枯草芽胞表面CotC和CotG共展示海藻糖合酶研究

劉洪玲，劉 浩，王騰飛

(1. 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457；2. 齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)生物工程學(xué)院，濟南250353)

芽胞是有某些細菌產(chǎn)生的堅韌且不具有繁殖能力的結(jié)構(gòu)，可以使這些細菌在不利的條件下處于休眠狀態(tài)．芽胞的結(jié)構(gòu)由外到內(nèi)依次為芽胞外壁、芽胞衣殼、芽胞皮層和芽胞髓質(zhì)．芽胞髓質(zhì)由芽胞壁、芽胞質(zhì)膜、芽胞質(zhì)和染色體核心這四部分組成的[1]．芽胞的形成是一系列調(diào)控基因和結(jié)構(gòu)基因按一定時序調(diào)控表達的過程，這些基因包括芽胞衣殼蛋白基因以及調(diào)控基因，如 cotA、cotB、cotC、cotF、cotG 等 20余種[2]．芽胞衣殼是一種由至少 70種蛋白組成的復(fù)雜結(jié)構(gòu)[3]．芽胞外壁從結(jié)構(gòu)上又可詳細分為 Crust層、外層、內(nèi)層和基底層[4-5]．雖然芽胞對熱、輻射、靜水壓、極端 pH環(huán)境和一些有毒化學(xué)物品等有很強的抵抗能力[6]，但當芽胞遇到合適的萌發(fā)條件時卻極為敏感，芽胞會迅速進入萌發(fā)狀態(tài)，迅速出芽生長，恢復(fù)到營養(yǎng)細胞的狀態(tài)[7]．芽胞表面展示技術(shù)，是一項在芽胞表面展示具有生物活性外源蛋白的技術(shù)．該技術(shù)將外源蛋白基因與芽胞衣殼蛋白基因進行融合，進而將外源蛋白和錨定蛋白共同展示于芽胞表面．Isticato等[4]首次成功實現(xiàn)了枯草芽胞桿菌芽胞衣殼蛋白融合展示外源蛋白的表達，此后芽胞表面展示技術(shù)受到了廣泛的關(guān)注．枯草芽胞表面展示技術(shù)應(yīng)用最普遍的原因主要是芽胞具有結(jié)構(gòu)清楚[8-9]、基因改造簡單[10]、全基因組數(shù)據(jù)已公布[11]等優(yōu)點．枯草芽胞表面的衣殼蛋白分子質(zhì)量較大，這使得芽胞表面展示系統(tǒng)能夠展示分子質(zhì)量較大的蛋白，而且由于芽胞衣殼蛋白是內(nèi)源性蛋白，所以在引導(dǎo)外源蛋白展示的過程中，能夠大幅度地提高外源蛋白的折疊效率和展示效率[2]．Mauriello等[5]通過將攜帶外源蛋白基因的錨定蛋白CotC和枯草芽胞桿菌基因組中淀粉酶基因進行同源重組的方式，成功地在芽胞表面展示了破傷風(fēng)毒素(TTFC)和埃希氏大腸桿菌嗜熱毒素(LTB).Isticato等[4]利用CotB作為芽胞表面展示外源抗原的載體蛋白，將破傷風(fēng)毒素(TTFC)C末端的 459個氨基酸片段展示在枯草芽胞桿菌芽胞表面．Kwon等[12]以 CotG為蛋白載體將半乳糖苷酶展示于枯草芽胞桿菌芽胞表面，重組芽胞在水–有機相反應(yīng)體系中具有半乳糖苷酶催化活性，并且較化學(xué)方法固定于芽胞表面的半乳糖苷酶有更好的穩(wěn)定性．Nguyen等[13]也利用錨定蛋白 CotB、CotC和 CotG在芽胞表面成功展示了GFPuv蛋白，并利用CotB自身的啟動子和替換后的 IPTG誘導(dǎo)啟動子，實現(xiàn)了 GFPuv蛋白的調(diào)控表達．

本文擬以CotC、CotG作為TreS的錨定蛋白，構(gòu)建整合型表達質(zhì)粒，將 TreS展示于芽胞表面．通過芽胞表面展示技術(shù)，將 TreS展示于枯草芽胞桿菌表面，形成微固定化酶，實現(xiàn) TreS在芽胞表面的展示表達．

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒與培養(yǎng)基

大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α，由本實驗室保存；枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)WB800n，德國MoBiTec公司；pDG1730，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)；pPIC9k、pPIZαA，杭州寶賽生物科技有限公司．

DSM 培養(yǎng)基：營養(yǎng)肉湯 8g/L，KCl 1g/L，MgSO4·7H2O 0.25g/L，121℃高壓滅菌 20min 后加入無菌的Ca(NO3)21mmol/L、MnCl20.01mmol/L和FeSO40.01mmol/L．

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，NaCl 10g/L．在液體培養(yǎng)基中添加 20g/L的瓊脂，即為固體培養(yǎng)基．

GM 培養(yǎng)基：蛋白胨 10g/L，酵母浸粉 5g/L，NaCl 10g/L，山梨醇 0.5mol/L，用去離子水定容至1L．

ETM 培養(yǎng)基：山梨醇 0.5mol/L，甘露醇0.5mol/L，甘油10%，用去離子水定容至1L．

RM 培養(yǎng)基：蛋白胨 10g/L，酵母浸粉 5g/L，NaCl 10g/L，山梨醇0.5mol/L，甘露醇0.38mol/L，用去離子水定容至1L．

TB培養(yǎng)基：胰蛋白胨 12g/L，酵母提取物24g/L，甘油 4mL/L，K2HPO472mmol/L，KH2PO417mmol/L．

1.1.2 主要試劑

壯觀霉素，北京吉美生物技術(shù)有限公司；氨芐青霉素，上海慕遠生物科技有限公司；氯霉素、細菌DNA小量提取純化試劑盒、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、Ezup柱式細菌基因組 DNA抽提試劑盒、蛋白 marker，上海生工生物工程有限公司；高純度質(zhì)粒小提試劑盒、多片段無縫克隆試劑盒、核酸DL5000marker、TaqDNA 聚合酶、2×Phanta Max Master Mix，南京諾唯贊生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶、T4DNA 連接酶，賽默飛世爾科技(中國)公司；溶菌酶，NOVO 公司；電泳級瓊脂糖，西班牙Biowest Agarose 公司；10×Loading Buffer，日本Takara公司；6×His、His-Tag鼠單克隆抗體，美國Proteintech公司；BSA、山羊血清、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、FITC–羊抗小鼠 IgG，武漢博士德生物工程有限公司；辣根酶標記山羊抗小鼠 IgG(H＋L)，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；吐溫 20，上海阿拉丁生化科技股份有限公司．

1.2 錨定蛋白的基因克隆

1.2.1cotC、cotG基因及treS基因的克隆

檢索GenBank中已登錄的cotC和cotG基因序列，通過軟件CE Design V1.04設(shè)計多片段無縫克隆特異性引物，以本實驗室構(gòu)建質(zhì)粒pET-15b-treS為模板擴增獲得treS基因序列，以B. subitilisWB800n基因組 DNA為模板擴增cotC和cotG基因序列．將PCR擴增所得的cotC、cotG基因片段及其對應(yīng)的treS基因片段，利用多片段無縫克隆技術(shù)分別連接獲得融合基因cotC-treS及cotG-treS序列．所用引物見表 1，下劃線為酶切位點．PCR 擴增條件為：95℃預(yù)變性3min，95℃變性15s，63℃退火15s，72℃延伸90s，30個循環(huán)；72℃延伸 5min，4℃保存．將 PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進行檢驗，并使用 SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒進行膠回收，-20℃保存.

1.2.2 雙cot-treS展示體系中的基因克隆

根據(jù) 1.2.1節(jié)所述融合基因 cotC-treS及 cotG-treS序列，用1.2.1節(jié)方法進行雙cot-treS展示體系中的基因克隆．

表1 引物序列Tab. 1 Primer sequence

1.3 pDG1730-cotC/G-treS和pDG1730-cotC-treS-cotG-treS重組質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù) 1.2.1節(jié)所述，獲得 cotC、cotG基因及其對應(yīng)的treS基因．根據(jù)整合型質(zhì)粒pDG1730的HindⅢ和 BamHⅠ酶切位點，用這兩個酶將 pDG1730質(zhì)粒雙酶切，并利用多片段無縫克隆技術(shù)將 cotC和 treS基因、cotG和 treS基因連接到 pDG1730質(zhì)粒上，獲得 pDG1730-cotC/G-treS重組質(zhì)粒．再進一步利用多片段無縫克隆技術(shù)，將獲得的 cotC-treS和 cotG-treS基因片段連接到經(jīng)過 BamHⅠ和 HindⅢ雙酶切的pDG1730質(zhì)粒上，獲得重組質(zhì)粒pDG1730-cotC-treS-cotG-treS．構(gòu)建流程如圖1所示．

1.4 B. subitilis WB800n感受態(tài)的制備與電轉(zhuǎn)化

將B. subitilis WB800n在LB平板中劃線，長出單菌落后，挑取一個單菌落接種于 5mL LB液體培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)．取 500μL過夜培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)接至 50mL GM 培養(yǎng)基中，使 A600＝0.1～0.2，37℃、200r/min培養(yǎng)至 A600＝1.0．將 GM 培養(yǎng)基及所有槍頭、離心管置于冰上冷卻10min．將GM培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至 50mL離心管，4℃、5000r/min離心 8min．用20mL ETM 培養(yǎng)基重懸菌體，4℃、5000r/min離心8min，重復(fù) 3次．將洗滌后的菌體重懸于 500μL ETM 中，分裝到 1.5mL離心管中，每管 60μL．在60μL感受態(tài)中加入6μL重組質(zhì)粒，冰浴5min，加入到預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯(2mm)中電擊 1次(電壓 2500V，時間 5.0ms)．電轉(zhuǎn)完畢后，加入 1mL 37℃預(yù)熱的RM 培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)入 1.5mL離心管中，37℃、200r/min復(fù)蘇 3h．將復(fù)蘇后的菌液離心，除去多余上清液，留100μL上清液重懸菌體，涂布在含有壯觀霉素(終質(zhì)量濃度 100μg/mL)的 LB 平板上，37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)．

圖1 重組質(zhì)粒pDG1730-cotC-treS-cotG-treS的構(gòu)建Fig. 1 Construction of recombinant pDG1730-cotC-treS-cotG-treS

1.5 芽胞表面展示TreS的分析

1.5.1 免疫印跡(Western blot)分析

將重組菌于含壯觀霉素的 LB平板(終質(zhì)量濃度100μg/mL)上劃線活化，挑取單菌落至50mL含有壯觀霉素的 LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)．按 1%的接種量接種于 TB培養(yǎng)基中，37℃、200r/min培養(yǎng)96h．7500r/min離心 10min，2mg/mL溶菌酶 37℃處理 30min后沉淀芽胞．取適量芽胞溶于 5mL的SDS-DTT溶液中，置于 37℃水浴中保溫 2h．用50mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)洗滌3次，最后用裂解液懸浮．將離心管置于冰上進行超聲破碎(功率300W，工作 2s，間隔 4s，工作總時間為 15min)．將破碎后的溶液在 4℃、8000r/min離心 20min，收集芽胞，用50mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)重懸沉淀，收集上清液(上清液即為提取的含有 His tag的芽胞衣殼蛋白溶液)，進行 SDS-PAGE電泳檢測或?qū)⑸锨逡簼饪s后進行SDS-PAGE檢測．

將提取的芽胞衣殼蛋白經(jīng) SDS-PAGE分離后，用電轉(zhuǎn)移法將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上，然后用 5%的脫脂奶粉室溫下封閉 1h，將膜上封閉液洗凈，于 4℃條件下一抗孵育過夜．回收一抗，用TBST緩沖液洗膜3次，每次5min．將封閉液稀釋的二抗加到膜上，室溫孵育 1h．回收二抗，用 TBST洗膜3次，每次10min．最后將膜放入顯色液中顯色后掃描．

1.5.2 免疫熒光分析

將重組菌轉(zhuǎn)接至DSM培養(yǎng)基中37℃、200r/min培養(yǎng) 48h．取 48h培養(yǎng)物 2mL，12000r/min離心10min收集菌體，重懸于相同體積的 GTE buffer(50mmol/L 葡萄糖，10mmol/L EDTA，20mmol/L pH 7.5Tris-HCl，2mg/mL 溶菌酶)中，37℃處理 30min破壞營養(yǎng)細胞．12000r/min離心15min沉淀芽胞，用 pH 7.4的 PBS緩沖液(8g/L NaCl、0.24g/L KH2PO4、0.2g/L KCl、3.63g/L Na2HPO4·12H2O 溶于 800mL 蒸餾水中，HCl調(diào) pH為 7.4，加水定容至 1L，121℃滅菌 25min，室溫保存)洗滌 5次，用于免疫熒光分析．用 100μL抗體結(jié)合buffer(PBS中加入BSA和山羊血清使其體積分數(shù)都為3%)懸浮芽胞，在1.5mL EP管內(nèi)操作，加入適當濃度的一抗，冰上放置 2h．用抗體結(jié)合緩沖液洗滌芽胞 4次，4000r/min離心 15min，完全除去上清液．用100μL抗體結(jié)合buffer懸浮芽胞，加入適當濃度FITC標記的二抗，冰上放置2h．用抗體結(jié)合緩沖液洗滌細胞 3次，5000r/min離心 10min，完全除去上清液．將 100μL懸液滴到載玻片上，蓋上蓋玻片，黑暗中待其吹干后立刻用共聚焦顯微鏡觀察．

1.5.3 芽胞表面展示酶活力分析

將重組菌在含壯觀霉素的LB平板上劃線，將長出的單菌落接種于含壯觀霉素的液體 LB中過夜培養(yǎng)后轉(zhuǎn)接至TB培養(yǎng)基中37℃、200r/min培養(yǎng)96h，測芽胞干質(zhì)量并進行芽胞計數(shù)．將芽胞離心，用 pH 8.0的PBS重懸芽胞，超聲破碎(功率300W，間歇時間 5s，工作時間 5s，全程 15min)．加入適量麥芽糖溶液使麥芽糖終體積分數(shù)為 30%，25℃條件下反應(yīng)轉(zhuǎn)化 1h．將轉(zhuǎn)化反應(yīng)后的樣品煮沸 10min使酶失活，檢測生成的海藻糖濃度，并計算海藻糖合酶的酶活力．酶活力單位(U)定義為在 25℃、pH 8.0、10mmol/L的磷酸緩沖體系中，1h轉(zhuǎn)化生成 1μmol的海藻糖．

1.5.4 斑點印跡雜交(Dot blot)分析

利用 Dot blot分析方法對重組菌 B. subtilis WB800n/cotC-treS、B. subtilis WB800n/cotG-treS和 B.subtilis WB800n/cotC-treS-cotG-treS的芽胞所攜帶的TreS分子進行分析．用TBST溶液將TreS標準品溶液及提取的重組菌的芽胞衣殼蛋白溶液進行梯度稀釋，成排點于 PVDF膜上并風(fēng)干，記錄好樣品順序，然后將風(fēng)干好的 PVDF膜用封閉液室溫振蕩孵育1h，在室溫下用一抗振蕩孵育 1h，并用 TBST溶液洗滌 3次，每次 5min，接著再在室溫下二抗振蕩孵育1h，并用TBST溶液洗滌3次，每次10min，最后將膜放入顯色液中顯色后掃描，顯色結(jié)果利用 Image J軟件進行分析，輸出結(jié)果的平均灰度值，轉(zhuǎn)化為吸光度后進行陽性信號的定量化．在Excel軟件中利用該公式計算各平均灰度值對應(yīng)的吸光度，乘以所測區(qū)域的面積(Image J軟件可同時給出)，從而獲得所測區(qū)域總吸光度，該值代表測量區(qū)域中物質(zhì)的含量．

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的克隆及重組質(zhì)粒的構(gòu)建

2.1.1 cotC、cotG基因及treS基因的克隆

以B. subtilis WB800n的基因組為模板，分別以cotC-F和cotC-R、cotG-F和cotG-R為引物進行PCR擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖 2(a)所示．由圖 2(a)可知，cotC基因在 500bp左右出現(xiàn)特異性條帶，理論長度為408bp，cotG基因在750bp左右出現(xiàn)特異性條帶，理論長度為 763bp，與理論長度相符，表明已成功獲得 cotC和 cotG基因．以突變的pET15b-treS基因組為模板，分別以 cotC-treS-F-1/treS-R和cotG-treS-F-1/treS-R為引物進行PCR擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖2(b)所示．由圖2(b)可知，在2000bp左右出現(xiàn)特異性條帶，與理論長度2085bp相符，表明已成功獲得突變treS(C)、treS(G)基因片段．

圖2 cotC、cotG基因及treS基因的PCR擴增電泳圖Fig. 2 PCR amplification electrophoresis of cotC，cotG and treS genes

2.1.2 重組質(zhì)粒pDG1730-cotC/cotG-treS的構(gòu)建

將PCR擴增所得的cotC、cotG基因及其對應(yīng)的treS基因，利用多片段無縫克隆技術(shù)連接到pDG1730質(zhì)粒中，并轉(zhuǎn)化至E. coli DH5α感受態(tài)細胞中．利用特異性引物進行菌落 PCR驗證，通過 1%瓊脂糖凝膠電泳對 PCR產(chǎn)物進行檢測．檢測結(jié)果如圖 3所示，表明cotC/cotG -treS基因已成功連接到pDG1730質(zhì)粒．

圖3 重組質(zhì)粒pDG1730-cotC/cotG-treS的菌落PCRFig. 3 PCR of recombinant plasmid pDG1730-cotC/cotG-treS

2.1.3 雙cot-treS體系中基因的克隆

以重組質(zhì)粒 pDG1730-cotC-treS為模板，以cotC-treS-F-2和 cotC-treS-R-2為引物進行 PCR擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖4所示．cotC-treS基因在2493bp出現(xiàn)特異性條帶，與cotC-treS基因理論長度相符，說明已成功獲得cotC-treS基因．

以重組質(zhì)粒 pDG1730-cotG-treS為模板，以cotG-treS-F-2和 cotG-treS-R-2為引物進行 PCR擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖4所示．cotG-treS基因在 2847bp出現(xiàn)特異性條帶并高于 cotC-treS基因，與cotG-treS基因的理論長度相符，說明已成功獲得cotG-treS基因．

圖4 雙 cot-treS體系中 cotC-treS和 cotG-treS基因的PCRFig. 4 PCR of cotC-treS and cotG-treS genes in double cot-treS system

2.1.4 重組質(zhì)粒pDG1730-cotC-treS-cotG-treS的構(gòu)建

將PCR獲得的cotC-treS基因和cotG-treS基因，利用多片段無縫克隆技術(shù)連接到整合型質(zhì)粒pDG1730上，并轉(zhuǎn)化至E. coli DH5α中．分別利用特異性引物 cotC-F和 cotC-treS-R-2、cotG-F和 cotG-treS-R-2對同一菌株進行菌落 PCR驗證，1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，檢測結(jié)果如圖5所示．由圖5可知，2—5號菌同時擴增出特異性條帶 cotC-treS和cotG-treS，表明 cotC-treS基因和 cotG-treS基因已成功連接至pDG1730質(zhì)粒中．

圖5 重組質(zhì)粒pDG1730-cotC-treS-cotG-treS菌落PCRFig. 5 PCR of recombinant plasmid pDG1730-cotC-treS-cotG-treS

2.2 重組菌的構(gòu)建

2.2.1 重組菌的篩選

將重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至B. subtilis WB800n感受態(tài)中，涂布至含有壯觀霉素的 LB平板上．利用特異性引物進行菌落 PCR驗證，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測．整合型質(zhì)粒pDG1730電轉(zhuǎn)至B. subtilis WB800n中，目的基因在兩側(cè)α-淀粉酶同源臂的作用下，以雙交換整合到 WB800n的染色體中．將 B. subtilis WB800n和重組B. subtilis WB800n同時點種在含有淀粉的 LB平板中，37℃過夜培養(yǎng)，如圖 6(a)所示．噴灑碘液后，B. subtilis WB800n原始菌有明顯的淀粉水解圈，而重組菌無明顯的淀粉水解圈，表明目的基因成功整合染色體淀粉酶基因位點，如圖 6(b)所示．

圖6 重組菌的淀粉板驗證Fig. 6 Starch plate validation of recombinant B. subtilis WB800n

2.2.2 芽胞表面展示TreS的Western blot分析

將重組菌 B. subtilis WB800n/cotC-treS、B. subtilis WB800n/cotG-treS、B. subtilis WB800n/cotC-treS-cotG-treS分別接種至 TB培養(yǎng)基中，培養(yǎng) 96h后收集芽胞并純化．提取芽胞衣殼蛋白后，進行 Western blot分析，結(jié)果如圖 7所示．由圖 7可知，構(gòu)建的重組菌芽胞分別成功表面展示 CotC-TreS、CotG-TreS及表面共展示CotC-TreS和CotG-TreS．圖中1、2泳道條帶分別對應(yīng)的相對分子質(zhì)量約為 9.95×104和8.44×104；3泳道無相應(yīng)條帶；4泳道條帶為兩條，分別對應(yīng) 9.95×104和 8.44×104．這與衣殼蛋白 CotC和 TreS加和的理論相對分子質(zhì)量、CotG與 TreS加和的理論相對分子質(zhì)量相一致，表明芽胞表面分別成功展示了 CotC-TreS、CotG-TreS融合酶及共展示兩者的融合酶．

圖7 重組菌的芽胞衣殼蛋白Western blot分析Fig. 7 Analysis of the capsid protein Western blot of recombinant bacteria

2.2.3 芽胞表面展示TreS的免疫熒光分析

將重組菌接種至DSM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48h后收集芽胞．對芽胞進行處理后，熒光共聚焦顯微鏡進行觀察，結(jié)果如圖8所示．

圖8 重組菌的免疫熒光分析Fig. 8 Immunofluorescence analysis of recombinant bacteria

出發(fā)菌株所產(chǎn)芽胞無熒光現(xiàn)象，重組菌所產(chǎn)芽胞均有熒光現(xiàn)象，且共展示重組菌芽胞熒光較單Cot展示重組菌芽胞熒光量明顯增強，這說明重組菌成功將海藻糖合酶展示于芽胞表面，且共展示的海藻糖合酶量較單個展示的海藻糖合酶量有明顯的優(yōu)勢．

2.2.4 芽胞表面展示TreS的Dot blot分析

取 107個重組菌芽胞，提取芽胞衣殼蛋白，進行Dot Blot分析，結(jié)果如圖9所示．利用Image J軟件對結(jié)果圖像進行分析．通過對Dot blot結(jié)果圖的分析可得 3種重組菌的單個重組芽胞中所展示的海藻糖合酶分子數(shù)．其中重組菌 B. subtilis WB800n/cotC-treS和B. subtilis WB800n/cotG-treS單個芽胞所展示的海藻糖合酶分子數(shù)分別為 4.318×109和 2.361×109，而重組菌B. subtilis WB800n/cotC-treS-cotG-treS單個芽胞所展示的分子數(shù)為 7.366×109．由此可知，雙Cot共展示的蛋白分子數(shù)大于CotC和CotG展示分子數(shù)之和．

圖9 表面展示TreS的Dot blot分析Fig. 9 Dot blot analysis of surface display of TreS

2.2.5 芽胞表面展示TreS的酶活力分析

芽胞表面展示 TreS的酶活力分析(以芽胞干質(zhì)量計)結(jié)果如圖 10所示．由圖 10可知，重組菌 B.subtilis WB800n/cotG-treS的酶活力為484.51U/g，B.subtilis WB800n/cotC-treS的酶活力為 886.11U/g，B.subtilis WB800n/cotC-treS-cotG-treS的酶活力為1511.6U/g. 由此可知，B. subtilis WB800n/cotC-treS-cotG-treS的芽胞表面展示酶活力大于 B. subtilis WB800n/cotG-treS和B. subtilis WB800n/cotC-treS的芽胞表面展示酶活力之和．這一現(xiàn)象與Dot blot分析的 CotC與 CotG共展示在單個芽胞表面的 TreS酶分子數(shù)大于由單個Cot獨立展示的TreS酶分子數(shù)之和相一致．在相同菌體細胞生成相同的芽胞數(shù)所呈現(xiàn)的單位菌體酶活力與這一現(xiàn)象一致，即單位酶分子的酶活力是相同的，而展現(xiàn)的酶活力增加主要是因為酶的表面展示的分子數(shù)增加造成的．

圖10 芽胞表面展示TreS的酶活力Fig. 10 Enzyme activity of TreS on the surface of spare

3 結(jié) 論

枯草芽胞桿菌的芽胞表面有多種錨定蛋白，報道有多種錨定蛋白已成功用來展示外源蛋白．本實驗通過CotC和CotG分別在芽胞表面成功展示了外源海藻糖合酶，并且通過 CotC和 CotG兩種錨定蛋白在芽胞表面共展示了海藻糖合酶，經(jīng)免疫熒光、Western blot、Dot blot和酶活力檢測分析后，表明海藻糖合酶成功展示于芽胞表面，且雙Cot共展示的效果較單Cot展示具有明顯的增強效果．在TB培養(yǎng)基中，重組菌B. subtilis WB800n/cotC-treS-cotG-treS培養(yǎng) 96h后，芽胞表面展示的酶活力(以芽胞干質(zhì)量計)達到 1511.6U/g，芽胞表面展示的酶分子數(shù)為7.366×109，大于CotC和CotG獨立展示海藻糖合酶的酶活力(484.51U/g和 886.11U/g)及芽胞表面展示的酶分子數(shù)(4.318×109和 2.361×109)之和，該現(xiàn)象目前尚未有報道進行解釋．這一結(jié)果給了我們一些啟示：多個 Cot共展示外源蛋白時，可能存在一定的獨立性，即不同的Cot蛋白在芽胞表面的展示分布具有自己獨立的位點或在展示過程中具有區(qū)域性；當多Cot展示時，不同 Cot之間在轉(zhuǎn)運和錨定過程中可能存在一種相互影響機制，這種機制或許具有增強作用，或許在其他 Cot和錨定蛋白間存在消減作用，有待進一步探索；不同Cot蛋白在芽胞表面展示外源蛋白的分子數(shù)之間的差異性，可能存在一個表面結(jié)合位點初始表達量或是轉(zhuǎn)運過程中的多 Cot競爭性選擇特性，有待進一步探索．本實驗在給出上述啟發(fā)的同時，也給外源酶的微固定化應(yīng)用提供了一個思路，即通過芽胞這一微小的穩(wěn)定載體，可以通過多種Cot展示的方法，提高芽胞表面展示外源酶、蛋白和疫苗的量，降低單位制備成本，提高效率，可以根據(jù)不同Cot間的芽胞展示分子數(shù)差異展示不同的外源酶，實現(xiàn)多酶的協(xié)同應(yīng)用效果．