發(fā)酵香腸中分離純化的三株乳酸菌產(chǎn)酸特性研究

吉莉莉，魏艷，何丹，陳雪玲，付婷婷，張崟，趙黎明

(1.成都大學(xué)肉類(lèi)加工四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610106；2.華東理工大學(xué) 發(fā)酵工業(yè) 分離提取技術(shù)研發(fā)中心，生物反應(yīng)器工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237)

聚乳酸(PLA)是以微生物發(fā)酵產(chǎn)物L(fēng)-乳酸為單體聚合成的一類(lèi)聚合物，有獨(dú)特的生物降解和生物相容性，在生物體內(nèi)可被水解成乳酸和乙酸，并經(jīng)機(jī)體內(nèi)酶代謝為二氧化碳和水[1-3]，代謝產(chǎn)物不會(huì)造成環(huán)境污染。近年來(lái)，聚乳酸材料在食品包裝材料、藥物、生物醫(yī)學(xué)等方面應(yīng)用廣泛[4-6]。天然的乳酸菌所產(chǎn)生的乳酸具有合成聚乳酸的潛力，更加保證了原料的天然性、安全性和環(huán)保性。

乳酸菌是發(fā)酵肉制品中的優(yōu)勢(shì)菌群，其主要作用是將肉制品中的糖類(lèi)通過(guò)發(fā)酵轉(zhuǎn)化為乳酸，進(jìn)而使發(fā)酵肉制品的pH下降，起到抑制腐敗菌生長(zhǎng)的作用[7-9]。鑒于乳酸菌為發(fā)酵香腸的優(yōu)勢(shì)菌種，我們從發(fā)酵香腸中分離鑒定出了3株乳酸菌。為了進(jìn)一步分析所得乳酸菌的產(chǎn)酸能力，本文對(duì)其產(chǎn)酸性能及生長(zhǎng)特性進(jìn)行了研究。以期為工業(yè)化發(fā)酵制備乳酸，并將其用于聚乳酸類(lèi)可降解材料的制備提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種

試驗(yàn)所用3株菌株均分離于實(shí)驗(yàn)室四川傳統(tǒng)發(fā)酵香腸，分別為1號(hào)糞腸球菌(SIIA9047，Enterococcusfaecalis)、3號(hào)戊糖片球菌(SIIA9048，Pediococcuspentosaceus)和4號(hào)腸膜明串珠菌(SIIA9049，Leuconostocmesenteroides)。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑

L-乳酸標(biāo)準(zhǔn)品：Sigma-Aldrich公司；MRS液體培養(yǎng)基：杭州微生物試劑有限公司；氯化鈉、磷酸、氫氧化鈉：成都市科隆化學(xué)品有限公司；pH標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.1.3 主要試驗(yàn)儀器與設(shè)備

UV-1100紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；PHS-3C-01酸度計(jì) 上海三信儀表廠；YX-1 SHDD手提式高壓滅菌鍋 江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；WPS-3000SL高效液相色譜儀 賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 生長(zhǎng)曲線的繪制

將待測(cè)菌株以5.0 log CFU/mL分別接種于500 mL MRS培養(yǎng)基中，調(diào)整濃度至5.0 log CFU/mL，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，以 MRS 液體培養(yǎng)基為空白對(duì)照，每隔1 h在600 nm下測(cè)定菌液的OD值，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.2 產(chǎn)酸能力的測(cè)定

將待測(cè)菌株以5.0 log CFU/mL分別接種于250 mL MRS培養(yǎng)基中，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，無(wú)菌取5 mL菌液，用酸度計(jì)測(cè)定菌液pH值，測(cè)10 d。

1.2.3 乳酸含量的測(cè)定

色譜分析條件：C18色譜柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)，柱溫：35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；進(jìn)樣量：20 μL；流速：0.8 mL/min；流動(dòng)相：乙腈∶pH 2.0 磷酸溶液為2∶98(體積比)，配好后抽濾超聲脫氣待用[10]。

樣品處理：取培養(yǎng)0，12，24，48 h的菌液2 mL，置于100 mL容量瓶中，加入70 mL水，在50 ℃的水浴中超聲20 min，冷卻至室溫，用水定容至刻度，搖勻，用0.45 μm濾膜過(guò)濾，濾液裝入液相樣品瓶中待測(cè)。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精密稱(chēng)取L-乳酸標(biāo)準(zhǔn)品，配制成8，2，0.5，0.125，0.0313，0.0078 g/L濃度的溶液，在高效液相色譜儀中進(jìn)行含量測(cè)定，并以峰面積-含量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算培養(yǎng)基中乳酸含量。

1.2.4 耐鹽、耐亞硝酸鹽性能測(cè)定

將待測(cè)菌種以5.0 log CFU/mL分別接種于質(zhì)量濃度為0，2，4，6 g/dL NaCl及質(zhì)量濃度為0，5，10，15 mg/dL NaNO2的MRS培養(yǎng)基中，每種培養(yǎng)基250 mL，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，在600 nm下測(cè)定菌液OD值的變化。利用OD-乳酸菌數(shù)量標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出菌液濃度。

1.2.5 不同溫度下菌株的生長(zhǎng)能力測(cè)定

將待測(cè)菌種以5.0 log CFU/mL分別接種于250 mL MRS培養(yǎng)基中，置于4，10，20，30，40 ℃條件下恒溫培養(yǎng)24 h，在600 nm下測(cè)定菌液OD值的變化。利用OD-乳酸菌數(shù)量標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出菌液濃度。

1.2.6 不同pH值下菌株的生長(zhǎng)能力測(cè)定

將待測(cè)菌種以5.0 log CFU/mL分別接種于250 mL pH 2.5，4.5，5.5，6.5的MRS培養(yǎng)基中，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，在600 nm下測(cè)定菌液OD值的變化。利用OD-乳酸菌數(shù)量標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出菌液濃度。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)組設(shè)置3個(gè)重復(fù)組，所測(cè)得的數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)IBM SPSS Statistics 24分析，并以平均值±相對(duì)偏差表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株生長(zhǎng)曲線的繪制

經(jīng)過(guò)0～24 h，每隔1 h對(duì)3株菌株的OD值進(jìn)行測(cè)定，繪制出3株菌的生長(zhǎng)曲線，見(jiàn)圖1。

圖1 菌株生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curves of strains

由圖1可知，3號(hào)和4號(hào)菌的生長(zhǎng)曲線呈現(xiàn)較強(qiáng)的生長(zhǎng)能力，1號(hào)菌處于3株菌的最低水平，在8 h后3號(hào)和4號(hào)菌的生長(zhǎng)速度顯著高于1號(hào)菌，3號(hào)和4號(hào)菌在18 h后趨于緩慢生長(zhǎng)，生長(zhǎng)曲線較平緩，1號(hào)菌從17 h后生長(zhǎng)速度減緩，菌的OD值變化不大。由此可見(jiàn)，遲緩期1號(hào)菌為0～5 h，3號(hào)菌為0～2 h，4號(hào)菌為0～3 h；對(duì)數(shù)期1號(hào)菌為6～17 h，3號(hào)菌為3～18 h，4號(hào)菌為4～18 h；穩(wěn)定期1號(hào)菌為17 h后，3號(hào)菌為18 h后，4號(hào)菌也為18 h后，由于監(jiān)測(cè)時(shí)間有限，未檢測(cè)到乳酸菌的衰亡期。這與文獻(xiàn)[11]所檢測(cè)的青貯飼料中乳酸菌有所差異，可能是由于菌種不同所引起的。

2.2 菌株的產(chǎn)酸能力比較

圖2 菌株產(chǎn)乳酸量Fig.2 Quantity of lactic acid produced by lactic acid bacteria

圖3 菌株的產(chǎn)酸曲線Fig.3 Acid production curves of lactic acid bacteria

由圖2和圖3可知，3株菌在培養(yǎng)初期 pH值的下降速度最為迅速，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，趨勢(shì)逐漸變緩，到最后幾乎沒(méi)變化。3株菌在12 h內(nèi)產(chǎn)酸能力最強(qiáng)，在48 h內(nèi)1號(hào)菌產(chǎn)乳酸量持續(xù)增加，3號(hào)、4號(hào)菌則有所下降。結(jié)合3株菌的生長(zhǎng)曲線，1號(hào)菌生長(zhǎng)速度最慢，但產(chǎn)乳酸量最多，且第2天pH已經(jīng)降到4.0以下，產(chǎn)酸能力最強(qiáng)；3號(hào)和4號(hào)菌產(chǎn)酸能力則弱于1號(hào)菌。Garriga認(rèn)為，在發(fā)酵肉制品中，產(chǎn)酸能力是篩選乳酸菌的一個(gè)重要指標(biāo)，發(fā)酵所產(chǎn)的乳酸使產(chǎn)品的pH下降，抑制腐敗菌的生長(zhǎng)，提高產(chǎn)品安全[12]。乳酸菌產(chǎn)生的酸還能夠賦予發(fā)酵肉制品特征性的酸味[13]。而且，用于發(fā)酵肉制品的乳酸菌，為了抑制病原菌，保證產(chǎn)品質(zhì)量，要求在24 h內(nèi)能使pH降到5.0以下[14]。在發(fā)酵肉制品中篩選乳酸產(chǎn)量高的乳酸菌，可以為聚乳酸提供更加安全的食品級(jí)原料，保證乳酸原料的安全與環(huán)保性。

2.3 菌株對(duì)NaCl的耐受性

菌株對(duì)不同質(zhì)量濃度NaCl的耐受性見(jiàn)表1。

表1 菌株對(duì)不同質(zhì)量濃度NaCl的耐受性Table 1 Tolerance of strains to different concentration of NaCl

注：表中數(shù)值為菌株在相應(yīng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h所得發(fā)酵液中菌液濃度(log CFU/mL)。

由表1可知，隨著培養(yǎng)基中NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，3株菌的生長(zhǎng)受到了不同程度的抑制，雖然還能繼續(xù)生長(zhǎng)，但是鹽濃度越高，生長(zhǎng)情況越差，說(shuō)明這3株菌的生長(zhǎng)受鹽含量的影響較大。當(dāng)NaCl質(zhì)量濃度增加到6 mg/dL時(shí)，3株菌的菌液濃度分別降低了43.14%、27.58%、38.32%，3號(hào)菌受到的影響最小，耐鹽性最好，4號(hào)次之。

2.4 菌株對(duì)NaNO2的耐受性

肉制品中常用NaNO2作防腐劑、發(fā)色劑。因此，肉制品發(fā)酵所用的菌株對(duì)NaNO2有一定的耐受性[15，16]。菌株對(duì)不同質(zhì)量濃度NaNO2的耐受性見(jiàn)表2。

表2 菌株對(duì)不同質(zhì)量濃度NaNO2的耐受性Table 2 Tolerance of strains to different concentration of NaNO2

注：表中數(shù)值為菌株在相應(yīng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h所得發(fā)酵液中菌液濃度(log CFU/mL)。

由表2可知，3株菌均符合要求，隨著培養(yǎng)基中NaNO2添加量的增大，3株菌均受到了不同程度的影響。在NaNO2質(zhì)量濃度達(dá)到15 mg/dL時(shí)，3號(hào)和4號(hào)菌的生長(zhǎng)情況較好，所受影響很小，對(duì)NaNO2的耐受性好，1號(hào)菌受到的影響最大，生長(zhǎng)受到抑制，但也能生長(zhǎng)，對(duì)NaNO2的耐受性較好。

2.5 菌株在不同溫度條件下的生長(zhǎng)能力

菌株在不同溫度條件下的生長(zhǎng)能力見(jiàn)圖4。

圖4 分離菌株在不同溫度下的生長(zhǎng)能力Fig.4 Growth ability of isolated strains at different temperatures

發(fā)酵肉制品的發(fā)酵劑一般要求能在15～40 ℃條件下生長(zhǎng)，低溫下也能有較強(qiáng)的生長(zhǎng)能力，最適生長(zhǎng)溫度范圍為30～37 ℃[17]。由圖4可知，1號(hào)和4號(hào)菌受溫度的影響比3號(hào)菌大，雖然不同的菌株受溫度的影響不同，但是3株菌的耐熱趨勢(shì)變化卻一致。在4,10,20 ℃條件下生長(zhǎng)能力較弱，隨著溫度增加，菌株生長(zhǎng)能力加強(qiáng)，在30 ℃時(shí)生長(zhǎng)情況最好，溫度繼續(xù)增加，在40 ℃時(shí)，菌株的生長(zhǎng)能力不及30 ℃時(shí)強(qiáng)，但比低溫情況下好，說(shuō)明這3株菌的生長(zhǎng)較耐高溫。

2.6 菌株在不同pH值條件下的生長(zhǎng)能力

菌株在不同pH值條件下的生長(zhǎng)能力見(jiàn)圖5。

圖5 分離菌株在不同pH值條件下的生長(zhǎng)能力Fig.5 Growth ability of isolated strains at different pH values

肉制品發(fā)酵結(jié)束后，其pH值多低于5.3[18]，菌株能在酸性條件下生長(zhǎng)。而隨著菌株生長(zhǎng)，pH越來(lái)越低，是否能夠耐酸性條件生長(zhǎng)對(duì)于乳酸產(chǎn)量影響非常重要。由圖5可知，在pH 3.5條件下，菌株均受到抑制，但能繼續(xù)生長(zhǎng)，在pH 4.5時(shí)，菌株受到的抑制變小，尤其是4號(hào)菌，生長(zhǎng)情況最好，pH繼續(xù)增大，1號(hào)和3號(hào)菌的生長(zhǎng)情況明顯變好，但4號(hào)菌的生長(zhǎng)情況卻不如在pH 4.5的條件下，可能是因?yàn)閜H 4.5更接近于4號(hào)菌的最適生長(zhǎng)pH。綜上，3株菌均能在pH 4.5的條件下較好地生長(zhǎng)。

3 結(jié)論

由以上研究試驗(yàn)可知，從發(fā)酵肉制品中分離得到的1號(hào)糞腸球菌(SIIA9047，Enterococcusfaecalis)、3號(hào)戊糖片球菌(SIIA9048，Pediococcuspentosaceus)和4號(hào)腸膜明串珠菌(SIIA9049，Leuconostocmesenteroides)均有較好的產(chǎn)乳酸能力，其中1號(hào)菌產(chǎn)生乳酸含量最高，在對(duì)鹽分及亞硝酸鹽耐受性上，3株菌各有優(yōu)勢(shì)。天然的乳酸菌產(chǎn)生的乳酸合成的聚乳酸更加保證了原料的天然性、安全性和環(huán)保性。聚乳酸作為近年來(lái)發(fā)展最迅速的可生物降解材料，在一次性餐飲行業(yè)的應(yīng)用上具有巨大的發(fā)展?jié)摿?，正受到越?lái)越多的關(guān)注。本研究結(jié)果為開(kāi)發(fā)肉制品發(fā)酵劑和傳統(tǒng)肉制品加工以及工業(yè)化發(fā)酵制備乳酸并將其用于聚乳酸類(lèi)可降解材料的制備提供了一定的依據(jù)。