MTHFR基因多態(tài)性對冠心病合并高血壓患者氯吡格雷耐受性的影響

黎國德， 許慶波， 韓克棟

茂名市人民醫(yī)院心血管內(nèi)科(廣東茂名 525000)

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病又稱為冠心病，是由于機(jī)體脂質(zhì)代謝異常，在血液中形成的脂質(zhì)會(huì)沉積于動(dòng)脈內(nèi)膜上，逐漸累積形成類似于粥樣脂類物質(zhì)的白色斑塊，隨后引起血管腔狹窄或者阻塞，從而引起血流受阻，造成心肌缺血、缺氧或者壞死，最終導(dǎo)致心臟病[1-2]。在臨床上常常將冠心病分為慢性心肌缺血綜合征(又稱為穩(wěn)定性冠心病)和急性冠狀動(dòng)脈綜合征兩種[3]。據(jù)2017年全球疾病負(fù)擔(dān)國際合作研究報(bào)道，冠心病是全球病死率最高的疾病，多發(fā)于中老年人，且男性患者多于女性，已成為全球各個(gè)國家最常見的病種之一[1]。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，全球冠心病的患者人數(shù)已高達(dá)1.1億，每年死于冠心病的人數(shù)接近900萬。而在我國，從近期中國疾病預(yù)防控制中心的研究報(bào)告顯示，隨著老齡化進(jìn)程的加劇，我國冠心病的發(fā)病和死亡人數(shù)在不斷增加，已成為我國病死率最高的疾病之一[1,4]。有研究表明，冠心病主要的發(fā)病機(jī)制是冠脈血管內(nèi)皮發(fā)生損傷，形成白色斑塊，隨后出現(xiàn)斑塊潰瘍、破裂以及血小板黏附聚集等，導(dǎo)致血栓形成，心肌缺血等[5]。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，冠心病的危險(xiǎn)因素包括高齡、吸煙、高血壓、血脂異常、糖尿病、高總膽固醇(total cholesterol，TC)等，其中高血壓是冠心病的主要危險(xiǎn)因素，隨著患者血壓的升高，冠心病的發(fā)病率和病死率均呈現(xiàn)上升的趨勢[6-7]。氯吡格雷是一種P2Y12受體拮抗劑，需要經(jīng)過肝臟P450酶代謝產(chǎn)生活化物質(zhì)后，才能選擇性不可逆地抑制血小板ADP受體，從而阻斷P2Y12依賴激活的血小板膜糖蛋白復(fù)合物，減少ADP介導(dǎo)的血小板激活和聚集[8-9]。氯吡格雷的半衰期是6 h，常規(guī)劑量的起效時(shí)間為2～8 h，常常與阿司匹林聯(lián)合使用，主要用于心肌梗死患者[1, 10-11]。亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)主要存在于肝臟組織中，是肝臟代謝過程中的關(guān)鍵酶[12]。MTHFR主要位于染色體 1p 36.3，有20多種基因突變位點(diǎn)，其中以C677T 和 A1298C 位點(diǎn)最為常見，而C677T基因型主要是C/T發(fā)生突變從而引起酶活性和功能的改變，A1298C基因型則是A/C發(fā)生突變后可能會(huì)影響酶的功能，進(jìn)而影響藥物在機(jī)體的吸收和代謝[13-14]。因此，本研究擬通過研究MTHFR C677T和A1298C基因多態(tài)性與冠心病合并高血壓患者氯吡格雷耐受的相關(guān)性，為不同MTHFR基因型的冠心病患者提供更為合理的治療方案，增強(qiáng)臨床療效和個(gè)性化用藥提供一定的科學(xué)理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年5月至2019年1月在本院接受診治的95例冠心病患者，其中合并高血壓(GC組)的患者50例，男27例，女23例，年齡為(61.7±9.4)歲，體質(zhì)指數(shù)(BMI)(27.7±3.9)kg/m2；不合并高血壓(C組)的患者45例，男21例，女24例，年齡為(61.4±10.1)歲，BMI(28.1±3.6)kg/m2。兩組患者年齡、性別、BMI等比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。入組標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影提示冠狀動(dòng)脈狹窄≥50%，確診為冠心病，包括慢性冠心病和急性冠脈綜合征的患者；依據(jù)2014年中國高血壓防治指南診斷為高血壓，即每隔2周測量1次，連續(xù)血壓收縮壓≥140 mmHg，舒張壓≥90 mmHg的患者；無嚴(yán)重肝腎等重要器官功能不全的患者。剔除標(biāo)準(zhǔn)：既往口服過氯吡格雷的患者；繼發(fā)性高血壓患者；近期有嚴(yán)重出血史、造血系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤等疾病的患者。

1.2 主要試劑與儀器 引物合成(生工生物工程(上海)股份有限公司)；全血DNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)；限制性內(nèi)切酶(生工生物工程(上海)股份有限公司)；Taq DNA聚合酶(Takara)；化學(xué)試劑均為分析純(廣州市西隴化工有限公司)等。PCR擴(kuò)增儀(杭州博日科技有限公司)；Maestro GEN超微量分光光度儀(美國Maestro公司)等。

1.3 治療方案與觀察指標(biāo) 所有患者都采用聯(lián)合口服75 mg氯吡格雷[賽諾菲(杭州)制藥有限公司]和100 mg阿司匹林(拜耳醫(yī)藥有限公司)進(jìn)行治療，同時(shí)口服單硝酸異山梨酯(魯南貝特制藥有限公司)等常規(guī)藥物。于入院后第2天和服藥后第6天用二磷酸腺苷專用抗凝管采集大約5 mL的靜脈血，檢測血小板抑制率，同時(shí)于次日清晨抽取2 mL的靜脈血，進(jìn)行血常規(guī)檢測，3 mL的靜脈血檢測肝腎功能、血脂等指標(biāo)；然后取部分靜脈血用于全血DNA的提取。

入院前記錄患者的一般資料(姓名、性別、年齡、身高、體重等)，既往服藥情況，入院后進(jìn)行血常規(guī)檢測、肝腎功能檢測、血脂檢測[包括三酰甘油(TG)、膽固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)等]。觀察兩組患者M(jìn)THFR基因多態(tài)性分布特點(diǎn)以及各基因型的比例，分析兩組不同基因型患者與口服氯吡格雷耐受性的相關(guān)性。

1.4 全血DNA的提取 采用全血基因組DNA提取試劑盒并嚴(yán)格按照說明書提取兩組患者的血樣DNA，隨后通過Maestro GEN超微量分光光度儀檢驗(yàn)提取的DNA的純度。

1.5 基因型分析 通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和限制性內(nèi)切片段長度多態(tài)性(RFLP)法(PCR-RFLP)分析MTHFR基因型?；蛎Q及其引物序列見表1。94℃下解鏈5min，隨后94℃下變性30 s，60℃下退火30 s，72℃下延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；然后在72℃下再延伸5 min，1個(gè)循環(huán)。

表1 基因名稱及其引物序列

2 結(jié)果

2.1 一般資料的比較 兩組患者的血常規(guī)、TC、TG、HDL和LDL等差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

2.2 兩組患者基因型分布特征比較 經(jīng)過檢測發(fā)現(xiàn)，本研究中所有患者的MTHFR C677T和MTHFR A1298C各基因型的分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。在GC組中，MTHFR C677T的CT基因型突變的頻率最高(52%)，TT基因型次之，CC基因型突變頻率最低，T等位基因的頻率高達(dá)68.4%；而MTHFR A1298C的AA基因型突變頻率最高(54%)，AC基因型次之，CC基因型突變頻率最低，A等位基因的頻率高達(dá)82.3%。在C組中，MTHFR C677T中各基因型的突變頻率與GC組類似，CT>TT>CC，T等位基因的頻率為64.3%；而MTHFR A1298C中各基因型的突變頻率也與GC組差不多，AA>AC>CC，A等位基因的頻率為78.4%。兩組患者各基因型之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。不同基因型分布特征見表3。

項(xiàng)目例數(shù)吸煙史[例(%)]飲酒史[例(%)]TG(mmol/L)TC(mmol/L)HDL(mmol/L)LDL(mmol/L)GC組5014(28.0)21(42.0)1.86±0.744.24±1.411.21±0.512.53±1.03C組4511(24.4)18(40.0)1.64±0.814.06±1.331.10±0.892.26±0.942/t值0.3470.2161.3542.1533.1140.984P值0.5810.2270.1840.0870.2690.131

表3 兩組患者M(jìn)THFR各基因型分布特征及等位基因頻率比較 例(%)

2.3 不同基因型患者氯吡格雷耐受情況比較 在本研究中，GC組患者有50例，出現(xiàn)氯吡格雷耐受的患者有30例，占60%，而C組患者有45例，出現(xiàn)氯吡格雷耐受的患者有24例，占53.3%，兩組患者在氯吡格雷耐受性比率上的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。但是，不管是GC組還是C組，MTHFR C677T的CT基因型患者中出現(xiàn)氯吡格雷耐受的比率明顯高于CC基因型患者和TT基因型患者，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而MTHFR A1298C三種基因型患者中出現(xiàn)氯吡格雷耐受的比率差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

3 討論

隨著社會(huì)老齡化進(jìn)程的加劇，全球范圍內(nèi)冠心病的發(fā)病率和病死率都在不斷升高，已經(jīng)成為了全球病死率最高的疾病，嚴(yán)重威脅著全世界人民的生命健康[1-2]。據(jù)研究表明，冠心病的危險(xiǎn)因素主要有年齡、吸煙、高血壓、血脂異常、糖尿病、總膽固醇等，其中高血壓是冠心病的主要危險(xiǎn)因素，隨著患者血壓的升高，冠心病的發(fā)病率和死亡率均呈現(xiàn)上升的趨勢[15]。一般來說，冠狀動(dòng)脈病變的狹窄程度和部位將決定患者缺血癥狀和預(yù)后情況，當(dāng)管腔狹窄<50%時(shí)，心肌供血并不會(huì)受到太大的影響，當(dāng)管腔狹窄>50%時(shí)，運(yùn)動(dòng)、心動(dòng)過速或者激動(dòng)都會(huì)引起心臟耗氧量升高，進(jìn)而引起短暫性的心肌供血不足，導(dǎo)致慢性穩(wěn)定性心絞痛，而當(dāng)粥樣斑塊發(fā)生破裂、糜爛或者出血時(shí)，就容易形成血栓，進(jìn)而引起血流受阻，造成心肌缺血、缺氧或者壞死，引發(fā)急性心肌梗死[16-17]。因此，為了能夠更好地控制冠心病的發(fā)病率和死亡率，尋找更加合理的治療方案，構(gòu)建個(gè)體化用藥和精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的體系，全球相關(guān)臨床和科研人員都致力于探究不同患者應(yīng)用不同藥物治療冠心病的作用機(jī)制，期望更好地提高藥物的臨床療效。

表4 不同基因型患者對氯吡格雷耐受性的影響

氯吡格雷是《冠心病合理用藥指南(第2版)》中主要用于預(yù)防心肌梗死和改善預(yù)后的一種常用藥物[1]，它是一種P2Y12受體拮抗劑，需要經(jīng)過肝臟P450酶代謝產(chǎn)生活化物質(zhì)后，才能選擇性不可逆地抑制血小板ADP受體，從而阻斷P2Y12依賴激活的血小板膜糖蛋白復(fù)合物，減少ADP介導(dǎo)的血小板激活和聚集[8, 18]。雖然氯吡格雷治療冠心病的臨床療效是毋庸置疑的，但是它最大的缺點(diǎn)就是存在較大的個(gè)體差異，導(dǎo)致有一部分的患者無法獲得較好的治療效果，反而出現(xiàn)氯吡格雷抵抗，甚至是卒中等不良事件，堪稱一把冠心病的“雙刃劍”[11, 19-20]。張惠娟等[21]通過觀察高血壓合并冠心病患者應(yīng)用氨氯地平、氨氯地平聯(lián)合氯吡格雷的臨床治療效果，發(fā)現(xiàn)氯吡格雷聯(lián)合氨氯地平用于治療高血壓病合并冠心病，能夠明顯提高臨床療效和改善心功能。而劉炳博等[22]通過對冠心病患者經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈支架植入術(shù) (PCI)后氯吡格雷發(fā)生抵抗的因素進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，高齡、 糖尿病、高血壓和慢性腎臟病等都會(huì)使患者出現(xiàn)氯吡格雷抵抗的情況，需要給予替代藥物來降低缺血事件引起大風(fēng)險(xiǎn)，改善PCI的預(yù)后情況。Savonitto等[23]通過臨床研究發(fā)現(xiàn)老年患者在急性冠脈綜合征后發(fā)生缺血和出血并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)明顯高于年輕患者，并且表現(xiàn)出更高的氯吡格雷血小板反應(yīng)性。因此，在臨床應(yīng)用氯吡格雷的時(shí)候需要進(jìn)行全方位的判斷和分析，以便更好地提高臨床療效的同時(shí)，減少不良事件的發(fā)生。

Wang等[2]通過監(jiān)測不同患者GP89基因多態(tài)性與冠心病、血脂、血糖和血壓的變化，發(fā)現(xiàn)GP89基因145位點(diǎn)發(fā)生突變后能夠顯著影響患者血脂、血糖、血壓等指標(biāo)，從而影響冠心病的預(yù)后情況，該研究表明影響冠心病的臨床療效還可能是與不同患者基因型發(fā)生了突變有關(guān)。已有研究[24]發(fā)現(xiàn)，MTHFR主要存在于肝臟組織中，是肝臟代謝過程中的一種關(guān)鍵酶。MTHFR主要位于染色體 1p36.3，主要由11個(gè)外顯子和10個(gè)內(nèi)含子組成，編碼區(qū)序列長2.2 kb，研究[13]發(fā)現(xiàn)其5′端非編碼區(qū)經(jīng)常會(huì)發(fā)生選擇性剪接，且MTHFR有20多種基因突變位點(diǎn)，表明MTHFR基因存在表達(dá)上的復(fù)雜性。其中以C677T 和 A1298C 位點(diǎn)最為常見，在不同國家、不同地區(qū)和不同個(gè)體中，C677T 和 A1298C 位點(diǎn)的基因型分布具有顯著的差異。MTHFR C677T基因型主要是C/T發(fā)生突變從而引起酶活性和功能的改變，而A1298C基因型則是A/C發(fā)生突變后可能會(huì)影響酶的功能，進(jìn)而影響藥物在機(jī)體的吸收和代謝[25]。Zhu等[26]通過觀察和分析甲氨蝶呤與不同兒童惡性腫瘤患者M(jìn)THFR基因多態(tài)性的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，MTHFR C677T多態(tài)性的基因分型可能是減少毒性和改善個(gè)性化甲氨蝶呤治療的重要依據(jù)。而在冠心病的治療方面，MTHFR作為血漿同型半胱氨酸(Hcy)代謝過程中的關(guān)鍵酶，可以通過催化N5，N10-亞甲基四氫葉酸還原成 N5-甲基四氫葉酸，然后促使Hcy再甲基化形成蛋氨酸，以維持Hcy的正常血漿水平，預(yù)防冠心病的發(fā)生和發(fā)展，而當(dāng)MTHFR C677T基因型中C等位基因突變成T等位基因時(shí)，會(huì)導(dǎo)致丙氨酸被纈氨酸所取代，進(jìn)而促使酶活性降低，引起血漿中Hcy的水平顯著提高，最終加劇冠心病的進(jìn)展[27-29]。還有研究[30-31]通過觀察分析MTHFR C677T基因多態(tài)性與老年原發(fā)性高血壓患者粥樣硬化斑塊形成的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，MTHFR C677位點(diǎn)C等位基因突變成T等位基因，有可能會(huì)增加老年高血壓患者粥樣斑塊形成的風(fēng)險(xiǎn)。

本研究選取了95例冠心病患者，其中合并高血壓(GC組)的患者50例，不合并高血壓(C組)的患者45例，兩組患者的血常規(guī)、TC、TG、HDL和LDL等指標(biāo)以及年齡、性別、BMI、飲酒、吸煙等差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，排除了冠心病其他危險(xiǎn)因素對氯吡格雷耐受的影響。經(jīng)過檢測發(fā)現(xiàn)，本研究中所有患者的MTHFR C677T和MTHFR A1298C各基因型的分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。在GC組中，MTHFR C677T的CT基因型突變的頻率最高(52%)，TT基因型次之，CC基因型突變頻率最低，T等位基因的頻率高達(dá)68.4%；而MTHFR A1298C的AA基因型突變頻率最高(54%)，AC基因型次之，CC基因型突變頻率最低，A等位基因的頻率高達(dá)82.3%。在C組中，MTHFR C677T中各基因型的突變頻率與GC組類似，CT>TT>CC，T等位基因的頻率為64.3%；而MTHFR A1298C中各基因型的突變頻率也與GC組差不多，AA>AC>CC，A等位基因的頻率為78.4%。兩組患者各基因型之間的差異并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明MTHFR C677T和MTHFR A1298C是否發(fā)生突變與冠心病是否合并高血壓之間沒有直接關(guān)系。隨后，本研究發(fā)現(xiàn)GC組患者50例，出現(xiàn)氯吡格雷耐受的患者有30例，占60%，而C組患者45例，出現(xiàn)氯吡格雷耐受的患者有24例，占53.3%，兩組患者在氯吡格雷耐受性比率上的差異并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。但是，不管是GC組還是C組，MTHFR C677T的CT基因型患者中出現(xiàn)氯吡格雷耐受的比率明顯高于CC基因型患者和TT基因型患者，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明當(dāng)MTHFR C677T患者的C等位基因突變?yōu)門等位基因后，患者對氯吡格雷耐受的幾率明顯升高，MTHFR C677T的CT基因型可能是導(dǎo)致氯吡格雷耐受的主要遺傳因素。而MTHFR A1298C患者的三種基因型中出現(xiàn)氯吡格雷耐受的比率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明MTHFR A1298C與患者出現(xiàn)氯吡格雷耐受可能并無直接關(guān)系。

本研究提示，MTHFR C677T的C/T發(fā)生基因突變后，可能會(huì)不同程度地影響冠心病合并高血壓患者對氯吡格雷的耐受性，而MTHFR A1298C發(fā)生基因突變后可能并不會(huì)影響患者對氯吡格雷的耐受性，這可能是因?yàn)镸THFR基因表達(dá)或突變會(huì)被機(jī)體不同的因素所調(diào)控。這結(jié)果提示我們不同個(gè)體之間存在不同的基因型分布特征，在使用藥物時(shí)不僅要考慮個(gè)體疾病的復(fù)雜性和交叉性，還需要不同個(gè)體基因型的特征，才能夠更好地提供治療方案，提高臨床療效?；诂F(xiàn)有研究成果上，后續(xù)將對不同地區(qū)、不同生活習(xí)慣和環(huán)境的患者進(jìn)行區(qū)分和觀察分析，并進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，增加對氯吡格雷耐受的評價(jià)指標(biāo)和因素，以期提供更為合理更為準(zhǔn)確的臨床數(shù)據(jù)，為構(gòu)建個(gè)性化治療體系提供更多的科學(xué)依據(jù)。