紅糖HPLC-DAD指紋圖譜與化學(xué)模式識別

陳其釗，陳紅香*，陳嘉敏，王桂華，李家威，余構(gòu)彬

(1.廣東省生物工程研究所(廣州甘蔗糖業(yè)研究所)，廣東省甘蔗改良與生物煉制 重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510316；2.國家糖業(yè)質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，廣州 510316)

紅糖是以甘蔗為原料經(jīng)壓榨、“連環(huán)鍋”熬煮、石灰澄清、過濾除雜、蒸發(fā)濃縮、攪拌起晶后形成的非分蜜糖。因沒有經(jīng)過高度精練，紅糖營養(yǎng)成分比白砂糖高很多，由于其除糖外還含有維生素和微量元素，如鐵、鋅、錳、鉻等[1,2]?！侗静菥V目》中記載：沙糖性溫，和脾緩肝。中醫(yī)認(rèn)為，紅糖性溫、味甘、入脾，具有益氣補(bǔ)血、健脾暖胃、緩中止痛、活血化瘀的作用，尤其適合年老體弱、大病初愈、月經(jīng)不調(diào)的人群以及產(chǎn)婦食用[3,4]。日本美容醫(yī)生認(rèn)為，含有紅糖成分的面膜的美容效果比流行的激光祛斑、果酸換膚等更好[5]，因其蘊(yùn)含的胡蘿卜素、核黃素、煙酸、氨基酸、葡萄糖等成分對細(xì)胞有強(qiáng)效抗氧化及修護(hù)的作用，能預(yù)防黑色素生成，持續(xù)美白等。紅糖中的一些酚類物質(zhì)和抗氧化物質(zhì)還可以清除自由基，維護(hù)細(xì)胞的正常功能和新陳代謝[6]。此外，其中還含有某些可以有效調(diào)節(jié)體內(nèi)各種色素代謝過程的天然酸類和色素調(diào)節(jié)物質(zhì)。

現(xiàn)代指紋圖譜技術(shù)應(yīng)用于鑒定、溯源、質(zhì)量控制工作，主要原理是將研究對象的指紋圖譜和對照指紋圖譜進(jìn)行相似性評價(jià)，即比較兩者間的差異性和共性，從而實(shí)現(xiàn)質(zhì)量控制等目的[7]。通過指紋圖譜的特征性，能更有效甄別樣品；通過對指紋圖譜的共有峰進(jìn)行對比監(jiān)控，能有效控制樣品的質(zhì)量，確保樣品質(zhì)量的相對穩(wěn)定。指紋圖譜應(yīng)用于中藥鑒定領(lǐng)域的技術(shù)體系已比較成熟，現(xiàn)也逐漸應(yīng)用于食品鑒別領(lǐng)域中，目前應(yīng)用比較多的是茶葉、食用菌、調(diào)味料以及肉類這幾類食品的品質(zhì)鑒定上[8-16]，準(zhǔn)確度、可靠度、可行性都比較高。

本試驗(yàn)采用高效液相色譜法，建立了21批紅糖樣品的指紋圖譜，并結(jié)合聚類分析和主成分分析為紅糖產(chǎn)品進(jìn)行綜合評價(jià)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

無水乙醇、磷酸二氫鈉、磷酸氫二銨、磷酸：分析純；甲醇、乙腈：色譜純，默克公司；pH計(jì)：梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國IKA公司；e2695高效液相色譜儀：美國沃特世公司。

21批次紅糖樣品均來自2017-2019年廣東、廣西、云南3個不同產(chǎn)地的企業(yè)的送檢(見表1)。

表1 紅糖樣品來源Table 1 The source of brown sugar samples

續(xù) 表

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱：MYCOTOXTM反相C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動相：A 0.1 mol/L磷酸二氫鈉(pH 2.3)∶B乙腈為98∶2，等度洗脫。檢測波長：210 nm；柱溫：30 ℃；流速：0.5 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL。

1.2.2 供試品溶液的制備

稱取10 g樣品，以無水乙醇100 mL作為提取溶液，攪拌，至完全溶解(約30 min)，用濾紙過濾，去掉不溶物，將濾液置于雞心瓶中于40 ℃旋干，得到固體。將得到的干燥固體以超純水做溶劑，配制成10 mg/mL的待測溶液，以0.22 μm微孔濾膜過濾，得到供試液溶液。

1.3 HPLC指紋圖譜的方法學(xué)考察

1.3.1 精密度試驗(yàn)

取同一批次紅糖樣品溶液(編號：S1)，連續(xù)進(jìn)樣6次，選取9號色譜峰為參照峰。計(jì)算各共有峰相對峰面積和相對保留時(shí)間的RSD值。

1.3.2 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批次紅糖樣品溶液(編號：S1)共6份，按1.2.1項(xiàng)下色譜條件分別測定，記錄保留時(shí)間和峰面積。

1.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批次紅糖樣品溶液(編號：S1)，分別在0,2,4,6,8,12,24 h，按1.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅糖指紋圖譜的測定

指紋圖譜方法學(xué)考察表明無論精密度試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)還是穩(wěn)定性試驗(yàn)，各共有峰相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD均小于3%，表明精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性良好，符合指紋圖譜研究的技術(shù)要求。

分別取不同廠家的21批紅糖樣品，按1.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣測定，記錄各批次供試品溶液的全波長指紋圖譜并對21批次紅糖樣品的紫外色譜指紋圖譜相關(guān)參數(shù)進(jìn)行比較，對樣品中峰面積較穩(wěn)定且各樣品中共有的色譜峰進(jìn)行標(biāo)定。

2.2 指紋圖譜共有模式的建立

將得到的色譜圖導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)軟件(2012年版)，對選定的HPLC圖譜進(jìn)行多點(diǎn)校正，自動匹配，建立不同產(chǎn)地紅糖HPLC指紋圖譜，并計(jì)算相似度值，結(jié)果見圖1、圖2和表1。其中出峰時(shí)間基本一致、峰面積相對較大的13個色譜峰被設(shè)為特征共有峰，9號峰的分離度較好并且峰形對稱，所以選擇其為參照峰。21批樣品共有峰相對保留時(shí)間、相對峰面積范圍見表2。

圖1 21批紅糖樣品HPLC-PDA色譜指紋圖譜Fig.1 HPLC-PDA fingerprint spectra of 21 batches of brown sugar samples

圖2 紅糖的HPLC-PDA對照指紋圖譜Fig.2 HPLC-PDA control fingerprint spectra of brown sugar

表2 21批樣品共有峰的相對峰面積Table 2 Relative peak area of common peaks of 21 batches of samples

2.3 指紋圖譜的相似度評價(jià)

由表1可知，不同產(chǎn)地紅糖的指紋圖譜相似度在0.480～0.985之間，說明不同產(chǎn)地的紅糖所含的化學(xué)成分和質(zhì)量有一定的區(qū)別。紅糖的質(zhì)量分級是以總糖分作為指標(biāo)，從相似度看，不同等級紅糖間的圖譜整體面貌基本一致，個別樣品比較突出，說明產(chǎn)品質(zhì)量受產(chǎn)地、氣候、生態(tài)環(huán)境及廠家生產(chǎn)工藝的影響。

2.4 聚類分析

將21批不同產(chǎn)地的紅糖樣品13個共有峰相對峰面積導(dǎo)入SPSS 19.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)聚類，采用組間聯(lián)接法，以歐氏距離(Euclidean Distance)作為樣品分類依據(jù)對其進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，得到聚類樹狀圖，見圖3。

圖3 聚類分析樹狀圖Fig.3 Dendrogram of cluster analysis

由圖3可知，當(dāng)類間距離大于20時(shí)，21批紅糖樣品聚為A，B兩大類，其中A類分為A1類和A2類，S8、S9、S10、S12、S13、S14、S18聚為A1類，S1、S4、S5、S6、S7、S11、S15、S16、S17、S19、S21聚為A2類，S2、S3、S20聚為B類。

2.5 主成分分析

本試驗(yàn)將21批樣品的13個共有峰峰面積導(dǎo)入SPSS 19.0軟件，計(jì)算相關(guān)系數(shù)矩陣、特征值和方差貢獻(xiàn)率，進(jìn)行主成分分析，并將特征值大于1的成分提取出來，得到數(shù)個主成分，結(jié)果見表3和表4。

表3 特征值與貢獻(xiàn)率Table 3 Eigenvalues and contribution rates

表4 旋轉(zhuǎn)后公共因子載荷矩陣Table 4 Public factor loading matrix after rotation

由表3可知，前3個主成分特征值大于1，對方差的累積貢獻(xiàn)率為85.593%，因此可見紅糖的多個成分可以簡化為3個主成分進(jìn)行分析。載荷的絕對值越大，對主成分的貢獻(xiàn)越大。由表4可知，峰4和峰10在主成分1上有較高的載荷，峰1和峰2在主成分2上有較高的載荷，峰6在主成分3上有較高的載荷(載荷絕對值大于0.8)。

2.6 綜合質(zhì)量評分

由表5可知，S21樣品主成分因子綜合得分最高，該批樣品中成分 3,4,5,7,9,10,12,13的含量相對較高，整體質(zhì)量相對較好。

2.7 OPLS-DA

偏最小二乘法是一種化學(xué)計(jì)量學(xué)統(tǒng)計(jì)方法，廣泛應(yīng)用于代謝組學(xué)中，其所建立的數(shù)學(xué)模型能對“多靶點(diǎn)、多成分和整體作用”的研究對象的化學(xué)成分和生物活性物質(zhì)之間的聯(lián)系進(jìn)行有效分析[18，19]。

將3個產(chǎn)地的紅糖指紋圖譜中標(biāo)定的13個共有峰的峰面積導(dǎo)入SIMCA-P 14.0軟件中進(jìn)行分析，建立的模型的R2為0.74，Q2為0.481，為了進(jìn)一步分析，將3個產(chǎn)地進(jìn)行兩兩對比，作OPLS-DA分析得到的得分圖，見圖4～圖6。

圖4 廣東-廣西紅糖OPLS-DA分析得力圖Fig.4 OPLS-DA score plot of brown sugar in Guangdong-Guangxi Province

圖5 廣東-云南紅糖OPLS-DA分析得力圖Fig.5 OPLS-DA score plot of brown sugar in Guangdong-Yunnan Province

圖6 廣西-云南紅糖OPLS-DA分析得力圖Fig.6 OPLS-DA score plot of brown sugar in Guangxi-Yunnan Province

由圖4～圖6可知，不同產(chǎn)地的成分構(gòu)成模式大致可以區(qū)分開。

根據(jù)主成分分析結(jié)果，選出了兩個主成分，依據(jù)離原點(diǎn)越遠(yuǎn)的點(diǎn)對分組貢獻(xiàn)越大的原則，結(jié)合由OPLS-DA分析得到的變量投影重要性指標(biāo)(VIP)值，見表6。

表6 3個產(chǎn)地的紅糖OPLS-DA分析的VIP值表Table 6 VIP values of OPLS-DA analysis of brown sugar in three producing areas

找出3個產(chǎn)地紅糖差異性組分。由表6可知，與產(chǎn)地廣東相比，產(chǎn)自廣西的紅糖在保留時(shí)間為5.825，6.43，7.51，16.54，29.30 min的成分有差異，產(chǎn)自云南的紅糖的保留時(shí)間為7.512,10.40 min的成分有差異，產(chǎn)地廣西與產(chǎn)地云南相比，差異成分為保留時(shí)間6.43,9.22,16.54 min的成分。這些差異成分是區(qū)分3個不同產(chǎn)區(qū)紅糖質(zhì)量的主要指標(biāo)性物質(zhì)(但由于缺少標(biāo)準(zhǔn)品的對照，暫時(shí)無法對相關(guān)物質(zhì)進(jìn)行確認(rèn))。

3 討論

采用二極管陣列檢測器在190～400 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行紫外全波長掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在210 nm波長以下有最大吸收，由于接近末端吸收，所以選擇210 nm波長作為檢測波長，在此波長下色譜圖基線噪音較低，各峰的保留時(shí)間適中，分離度較好，基線穩(wěn)定，有利于指紋圖譜分析。紅糖中的糖分很高，而且沒有紫外吸收，濃縮時(shí)會使供試液很粘稠而影響測定，因此利用蔗糖、葡萄糖、果糖這類物質(zhì)在乙醇中的溶解度低，而非糖組分如有機(jī)酸類、氨基酸類、酚類等物質(zhì)能溶于乙醇的特點(diǎn)，選擇無水乙醇作為提取溶劑。此外，通過對磷酸氫二銨-乙腈、磷酸-乙腈、磷酸二氫鈉-乙腈3個流動相系統(tǒng)(等度洗脫)進(jìn)行考察，結(jié)果只有磷酸二氫鈉-乙腈系統(tǒng)各峰分離度比較好；進(jìn)一步優(yōu)化后發(fā)現(xiàn)，以乙腈-0.1 mol/L磷酸二氫鈉水溶液洗脫效果最好，出峰數(shù)最多，基線平穩(wěn)，各峰分離度均達(dá)到分離要求。

本次試驗(yàn)通過多點(diǎn)校正得到了21批紅糖指紋圖譜以及對照圖譜，通過數(shù)據(jù)對比可知21批紅糖基本相似，含量有差別，該指紋圖譜對紅糖產(chǎn)品的溯源、質(zhì)量控制及功效成分的研究具有參考價(jià)值。

將3個產(chǎn)地的紅糖非糖組分的13個共有峰的數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P軟件進(jìn)行主成分分析，分析3個產(chǎn)地的共有物質(zhì)的含量模式相似情況，尋找主要差異成分。經(jīng)PLS-DA驗(yàn)證模型有效后，通過OPLS-DA分析得到變量投影重要性指標(biāo)(VIP)值可知，3個產(chǎn)地之間的差異組分主要是保留時(shí)間為5.82,6.43,7.51,16.54,29.30,9.22,10.40 min對應(yīng)的物質(zhì)。這些差異組分均未知，需要結(jié)合質(zhì)譜等手段進(jìn)一步確定。

由指紋圖譜對比分析和主成分分析結(jié)果可知，不同產(chǎn)地紅糖組分的構(gòu)成和含量均存在差異，這種差異可能是由不同產(chǎn)地甘蔗的生長環(huán)境氣候、土壤以及生產(chǎn)工藝造成的。因此，可以通過建立指紋圖譜的方法，對未知樣品進(jìn)行指紋圖譜比對，從而實(shí)現(xiàn)溯源的目的。