免疫標(biāo)記技術(shù)在廣州管圓線蟲病診斷中的應(yīng)用進(jìn)展

楊毅梅，張霄霄，崔立云，王 菲，曹淑禎

（大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000）

廣州管圓線蟲（Angiostrongylus cantonensis）是我國陳心陶教授于1933年首次在廣州家鼠及褐家鼠發(fā)現(xiàn)的〔1〕，隨后于1945年、1984年分別在臺(tái)灣和中國大陸首次報(bào)道人感染病例的人獸共患寄生蟲〔2-3〕，迄今全世界報(bào)道已確診或疑似感染病例已超過2800例〔4〕。人類因半生食或生食含有三期幼蟲的淡水螺或被三期幼蟲污染的瓜果、蔬菜以及皮膚接觸感染而引起幼蟲移行，導(dǎo)致多器官損傷，如嗜酸性粒細(xì)胞增多性脊膜炎或腦膜腦炎（eosinophilic meningitis or meningoencephalitis，EM或EME） 等廣州管圓線蟲病〔5〕，臨床及時(shí)診斷對(duì)廣州管圓線蟲感染的預(yù)防和治療顯得尤為重要。因腦脊液查蟲體檢出率低下已不能滿足臨床病原體診斷需要，近年來免疫診斷技術(shù)的快速發(fā)展，已發(fā)展為臨床實(shí)驗(yàn)室診斷和流行病調(diào)查的重要方法之一。本文就近年來廣州管圓線蟲免疫標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用最新進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 免疫標(biāo)記技術(shù)概況

免疫標(biāo)記技術(shù)主要通過已知放射核素、酶、熒光素、膠體金或化學(xué)發(fā)光物等標(biāo)記物標(biāo)記抗原或抗體與待測抗體或抗原進(jìn)行特異反應(yīng)，通過檢測標(biāo)記物間接計(jì)算出目的抗體或抗原的含量。目前常用的有用于組織切片或其他標(biāo)本中抗原定位的免疫酶染色試驗(yàn)（immunoenzyme staining test，IEST）以及液體標(biāo)本檢測抗原或抗體的酶聯(lián)免疫吸附 試 驗(yàn) （enzyme linked immunosorbentassay，ELISA）、酶聯(lián)免疫電轉(zhuǎn)移印跡法（enzyme linked immunoelectrotransfer blot，ELIB）、 間接熒光抗體試驗(yàn)（ indirect fluorescent antibody test，IFAT）以及新發(fā)展的免疫膠體金技術(shù)（immune colloidal gold technique，ICG）等都可應(yīng)用于廣州管圓線蟲感染診斷。

1.1 免疫酶染色試驗(yàn) IEST亦稱免疫酶標(biāo)組織化學(xué)法，是采用固相抗原作試驗(yàn)的一種新技術(shù)。常規(guī)的IEST可分為直接法和間接法。前者固定抗原直接與酶標(biāo)抗體結(jié)合；后者與前者的區(qū)別是酶標(biāo)二抗而進(jìn)行酶染色。此試驗(yàn)敏感性高，近幾十年來國內(nèi)外將此技術(shù)已成功的應(yīng)用于多種寄生蟲感染檢測和研究中，并取得了較為滿意的結(jié)果。

梁浩昆等〔6〕用廣州管圓線蟲成蟲IEST試驗(yàn)對(duì)35份感染2周鼠血清和15份4周鼠血清檢測分析顯示其陽性檢出率分別為80.0%與93.3%，總陽性率達(dá)84%。黃緒強(qiáng)和朱佩嫻等〔7-8〕用廣州管圓線蟲感染的大鼠肺組織成蟲、幼齡期成蟲和3期幼蟲制成抗原片，用此法分別檢測20份、39份感染鼠血清和32份健康大鼠血清，其檢測結(jié)果表明成蟲抗原片IEST的敏感性高達(dá)100%和95%，特異性為100%，而且與馬來絲蟲、豬蛔蟲、曼氏迭宮絳蟲裂頭蚴感染鼠血清、華支睪吸蟲及日本血吸蟲感染兔血清均無交叉反應(yīng)。成蟲抗原可在-20℃干燥保存11個(gè)月，可知此技術(shù)不僅靈敏度高、特異性強(qiáng)、無交叉反應(yīng)，而且可長期保存使用，可作為臨床輔助診斷，但此技術(shù)抗原需石蠟包埋制作，操作麻煩費(fèi)時(shí)，不適用于大規(guī)?，F(xiàn)場快速檢測。

1.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 目前，應(yīng)用最廣泛的是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，該試驗(yàn)是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使酶標(biāo)記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行，根據(jù)加入底物的顏色反應(yīng)來判斷是否存在免疫反應(yīng)。目前主要有以檢測特異抗體的斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Dot-ELISA）、間接ELISA以及檢測大分子抗原的雙抗夾心ELISA用于廣州管圓線蟲診斷。

朱佩嫻等〔9〕采用Dot-ELISA法檢測30只感染廣州管圓線蟲SD大鼠血清的陽性率為100%，與日本血吸蟲和曼氏迭宮絳蟲裂頭蚴感染大鼠血清無交叉反應(yīng)，但只在豬蛔蟲粗抗原免疫大鼠血清中出現(xiàn)陽性反應(yīng)。Tomanakan K等〔10〕用同樣技術(shù)檢測30例隱球菌腦膜炎患者、22例細(xì)菌性腦膜炎患者、32例嗜酸性粒細(xì)胞性腦脊膜炎患者、18例其它寄生蟲感染患者和30例健康人血清，只有在嗜酸性粒細(xì)胞性腦脊膜炎患者中檢出陽性結(jié)果，靈敏度為81.3%，其它都為陰性。Ramírez PM等〔11〕報(bào)道廣州管圓線蟲蟲卵抗原包被的間接ELISA的敏感性和特異性分別為90.5%和87.0%，但存在交叉反應(yīng)現(xiàn)象。梁韶暉〔12〕等利用雙抗夾心ELISA法檢測廣州管圓線蟲小鼠循環(huán)抗原（circulating antigen，CAg）和人血清感染廣州管圓線蟲CAg，其靈敏度分別為87.2%和86.36%，特異性均為100%。Chen〔13〕等采用同樣的方法檢測感染廣州管圓線蟲大鼠、小鼠以及人血清廣州管圓線蟲CAg的靈敏度和特異度均為100%，而且與日本血吸蟲等9種寄生蟲無交叉反應(yīng)。Chye〔14〕等制備分子質(zhì)量單位為204 ku的廣州管圓線蟲5期幼蟲抗原，利用雙抗夾心ELISA法檢測42例患有嗜酸性粒細(xì)胞增多性脊膜炎或腦膜腦炎的病人血清及腦脊液；在腦脊液查見蟲體的病人中血清陽性率為95%（19/20），腦脊液陽性率為85%（17/20）；在未查見蟲體的病人中血清陽性率為86.4%（19/22），腦脊液陽性率為81.8%（18/22），40例血清對(duì)照組中只有1例陽性，腦脊液對(duì)照組均為陰性。

上述研究表明，ELISA方法檢測廣州管圓線蟲靈敏度高，特異性強(qiáng)，完全適用于臨床和科研中廣州管圓線蟲感染的檢測，其中Dot-ELISA法可在同一條固相膜上包被多種病原體抗原，可以同時(shí)獲得廣州管圓線蟲和其他病原體檢測結(jié)果，但操作麻煩，不利于流行病學(xué)調(diào)查。間接ELISA該法只需一種酶標(biāo)二抗就可以檢測多種抗體，但易受到標(biāo)本其他物質(zhì)干擾產(chǎn)生假陽性結(jié)果。而廣州管圓線蟲雙抗夾心ELISA法則呈現(xiàn)出高特異性、高敏感性及重復(fù)性等優(yōu)點(diǎn)，而且無交叉反應(yīng)，不僅適合于早期臨床診斷而且可以應(yīng)用廣州管圓線蟲的流行病學(xué)篩查。

1.3 酶聯(lián)免疫電轉(zhuǎn)移印跡法 ELIB試驗(yàn)是將免疫轉(zhuǎn)印技術(shù)與酶標(biāo)技術(shù)兩種技術(shù)結(jié)合應(yīng)用于分析待檢樣品復(fù)雜抗原成分的新技術(shù)，其可更精細(xì)分析廣州管圓線蟲抗原復(fù)雜成分，在廣州管圓線蟲科研中應(yīng)用廣泛。

岳莉莉等〔15〕用此技術(shù)對(duì)廣州管圓線蟲雄性和雌性成蟲蛋白質(zhì)分析顯示雄蟲只有30條區(qū)帶，雌蟲存在40條區(qū)帶蛋白，約有20種蛋白質(zhì)具有較強(qiáng)的免疫原性。李華等〔16〕應(yīng)用此技術(shù)對(duì)各期廣州管圓線蟲蟲體蛋白分析表明發(fā)育各期的蟲體蛋白質(zhì)譜基本一致，無本質(zhì)區(qū)別。因此科研當(dāng)中不能根據(jù)蟲體蛋白分析判斷蟲體發(fā)育階段，但可根據(jù)單一抗原的免疫反應(yīng)特性來判斷蟲體發(fā)育情況。由此可知此技術(shù)具有高蛋白分辨能力、檢測穩(wěn)定性高等特性，可廣泛應(yīng)用于廣州管圓線蟲科研中，與日本血吸蟲、曼氏迭宮絳蟲裂頭蚴抗原免疫以及絲蟲等無交叉反應(yīng)，但僅與豬蛔蟲抗原免疫和旋毛蟲抗原存在交叉反應(yīng)〔16-17〕，而其試驗(yàn)成本以及操作復(fù)雜等因素不利于臨床實(shí)驗(yàn)室診斷廣州管圓線蟲的應(yīng)用，更不利于流行病學(xué)和現(xiàn)場快速診斷。

1.4 免疫熒光技術(shù) 免疫熒光技術(shù)是異硫氰酸熒光素、羅丹明等熒光素標(biāo)記抗體或抗原，與待檢樣本反應(yīng)，在熒光顯微鏡下檢測標(biāo)本中抗原或抗體的方法。其主要包括熒光抗體染色和熒光免疫測定兩種技術(shù)，其中應(yīng)用于廣州管圓線蟲抗原定位和檢測的主要是IFAT方法。

潘長旺等〔18〕運(yùn)用IFAT和免疫金銀染色試驗(yàn)（immunogold silver staining，IGSS） 對(duì)廣州管圓線蟲的抗原定位進(jìn)行研究，IFAT的特異性熒光在廣州管圓線蟲的腸管壁、子宮內(nèi)蟲卵的卵細(xì)胞、卵巢和皮層均有顯示，而IGSS只在腸管壁有顯示，對(duì)照試驗(yàn)均為陰性，表明蟲體的腸管壁是主要抗原定位器官，為比較兩種方法的準(zhǔn)確性，以大鼠旋毛蟲和肺吸蟲抗體陽性血清作對(duì)照，用IFAT對(duì)廣州管圓線蟲做交叉試驗(yàn)，結(jié)果均未發(fā)現(xiàn)皮層有明顯熒光，說明IFAT特異性較好。李小龍等〔19〕將此方法檢測疑患廣州管圓線蟲病人血清和健康人群血清顯示其檢測靈敏性為83%，特異性為100%。而Sandi EA等〔20〕報(bào)道此試驗(yàn)檢測廣州管圓線蟲感染的敏感性和特異性分別為93.7%和84.6%，只與糞類圓線蟲呈現(xiàn)交叉反應(yīng)現(xiàn)象。可知此技術(shù)不僅可應(yīng)用于廣州管圓線蟲科研當(dāng)中，而且敏感性高，特異性強(qiáng)，也可以應(yīng)用于臨床廣州管圓線蟲感染的診斷，但需要熒光顯微鏡觀察，此技術(shù)不適用于廣州管圓線蟲流行病學(xué)研究和現(xiàn)場快速診斷分析。

1.5 免疫膠體金金標(biāo)法 ICG是以膠體金為標(biāo)記物發(fā)展起來的固相標(biāo)記免疫測定技術(shù)。此技術(shù)快捷、經(jīng)濟(jì)、簡易操作等優(yōu)點(diǎn)在臨床和現(xiàn)場快速診斷應(yīng)用廣泛。目前應(yīng)用于廣州管圓線蟲檢測主要有斑點(diǎn)金免疫滲濾試驗(yàn)（dot immunogold filtration assay，DIGFA）、膠體金免疫層析試驗(yàn)（gold immunochromatography assay，GICA）等試驗(yàn)。

曾肖芃等〔21〕包被廣州管圓線蟲成蟲抗原構(gòu)建廣州管圓線蟲DIGFA法檢測感染鼠血清的陽性率高達(dá)96.0%（48/50），健康鼠血清全為陰性，與ELISA法符合率高達(dá)96.7%，與蟯蟲和絳蟲感染鼠血清無交叉反應(yīng)，但與糞類圓線蟲交叉反應(yīng)率為5.6%。干小仙等〔22〕采用包被廣州管圓線蟲成蟲可溶性抗原的DIGFA法分別檢測患者和健康人群血清，其檢測敏感性為90.5%，與ELISA檢測符合率>90%，與血吸蟲病和旋毛蟲病交叉反應(yīng)率分別為3.3%和26.7%，但與并殖吸蟲病、囊尾蚴病、華支睪吸蟲病和肺結(jié)核不存在交叉反應(yīng)。黃達(dá)娜等〔23〕采用包被12D5和21B7單抗點(diǎn)GICA法和雙抗（12D5和21B7）夾心ELISA法同時(shí)快速檢測感染廣州管圓線蟲大鼠和患者血清CAg，檢出率均為100%，與日本血吸蟲、肝吸蟲、肺吸蟲、旋毛蟲、蛔蟲和包蟲病血清均無交叉反應(yīng)。Chen等〔24〕使用廣州管圓線蟲GICA法成功地對(duì)來自南方五省和北京市流行疫區(qū)的1730例血清樣本進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查分析表明長期從事水產(chǎn)和螺螄類養(yǎng)殖的男性人群感染廣州管圓線蟲病的幾率相對(duì)普通人群風(fēng)險(xiǎn)更高。

免疫膠體金技術(shù)是近幾年發(fā)展的新型快速診斷技術(shù)，具有高敏感性和特異性強(qiáng)，操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，其檢測效能與ELISA相當(dāng)，在無定量需求情況下，可用此技術(shù)替代ELISA檢測廣州管圓線蟲感染，但因包被廣州管圓線蟲抗原的不同，其檢測特異性還有待提高。但此技術(shù)無需特殊設(shè)備儀器，簡單、快捷、易操作，特別適合于臨床中小醫(yī)院廣州管圓線蟲病感染檢測和流行病學(xué)調(diào)查以及現(xiàn)場快速檢測分析。

2 結(jié)語

廣州管圓線蟲是寄生性變溫動(dòng)物，其生長發(fā)育易受中末宿主和環(huán)境溫度的影響，近些年全球變暖，其發(fā)病疫源地也隨之?dāng)U大，特別是人們飲食習(xí)慣的改變導(dǎo)致廣州管圓線蟲病患者呈逐年上升趨勢。提高廣州管圓線蟲的科研水平和臨床診斷能力對(duì)預(yù)防廣州管圓線蟲病的傳播、早期診斷和預(yù)后療效觀察顯得尤為重要。近些年來新型標(biāo)記物、反應(yīng)體系改進(jìn)、單克隆抗體以及包被技術(shù)提高和新材料的應(yīng)用，免疫診斷技術(shù)已發(fā)展為廣州管圓線蟲輔助診斷方法。但抗原抗體存在失活、反應(yīng)親和力和特異性不高等原因，導(dǎo)致出現(xiàn)假陽性、假陰性和交叉反應(yīng)等缺點(diǎn)，但相信隨著基因工程特異性抗原的應(yīng)用，不斷改進(jìn)免疫反應(yīng)體系和條件，高效標(biāo)記和包被技術(shù)的發(fā)展應(yīng)用，開發(fā)出更簡便、經(jīng)濟(jì)、快速并能診斷區(qū)分現(xiàn)癥感染和既往感染、評(píng)估感染度以及療效觀察的理想免疫學(xué)標(biāo)記技術(shù)無疑對(duì)廣州管圓線蟲的預(yù)防和診斷治療具有重要意義。

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