支氣管哮喘與嗜酸粒細(xì)胞胞外陷阱

徐莉莉 鄭金旭

江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科,鎮(zhèn)江212001

支氣管哮喘 (哮喘)是一種以持續(xù)氣道炎癥為特征的慢性疾病,伴有嗜酸粒細(xì)胞 (eosinophil,EOS)、中性粒細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞和肥大細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的黏膜浸潤(rùn),以及促炎細(xì)胞因子和脂質(zhì)介質(zhì)的釋放,具有復(fù)雜的表型異質(zhì)性[1-2]。目前,詳盡而精準(zhǔn)的發(fā)病機(jī)制尚未明確。嗜酸粒細(xì)胞胞外陷阱 (eosinophil extracellular trap,EET)是活化的EOS釋放的一種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),在抗微生物宿主反應(yīng)中具有重要作用,在一定情況下 (產(chǎn)生過(guò)量或降解不足時(shí))具有致病性[3-4]。隨著對(duì)EET 的不斷深入研究,新近數(shù)據(jù)表明,EET 可以影響哮喘的轉(zhuǎn)歸。EET 可否作為哮喘的診斷、治療、預(yù)后的一種潛在新靶點(diǎn),本文就EET 與哮喘的關(guān)系進(jìn)行綜述。

1 EOS

EOS是Paul在140年前發(fā)現(xiàn)并命名[5],系骨髓來(lái)源的粒細(xì)胞,含有豐富的顆粒蛋白,如嗜酸粒細(xì)胞衍生神經(jīng)毒素、嗜酸粒細(xì)胞過(guò)氧化物酶、主要堿性蛋白、夏科萊頓晶體等[6-7]。長(zhǎng)期以來(lái),EOS 在疾病中的作用一直是個(gè)謎。隨著研究的不斷深入,人們發(fā)現(xiàn)EOS是哮喘發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵炎癥細(xì)胞,在氣道高反應(yīng)性增加、黏液產(chǎn)生和氣道重塑、組織損傷中起重要作用[8]。大量的臨床研究表明,血液或組織中的EOS增多不僅與哮喘的發(fā)作頻次相關(guān),也是哮喘嚴(yán)重程度的指標(biāo)[9]。哮喘患者支氣管黏膜活檢免疫組織化學(xué)染色顯示,哮喘加重期間有大量活化的EOS及其活化標(biāo)志物[10-11]。然而,EOS在哮喘發(fā)病機(jī)制中的確切作用一直存在爭(zhēng)議。

2 EET

2.1 定義 胞外陷阱是細(xì)胞質(zhì)顆粒中的蛋白質(zhì)修飾去致密DNA 的線狀結(jié)構(gòu)。首次在中性粒細(xì)胞中觀察到該結(jié)構(gòu)現(xiàn)象,與病原體的清除有關(guān)[12-13],是細(xì)胞死亡的一種特殊類型[14]。胞外陷阱被認(rèn)為是一種免疫保護(hù)性宿主防御機(jī)制,尤其是在屏障部位,通過(guò)進(jìn)化得以保留。事實(shí)上,已在植物根尖上發(fā)現(xiàn)含有胞外陷阱樣結(jié)構(gòu),可防止真菌感染[15]。在幾種無(wú)脊椎動(dòng)物中也證明染色質(zhì)胞外陷阱的調(diào)節(jié)釋放可誘捕微生物,并從本質(zhì)上加強(qiáng)了DNA 陷阱作為防御武器在進(jìn)化上是保守的概念[16]。隨后也從固有免疫細(xì)胞家族中看到類似胞外陷阱現(xiàn)象,例如肥大細(xì)胞[17]、單核細(xì)胞[18]、巨噬細(xì)胞[19]和EOS[3,20-22],分別稱為肥大細(xì)胞胞外陷阱、單核細(xì)胞胞外陷阱、巨噬細(xì)胞胞外陷阱和EET。EET 由細(xì)胞外DNA 和捕獲微生物的完整嗜酸粒細(xì)胞顆粒組成[3,23]。

2.2 結(jié)構(gòu) 相對(duì)于中性粒細(xì)胞胞外陷阱 (neutrophil extracellular trap,NET),EET 具有不同特征。在NET 形成過(guò)程中,顆粒膜在細(xì)胞內(nèi)消失,然后中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶和髓過(guò)氧化物酶易位至中性粒細(xì)胞核[14,24]。在中性粒細(xì)胞破裂前,這種細(xì)胞內(nèi)脫顆粒過(guò)程似乎是這些蛋白質(zhì)與核染色質(zhì)結(jié)合的必要條件。相反,EET 形成過(guò)程中,EOS顆粒以完整的結(jié)構(gòu)釋放,EOS顆粒蛋白主要保留在釋放的顆粒內(nèi)。掃描電鏡顯示,NET 由5～10 nm 平滑圓柱狀核小體和直徑25～50 nm 的球形結(jié)構(gòu)組成[13,25],而EET 主要由直徑為25～35 nm 的纖維結(jié)構(gòu)組成[26]。在NET 中,核心組蛋白是最豐富的蛋白質(zhì),占所有NET 相關(guān)蛋白的70%。長(zhǎng)鏈DNA 包裹在核心組蛋白周圍,形成 “串珠狀”的核小體結(jié)構(gòu)通過(guò)組蛋白的蛋白酶處理,促進(jìn)囊性纖維化患者痰中NET 的DNA 染色質(zhì)解聚[27]。使用針對(duì)核連接蛋白組蛋白H1的抗體染色顯示EET 均勻染色,表現(xiàn)為完整的DNA 三維結(jié)構(gòu)[28]。一旦聚集物形成,EET 介導(dǎo)的DNA陷阱在數(shù)天內(nèi)非常穩(wěn)定,保持其形狀超過(guò)7 d。相比之下,中性粒細(xì)胞DNA 陷阱表現(xiàn)為自發(fā)分離,更易受到白蛋白或DNA 酶處理的影響。因此,可認(rèn)為EET 是非常保守的,核小體對(duì)人類EOS有限的蛋白酶降解能力不太敏感。

2.3 機(jī)制 EOS以NADPH 氧化酶依賴的方式釋放EET,與活性氧的產(chǎn)生有關(guān)[4,26,29],體外分離EOS需要用IL-5或γ干擾素啟動(dòng),再用脂多糖、EOS趨化因子或補(bǔ)體因子5a短暫刺激形成EET[3]。最近有學(xué)者認(rèn)為,在EOS 黏附的情況下,胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素和金黃色葡萄球菌可強(qiáng)烈刺激EET 的產(chǎn)生[30]。EOS對(duì)于不同的刺激釋放DNA 的時(shí)間不同,例如金黃色葡萄球菌,在體外對(duì)分離的EOS刺激,EET 在15 min內(nèi)從活細(xì)胞中彈射出來(lái)[31]。相比之下,脂多糖、IL-5 或γ 干擾素刺 激EOS 在1～11 s 內(nèi) 釋 放EET[3]。

人們發(fā)現(xiàn)EET 的DNA 來(lái)源存在差異?；罨腅OS以非細(xì)胞溶解彈射器的方式釋放線粒體DNA[3]。但又有人對(duì)線粒體源性DNA 提出質(zhì)疑,首先由于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的高流體阻力,線粒體DNA 的小顆粒排出所需能量高;其次人類EOS含少量線粒體 (24～36個(gè)/細(xì)胞,而肝細(xì)胞則為1 300個(gè)/細(xì)胞),所能釋放的線粒體DNA 少;線粒體DNA 缺乏保護(hù)性組蛋白和有限的DNA 修復(fù)機(jī)制,極易受到活性氧介導(dǎo)的損傷[32-34]。Ueki等[26]最近發(fā)現(xiàn)大多數(shù)EET 的DNA組成起源于細(xì)胞核。關(guān)于EOS在受到刺激后啟動(dòng)何種機(jī)制選擇性地發(fā)生EET 的精準(zhǔn)識(shí)別,尚需要進(jìn)一步的研究。

2.4 EOS的命運(yùn):死亡還是存活? 目前關(guān)于形成和釋放EET 的細(xì)胞命運(yùn)有2 種看法。Ueki等通過(guò)免疫熒光透射電鏡和共聚焦顯微鏡觀察到溶解的EOS釋放類似網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。由于EET 的形成與EOS溶解同時(shí)發(fā)生,細(xì)胞則被認(rèn)為經(jīng)歷了壞死性死亡[26,29]。COPD 患者的誘導(dǎo)痰實(shí)驗(yàn)中證實(shí)EET 的存在,且增加的EOS 游離顆粒和細(xì)胞碎片與EET 相關(guān)[20]。另一種就是EET 的形成并不總是伴隨著細(xì)胞死亡[35]。如Yousefi等[3]所述,EET 是從活EOS釋放。EET 的形成與細(xì)胞骨架重塑無(wú)關(guān),因?yàn)榧?xì)胞松弛素D 對(duì)EET 的釋放無(wú)抑制作用[3]。Gevaert等[36]報(bào)告的EET+活EOS的比例 (占總EOS的8.8%)與Erjef?lt等[37]報(bào)告的具有膜結(jié)合的嗜酸顆粒簇的溶解性EOS的百分比 (9.9%)相似。夏科萊頓晶體是活躍EOS炎癥的典型特征,顯示與EET 密切相關(guān)[38]。有些EET 可能從活細(xì)胞中釋放出來(lái),而有些則從溶解 (壞死)細(xì)胞中釋放出來(lái)。總之,EET 的形成過(guò)程在形態(tài)學(xué)和功能上不同于任何形式的程序性細(xì)胞死亡。

3 EET與哮喘

Dworski等[22]首次在哮喘患者氣道活檢中發(fā)現(xiàn)有EET的表達(dá),且與EOS浸潤(rùn)有關(guān)。此外,Cunha等[39]觀察到哮喘小鼠氣道中EET 的形成。免疫熒光顯微鏡分析顯示哮喘小鼠支氣管肺泡灌洗液 (bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中EOS 釋放與嗜酸粒細(xì)胞過(guò)氧化物酶共定位的EET。EET 具有自分泌作用,可誘導(dǎo)EOS進(jìn)一步脫顆粒,并激活上皮細(xì)胞釋放促炎細(xì)胞因子[39]。EET 的產(chǎn)生增加可通過(guò)增加黏液的黏度而導(dǎo)致氣道阻塞,降低哮喘患者的肺功能[40]。實(shí)驗(yàn)性哮喘動(dòng)物模型中,N-乙酰半胱氨酸和二苯碘銨干預(yù)研究顯示BALF中EET 的形成減少。N-乙酰半胱氨酸是谷胱甘肽的前體,降低了肺內(nèi)活性氧的形成,進(jìn)而降低EET 的形成。二苯碘銨抑制NADPH 氧化酶,減少活性氧的形成[40]。哮喘中EET 的形成需要活性氧的參與[30,40]。EET 在哮喘氣道的固有免疫和誘導(dǎo)組織損傷中發(fā)揮作用[3,22,36]。哮喘小鼠氣道中EET 的形成需要自噬,抑制自噬能顯著改善氣道炎癥、呼吸系統(tǒng)力學(xué)、氧化應(yīng)激、Na+-K+-ATP酶活性,并減少EET 的釋放[41]。呼吸道病毒感染是哮喘惡化的主要原因。用呼吸道病毒刺激體外培養(yǎng)的卵清白蛋白組BALF 中EOS胞外DNA 濃度升高,相比對(duì)照組,顯示呼吸道病毒在體外增加了哮喘小鼠BALF細(xì)胞中EET 的釋放,這可能是哮喘發(fā)作時(shí)氣道阻塞和組織損傷的原因之一[41]。

4 EET與重癥哮喘

在重癥哮喘和非重癥哮喘患者EET 特征和功能研究中,發(fā)現(xiàn)重癥哮喘患者外周血EOS比非重癥哮喘患者外周血EOS更易激活產(chǎn)生EET[42]。重癥哮喘患者的EET 水平在體外對(duì)氣道上皮細(xì)胞和鄰近EOS有促炎作用[42]。EET+EOS的百分比與基線、第1秒用力呼氣容積占預(yù)計(jì)值百分比呈負(fù)相關(guān)[42]。重癥哮喘患者的EET+EOS計(jì)數(shù)和外周血2型固有淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯高于非重癥哮喘患者。EET 可通過(guò)激活2型固有淋巴細(xì)胞和氣道上皮細(xì)胞在重癥哮喘持續(xù)氣道炎癥的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[43]。2型固有淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)是哮喘氣道EOS活化的主要途徑之一,該反應(yīng)參與了類固醇抵抗的發(fā)展[44]。在Th2 環(huán)境中,EET可能是自身抗原的潛在來(lái)源,發(fā)揮促炎效應(yīng),它可能形成一個(gè)惡性循環(huán)[39,43]。體外實(shí)驗(yàn)顯示,藥物相關(guān)濃度的地塞米松不能減少自身抗體誘導(dǎo)的EET 形成,提示激素抵抗哮喘患者持續(xù)炎癥的可能機(jī)制[43]。此外,由于這種持續(xù)的炎癥環(huán)境,EET 誘導(dǎo)的炎癥延遲消退可能潛在地觸發(fā)自身反應(yīng)性,并啟動(dòng)針對(duì)其產(chǎn)物 (如DNA、組蛋白和顆粒蛋白)的自身抗體的產(chǎn)生,如最近在重癥哮喘氣道中的報(bào)告[44-45]。EET 或?qū)橹匕Y哮喘的研究提供新的靶點(diǎn),但具體分子機(jī)制仍需深入研究。

5 展望

EET 可被視為一把雙刃劍,提供了宿主抵抗感染,同時(shí)導(dǎo)致細(xì)胞和組織損傷的固有免疫的重要機(jī)制。EET 與哮喘的發(fā)生發(fā)展相關(guān),而且發(fā)現(xiàn)重癥哮喘EET 更明顯。未來(lái)的研究將集中在哮喘EET 途徑的詳細(xì)機(jī)制,以及EET 與其病理生理過(guò)程的相互作用,精準(zhǔn)開(kāi)發(fā)EET 抑制劑或調(diào)節(jié)劑作為治療哮喘的一種新的治療策略,在尋求新的治療人類哮喘的過(guò)程中,有機(jī)會(huì)開(kāi)辟新的路徑。針對(duì)哮喘EET 的研究是一個(gè)令人興奮的領(lǐng)域,仍有許多懸而未決的問(wèn)題需要在未來(lái)的研究中仔細(xì)和批判性地解決,以便更好地將EET 研究從實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)化為臨床并為臨床服務(wù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突