不同基因型花椰菜通用再生體系的構(gòu)建

汪玲敏 但忠 麻繼仙 木萬福 楊龍 李易蓉 蘇銀玲 唐正富

摘 要：以不同基因型花椰菜的薹莖段為試驗材料，篩選適宜花椰菜快速繁殖的培養(yǎng)基配方，構(gòu)建適用于不同基因型花椰菜的離體再生體系。結(jié)果表明：用75%C2H5OH消毒15s后，7%NaClO消毒10min處理不同基因型花椰菜的外植體，污染率為0，且莖段不變色、不影響后期分化;6-BA是理想的花椰菜不定芽誘導(dǎo)的細(xì)胞分裂素，6-BA 1mg/L+IBA 0.5mg/L是最佳的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基;ZT 2mg/L+NAA0.1mg/L是最佳的促進不定芽快速生長的激素組合;6-BA 1mg/L+NAA 0.5mg/L是最佳的不定芽繼代增殖的激素組合;MS+IBA 0.1mg/L+IAA 0.1mg/L是最佳的促進無菌苗生根的培養(yǎng)基。

關(guān)鍵詞：花椰菜;基因型;再生體系

中圖分類號 S635.3文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A文章編號 1007-7731（2020）（02-03）-0020-05

Construction of Universal Regeneration System of Different Genotypes of Cauliflower

Wang Lingmin et al.

（Institute ofTropical Eco-agriculture， Yunnan Academy of Agricultural Sciences/Yuanmou Dry-Hot Valley Botanical Garden， Yuanmou 651300， China）

Abstract：In this study， the stolon segment of different genotypes of cauliflower were used as materials to screen the medium suitable for the rapid propagation of cauliflower， and the in vitro regeneration system suitable for different genotypes of cauliflower was constructed. The results showed that the explants of various cauliflower varieties were treated with 75% C2H5OH for 15 s and 7% NaClO for 10 min. The contamination rate was 0， the stolon segmentl didnt change color and affect the later differentiation. 6-BA was the optimum hormone for cauliflower adventitious bud induction.6-BA 1mg/L+IBA 0.5mg/L is the best adventitious bud induction medium; ZT 2mg/L+NAA 0.1mg/L is the best hormone combination to promote the rapid growth of adventitious buds;6 -BA 1 mg/L+NAA 0.5 mg/L is the best combination of hormones for adventitious bud regeneration; MS+IBA 0.1 mg/L+IAA 0.1 mg/L is the best medium for promoting sterile shoot rooting.

Key words： Cauliflower; Genotype; Regeneration system

花椰菜（Brassica oleracea L. var. botrytis L.）是一二年生的草本植物，屬十字花科蕓薹屬甘藍(lán)種以花球為產(chǎn)品的一個變種。近年來，由于花椰菜中含量較高的葡萄糖苷具有抗癌作用[1-2]，且營養(yǎng)豐富、口感脆嫩，深受廣大消費者的喜愛，成為了世界范圍內(nèi)重要的蔬菜作物之一。傳統(tǒng)的花椰菜育種常采用常規(guī)的雜交育種手段，需要花費大量的人力物力才有可能得到具有優(yōu)良性狀的親本，不僅耗時長、效率低，且難以創(chuàng)制新的種質(zhì)。基因工程育種是定向?qū)ㄒ诉M行遺傳改良，為花椰菜新品種的選育提供了一條有效的途徑。以基因工程為核心的育種手段解決了許多傳統(tǒng)育種不能突破的問題[3]，而建立其離體再生體系是花椰菜進行遺傳轉(zhuǎn)化的重要一環(huán)。

目前，對于花椰菜離體再生體系的研究，國內(nèi)外以花球、子葉、下胚軸、葉片、薹莖段、腋芽等為材料，雖已建立了一些花椰菜品種的再生體系，如建立了147花椰菜和慶農(nóng)65天[4]、白靈花椰菜[5]、春秋花椰菜[6]、花椰菜雄性不育系[7-8]以及花椰菜自交不親和系160（中晚熟）[9]等品種的再生體系，但由于花椰菜品種眾多，不同品種間基因型存在差異，前人多是針對某一特定品種建立其再生體系，而在其他種類的花椰菜運用中未必適合。在進行花椰菜遺傳轉(zhuǎn)化研究時，適用于不同基因型花椰菜的再生體系的構(gòu)建能使研究更加方便、快捷。

本研究以24個基因型花椰菜為研究對象，篩選適宜花椰菜離體組織快速繁殖的通用培養(yǎng)基，構(gòu)建適用于不同基因型花椰菜的離體再生體系，為后續(xù)花椰菜遺傳轉(zhuǎn)化的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 供試材料有云松花1號、云松花8號、云花菜11710、云花菜11714、YNb-1、YNb-7、慶農(nóng)65天、慶農(nóng)90天、慶農(nóng)100天、夏雪40天、臺松90天、優(yōu)松60、白玉88、C1716-2、C1718-1、C1724-1、C1725-1、FJW7-1、泰國耐熱40天、12-1、12-2、慶美80天、華美90天等24個花椰菜品種（見表1），均來自云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱區(qū)生態(tài)農(nóng)業(yè)研究所試驗地。

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件 以MS為不定芽誘導(dǎo)、不定芽快速生長、繼代增殖及生根的基本培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中均附加蔗糖30g/L，瓊脂7g/L，pH值5.8。于121℃高壓滅菌鍋滅菌25min。接種后將外植體置于25℃培養(yǎng)箱中，光照強度2500lx，光照時間12h/d。

1.3 試驗方法

1.3.1 外植體消毒 從供試植株上采取新鮮健康薹莖段，流水沖洗10min，再用洗滌劑清洗5min，洗凈后吸水紙吸干，用75%乙醇消毒數(shù)秒或0.1%升汞消毒數(shù)分鐘，無菌水清洗3遍，再用7%次氯酸鈉消毒數(shù)分鐘后，無菌水清洗3遍，用無菌吸水紙吸干水分備用，接種時，每個處理每個基因型接種5瓶，每瓶接種5個外植體，5d后統(tǒng)計污染率，10d后統(tǒng)計褐化率。同一基因型在同一處理中的污染數(shù)用wn表示，n表示1～24個基因型花椰菜，若在同一處理中有一個外植體污染則wn=1，若同一處理中外植體無污染則wn=0，平均污染率W（%）=（w1+w2+w3+……+w24）/24×100。同一基因型在同一處理中的褐化數(shù)用hn表示，若同一處理中有1個外植體褐化則hn=1，若同一處理中外植體無褐化則Hn=0，平均褐化率H（%）=（h1+h2+h3+……+h24）/24×100。

1.3.2 不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng) 將不同基因型花椰菜消毒后的薹莖段切成帶一個葉柄的小段接入不同的分化培養(yǎng)基中，每個培養(yǎng)基接種5瓶，每瓶5個外植體，3次重復(fù)，接種10d后統(tǒng)計24個基因型花椰菜的不定芽分化情況。以不定芽2葉1心，形態(tài)正常為計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計不同基因型花椰菜在不同處理中的不定芽分化情況，用pn表示不定芽分化情況，在同一處理中，若該基因型花椰菜分化率大于70%，則視為該基因型花椰菜在此培養(yǎng)基上成功分化，則pn=1，若該基因型花椰菜分化率小于70%，則視為該基因型花椰菜在此培養(yǎng)基上未成功分化，則pn=0;24個基因型花椰菜能在不同處理中成功誘導(dǎo)出不定芽的比率用P表示，P（%）=（p1+p2+p3+……+p24）/24×100。用qn表示不同基因型花椰菜誘導(dǎo)出不定芽的玻璃化情況，若該基因型花椰菜在此培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出的不定芽玻璃化率占該基因型外植體接種總數(shù)的10%，則視為該基因型花椰菜在此培養(yǎng)基上玻璃化，則qn=1，反之qn=0;24個基因型花椰菜在不同處理中不定芽玻璃化的比率用Q表示，Q（%）=（q1+q2+q3+……+q24）/24×100。

1.3.3 不定芽快速生長培養(yǎng) 將上述誘導(dǎo)出的不定芽單株分離后接入不定芽快速生長培養(yǎng)基，每個培養(yǎng)基接種5個不定芽，每個基因型接種5瓶，重復(fù)3次，待不定芽莖干生長至2～3cm左右即可用于繼代增殖，7d后統(tǒng)計不定芽生長情況，用kn表示不同基因型花椰菜在同一處理中不定芽的快速生長情況，以7d后接種的同一個基因型花椰菜內(nèi)不定芽長至1.5～2cm的數(shù)量大于接種數(shù)50%為計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)，大于50%則視為該基因型花椰菜在該培養(yǎng)基上快速生長，則kn=1，反之kn=0;24個基因型花椰菜能在不同處理中不定芽快速生長的比率用K表示，K（%）=（k1+k2+k3+……+k24）/24×100。用tn表示不同基因型花椰菜誘導(dǎo)在快速生長培養(yǎng)基中不定芽的玻璃化及畸形苗情況，若該基因型花椰菜在此培養(yǎng)基上不定芽玻璃化及畸形苗率占接種總數(shù)的10%，則視為該基因型花椰菜不定芽在此培養(yǎng)基上玻璃化及畸形，則tn=1，反之tn=0;24個基因型花椰菜在不同處理中不定芽玻璃化及畸形苗的比率用T表示，T（%）=（t1+t2+t3+……+t24）/24×100。

1.3.4 不定芽繼代增殖培養(yǎng) 將上述生長至2～3cm左右的無菌苗去莖尖，切成1cm左右的小段，每段至少帶有1～2葉片，接入繼代增殖培養(yǎng)基，每個培養(yǎng)基接種5個莖段，每種基因型的花椰菜接種5瓶，3次重復(fù);將無菌苗去掉的莖尖部分繼續(xù)接入不定芽快速生長培養(yǎng)基中繼續(xù)生長，一周后統(tǒng)計統(tǒng)計不同基因型花椰菜從在各處理中不定芽繼代增殖的情況。用gn表示不同基因型花椰菜在同一處理中無菌莖段的增殖情況，以該基因型花椰菜在同一處理中80%的莖段長出腋芽為計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)，大于80%則視為該基因型花椰菜在此處理中成功繼代增殖，gn=1，反之則gn=0， 24個基因型花椰菜能在不同處理中無菌莖段繼代增殖的比率用G表示，G（%）=（g1+g2+g3+……+g24）/24×100。用fn表示不同基因型花椰菜在繼代增殖培養(yǎng)基中不定芽的玻璃化及畸形苗情況，若該基因型花椰菜在此培養(yǎng)基上不定芽玻璃化及畸形苗率占接種總數(shù)的10%，則視為該基因型花椰菜不定芽在此培養(yǎng)基上玻璃化及畸形，則fn=1，反之fn=0;24個基因型花椰菜在不同處理中不定芽玻璃化及畸形苗的比率用F表示，F(xiàn)（%）=（f1+f2+f3+……+f24）/24×100。

1.3.5 生根培養(yǎng) 將生長至2cm左右的無菌苗接入生根培養(yǎng)基，每個培養(yǎng)基接種5棵無菌苗，每個處理接種5瓶，重復(fù)3次，10d后統(tǒng)計無菌苗生根情況。用yn表示不同基因型花椰菜在同一處理中無菌苗的生根情況，以該基因型花椰菜在同一生根處理培養(yǎng)基中90%的無菌苗生根為計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)，生根數(shù)大于90%則視為該基因型花椰菜無菌苗在此處理中成功生根，yn=1，反之則yn=0，24個基因型花椰菜能在不同處理中無菌苗生根的比率用Y表示，Y（%）=（y1+y2+y3+……+y24）/24×100。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件分析，采用鄧肯法在0.05水平進行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒組合篩選 由表2可知，75%C2H5OH和0.1%HgCl對外植體污染率的控制有明顯效果，且隨著濃度的升高，污染率逐漸降低，但薹莖段對HgCl較為敏感，消毒后外植體均出現(xiàn)不同程度的褐化，從而影響了不定芽的分化。而75%C2H5OH對花椰菜離體薹莖段的消毒效果較好，但若消毒時間超過30s，薹莖段的褐化情況明顯加重。通常情況下，在對外植體進行消毒接種后，外植體若未消毒干凈，接種后的第3天培養(yǎng)基上即會出現(xiàn)真菌菌落;若為細(xì)菌污染，第5天在外植體與培養(yǎng)基接觸部位即會出現(xiàn)細(xì)菌菌落，7d后若培養(yǎng)基中未出現(xiàn)任何菌落，則表示外植體已消毒干凈。其中，75%C2H5OH消毒15s+7%NaClO消毒10min的消毒組合，均能將24個基因型花椰菜外植體消毒干凈，同時不影響后期不定芽的分化。

2.2 不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選 在薹莖段誘導(dǎo)不定芽過程中，5d左右腋芽位置分化出芽，10d左右芽長至2cm（圖1），即可與外植體分離并接入不定芽快速生長培養(yǎng)基中。從表3可以看出，在不同的激素組合處理下，都有不同數(shù)量基因型花椰菜誘導(dǎo)出不定芽，但不定芽誘導(dǎo)率存在顯著性差異。6-BA對花椰菜離體薹莖段誘導(dǎo)不定芽的能力顯著高于ZT與TDZ。但隨著6-BA濃度達(dá)到2～3mg/L時，誘導(dǎo)的不定芽畸形或玻璃化情況嚴(yán)重，而ZT與TDZ在不定芽誘導(dǎo)方面無顯著差異，這可能是由于花椰菜對6-BA較為敏感，故低濃度的6-BA就能促進大部分的花椰菜分化，而濃度過高則引起花椰菜激素中毒從而導(dǎo)致不定芽玻璃化及畸形。故較好的組合應(yīng)為處理7：6-BA 1mg/L +IBA 0.5mg/L，可使95.83%基因型的花椰菜誘導(dǎo)出正常健壯的不定芽;而24個基因型花椰菜中，晚熟品種云花菜11714在處理7的培養(yǎng)基中不定芽誘導(dǎo)率較低，只有少數(shù)正常苗，當(dāng)6-BA的濃度升高至2～3mg/L時，誘導(dǎo)的不定芽數(shù)量增多，但大部分為玻璃化苗，需在不定芽剛分化出的5d內(nèi)轉(zhuǎn)入ZT培養(yǎng)基緩苗，針對此基因型花椰菜的最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基需進一步研究。

2.3 不定芽快速生長培養(yǎng)基的篩選 從表4可以看出，不同基因型花椰菜的不定芽快速生長情況在不同的激素濃度組合處理間存在顯著性差異，ZT和6-BA在促進花椰菜不定芽生長方面無顯著性差異，但花椰菜對6-BA較為敏感，6-BA在促進不定芽生長過程中易引起植株玻璃化及形成畸形苗，原因可能是前一步利用6-BA作為細(xì)胞分裂數(shù)誘導(dǎo)不定芽分化，而后又利用6-BA促進其快速生長，造成6-BA在植株體內(nèi)過度積累而導(dǎo)致玻璃化及畸形苗;而ZT在促進不定芽生長時，無菌苗生長快，形態(tài)正常。故選擇處理2：ZT 2mg/L+NAA0.1mg/L作為促進不同基因型花椰菜不定芽快速生長的最佳培養(yǎng)基配方。通常情況下，2葉1心的花椰菜不定芽接入快速生長培養(yǎng)基7d后，莖達(dá)到1.5～2cm左右即可進行繼代增殖。

2.4 不定芽繼代增殖培養(yǎng)基的篩選 由薹莖段誘導(dǎo)出的不定芽經(jīng)過快速生長培養(yǎng)基培養(yǎng)后，得到健壯的花椰菜無菌苗，接入繼代增殖培養(yǎng)基7d后，從腋芽位置長出不定芽（圖3）。從表5可以得出，處理4：6-BA 1mg/L+NAA 0.5mg/L的不定芽繼代增殖率顯著高于其他處理，且不定芽玻璃化及畸形苗率也較低。值得注意的是，用6-BA作為細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)不定芽增殖時，當(dāng)不定芽長至0.5cm左右時就應(yīng)及時轉(zhuǎn)入不定芽快速生長培養(yǎng)基中，避免不定芽繼續(xù)生長后玻璃化。

2.5 生根培養(yǎng)基的篩選 無菌苗接入生根培養(yǎng)基后，4d左右最先在接入處理4的培養(yǎng)基中無菌苗根部出現(xiàn)白色點狀凸起，隨后3d有不定根長出，接種10d左右，不定根長至1～2cm（圖4）。從表6可以看出，處理4中生根率顯著高于其他處理，接種的24個基因型花椰菜生根率為100%，而處理1生根率也相對較高，但通過處理1生根的無菌苗根部會產(chǎn)生0.3～0.5cm左右的愈傷組織后再長出不定根，此不定根在后期移栽清洗培養(yǎng)基時易脫落，無菌苗根部愈傷組織也極度影響無菌苗的成活率;而通過處理4生根的無菌苗，生根快，不定根多、細(xì)長且不易脫落，移栽易成活。因此，最終選擇MS+0.1mg/L IBA+0.1mg/L IAA作為適合不同基因型花椰菜離體快繁的最佳生根培養(yǎng)基。

3 討論與結(jié)論

眾多研究表明，基因型是影響植株脫分化和再分化的重要因子[10]，總的來說，花椰菜屬于易于培養(yǎng)的植株種類，在不同激素組合及配比下極大部分基因型的花椰菜都易脫分化，只是分化效率高低不一。林琿等[4]在建立2個不同品種花椰菜的再生體系時得到在激素配比相同的條件下，不同品種的花椰菜不定芽分化率不相同;而李敏等[11]對多個花椰菜進行研究后得出，不同品種的花椰菜其最適宜分化的激素種類組合及濃度配比也各不相同。而本研究構(gòu)建的通用再生體系，雖不能使各基因型花椰菜都達(dá)到最佳的分化效率，但各基因型花椰菜都能在同一培養(yǎng)基中達(dá)到70%以上的分化率，且大部分基因型的花椰菜分化率在90%以上，增殖系數(shù)也較高。本研究發(fā)現(xiàn)，早熟及中熟品種的花椰菜脫分化較容易，增殖系數(shù)高，而晚熟品種相對難誘導(dǎo)，出現(xiàn)外源激素濃度低脫分化困難，而外源激素高誘導(dǎo)出的不定芽易玻璃化和畸形的情況，針對此類基因型花椰菜需進行后續(xù)研究。

植株生長和分化是內(nèi)源激素和外源激素共同作用的結(jié)果。從前人對不同基因型的花椰菜研究中發(fā)現(xiàn)，最佳的誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方中細(xì)胞分裂素多為6-BA，但濃度存在顯著差異，從0.5mg/L到3mg/L不等[4-9]。本研究發(fā)現(xiàn)，6-BA在花椰菜不定芽誘導(dǎo)方面起到了積極的促進作用，但濃度高于2mg/L時，部分基因型花椰菜誘導(dǎo)出的不定芽易出現(xiàn)畸形和玻璃化現(xiàn)象，而ZT在誘導(dǎo)脫分化時較6-BA次之，但在促進花椰菜不定芽生長時效果較好，生長快，不易出現(xiàn)畸形苗。因此，在建立不同基因型花椰菜離體再生體系時，可選擇6-BA誘導(dǎo)不定芽分化，選擇ZT進行后續(xù)不定芽促生長。用6-BA誘導(dǎo)莖段進行繼代增殖時，發(fā)現(xiàn)幼嫩莖段主要是從腋芽處分化不定芽，而稍老壯的莖段則主要是從莖段底部分化大量叢芽;且在進行生根培養(yǎng)時也出現(xiàn)幼嫩莖段生根慢，而稍老壯莖段生根較快，根系長的現(xiàn)象，推測可能是因為不同時期的植株或組織其內(nèi)源激素水平不同而引起外植體分化差異，后續(xù)將對植株內(nèi)部激素水平差異方面進行研究，探究其引起外植體不同分化情況的機理。

參考文獻(xiàn)

[1]Lee SA， Fowke JH，Lu W， et al. Cruciferous vegetables， the GSTP1 Ile105Val genetic polymorphism，and breast cancer risk[J]. Am J Clin Nutr.， 2008;87（3）：753–760. pmid：18326615.

[2]Tang L，Zirpoli GR，Guru K，et al. Consumption of raw cruciferous vegetables is inversely associated with bladder cancer risk[J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prevention.2008;17（4）：938-944.

[3]陶興林，胡立敏，朱惠霞.基因工程技術(shù)在花椰菜育種中的應(yīng)用[J].農(nóng)業(yè)科技通訊，2014（06）：288-290.

[4]林琿，朱海生，陳敏氡，等.花椰菜高頻離體再生體系的構(gòu)建[J].分子植物育種，2017，15（12）：5060-5064.

[5]黃俊軒，李雙躍，李建科，等.花椰菜葉片離體再生技術(shù)的研究[J].天津農(nóng)學(xué)院學(xué)報，2006（04）：21-23.

[6]邢堃.花椰菜葉片離體再生技術(shù)的研究[J].農(nóng)民致富之友，2015（11）：113.

[7]方淑桂，朱朝輝，林翮飛，等.花椰菜種株的組培快繁技術(shù)探討[J].福建農(nóng)業(yè)科技，2013（10）：28-30.

[8]許傳懷，郭春曉，曲光炯，等.花椰菜雄性不育系種苗的組培快繁技術(shù)研究[J].中國園藝文摘，2014，30（09）：41-42.

[9]許端祥，方淑桂，陳文輝.花椰菜自交不親和系組培快繁技術(shù)研究[J].福建農(nóng)業(yè)科技，2006（05）：32-34.

[10]Burbulis N.，Blinstrubiene A.，Kuprieneet R.，et al. In vitro regeneration of Brassica napus L. shoots from hypocotyls and stem segments[J].Zemdirbyste-Agriculture，2009，96（3）：176-185.

[11]李敏，祝全華，聶晶，等.六種花椰菜不同器官無性系建立的研究[J].哈爾濱師范大學(xué)：自然科學(xué)學(xué)報，2004（06）：85-89.

（責(zé)編：張宏民）