿病小鼠中表達(dá)較低，特別是高血糖時(shí)lncRNA Gas5水平顯著降低。且發(fā)現(xiàn)lncRNA Gas5的表達(dá)水平受葡萄糖濃度動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)，高濃度葡萄糖能抑制lncRNA Gas5的表達(dá)。體內(nèi)外干擾lncRNA Gas5之后，胰島素的生物合成和分泌減少，同時(shí)GLUT2、PDX1和Mafa水平均顯著降低[24]。

綜上所述，lncRNA在調(diào)節(jié)β細(xì)胞特性和功能方面具有很強(qiáng)的相關(guān)性，為糖尿病的診斷和治療提供了一個(gè)新的方向。Ruan等[20]發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者外周血lncRNA p3134水平高于非糖尿病組，并發(fā)現(xiàn)其在血清外泌體中增加了4倍。血清lncRNA具有作為生物標(biāo)志物的特性，且獲取容易，可用于診斷糖尿病。

如今調(diào)控lncRNA已成為可能，如同蛋白編碼基因一樣，可以用RNA干擾技術(shù)抑制lncRNA在體內(nèi)的表達(dá)水平，如反義寡核苷酸(Asos)和鎖定的核酸GapmeRs可以分別用來阻斷l(xiāng)ncRNA的活性或誘導(dǎo)酶介降解[25-26]。而一些胰島富集的lncRNA可調(diào)節(jié)胰島發(fā)育、β細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，可用于對(duì)功能性β細(xì)胞進(jìn)行基因調(diào)控。目前，越來越多的lncRNA被發(fā)現(xiàn)，但大多數(shù)lncRNA作用機(jī)制并不明確，還需進(jìn)一步研究。