SB203580對LPS誘導(dǎo)的肺泡巨噬細胞NR8383促炎表型的影響

李桂榮，沈忱悠，楊振坤，談建新，趙晶晶，鄒 健，聶曉偉，陳靜瑜

肺泡巨噬細胞是肺組織中的天然免疫細胞，占肺組織常駐細胞的85%以上，具有分泌、吞噬、促炎、抗炎和組織修復(fù)的功能，是肺組織的第一道防御[1-4]。多樣性和可塑性是巨噬細胞的顯著特征，能夠根據(jù)周圍組織微環(huán)境的變化呈現(xiàn)不同的表型。巨噬細胞表型分類有兩種：一種是經(jīng)典的M1型，表型標志蛋白有iNOS、TNF-α、IL-12、IL-6等，是促炎的表型，釋放促炎因子及介質(zhì)，促進炎癥的發(fā)展；另一種是可替代性的M2型，表型標志蛋白有精氨酸酶1(Arg1)、IL-10、發(fā)現(xiàn)于炎癥分子區(qū)1(FIZZ1)等，是抗炎的表型，能夠釋放抑炎因子及介質(zhì)，促進組織的修復(fù)。因此，肺泡巨噬細胞在肺組織炎癥的生理發(fā)展過程中有關(guān)鍵的免疫調(diào)節(jié)作用[5-6]。在巨噬細胞活化的過程中，一些蛋白分子對其表型有關(guān)鍵的調(diào)控作用，如IRF5蛋白作為干擾素調(diào)節(jié)因子家族的一個重要成員，對炎癥性的巨噬細胞表型有關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。在M2型巨噬細胞中過表達IRF5導(dǎo)致M2型轉(zhuǎn)化成M1型，在M1巨噬細胞中敲掉IRF5巨噬細胞，導(dǎo)致M1巨噬細胞轉(zhuǎn)化成M2巨噬細胞[7]。p38MAPK信號途徑是MAPK信號通路的關(guān)鍵分支之一，參與到細胞周期、細胞應(yīng)激以及炎癥等多種病理生理過程。p38MAPK在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平參與到炎癥介質(zhì)的合成，是抗炎治療的靶標之一。SB203580能夠特異性地抑制p38MAPK的磷酸化，抑制p38MAPK信號通路。本研究旨在探討SB203580對肺泡巨噬細胞極化作用的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料：配制SDS-PAGE電泳膠的試劑有30%丙烯酰胺-甲叉雙丙烯酰胺(30%Acr-Bis)、分離膠緩沖液、濃縮膠緩沖液、過硫酸銨、TEMED以及二抗(HRP標記的羊抗鼠二抗，HRP標記的羊抗兔二抗)均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司?？贵w如IRF5、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、Arg1購自Abcam公司，內(nèi)參抗體β-actin購自康為世紀生物公司。熒光二抗、含DAPI染料的防淬滅封片劑購自Invitrogen公司。胎牛血清、胰酶、雙抗，購自BI公司，F(xiàn)-12K培養(yǎng)基購自Thermo公司。肺泡巨噬細胞NR8383購自復(fù)旦IBS細胞資源中心。

1.2 實驗方法

1.2.1 炎癥細胞模型的建立：從液氮中取出凍存肺泡巨噬細胞NR8383進行復(fù)蘇，用含15%胎牛血清的培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)；細胞傳至2～3代后鋪6孔板，LPS刺激細胞，給藥濃度2 μg/mL，形成炎癥細胞模型；在SB203580抑制劑組，提前30 min給予SB203580，給藥濃度50 μM，然后用LPS刺激。對照組給予與實驗組相同體積的PBS。每個實驗組設(shè)3個平行樣，24 h后，收集細胞，用于后續(xù)實驗。

1.2.2 Western blot實驗：收集6孔板中的細胞，每孔給予150 μl 裂解液，置于冰上，裂解10 min，12 000 r/min，4 ℃離心，取上清液，得到裂解的細胞蛋白溶液。加入蛋白上樣緩沖液，100 ℃煮沸5 min，SDS-PAGE電泳，70 V電壓轉(zhuǎn)膜2 h，5%牛奶室溫封閉1 h，一抗IRF5、iNOS、p-NFκB p65、IκBα及內(nèi)參β-actin分別孵育，4 ℃過夜。TBST洗滌3次后，在室溫孵育HRP標記的二抗1.5 h，洗滌后ECL底物發(fā)光顯色。G：Box 凝膠成像系統(tǒng)曝光，采集數(shù)據(jù)，Image J 軟件對條帶進行灰度分析，分別計算目標蛋白和內(nèi)參蛋白β-actin的灰度值，目標蛋白與內(nèi)參蛋白β-actin的比值作為各組實驗依據(jù)。

1.2.3 細胞免疫熒光實驗：細胞建模后，收集懸浮的肺泡巨噬細胞，PBS洗滌后重懸，調(diào)整細胞濃度1×106個/mL，取30 μl細胞懸液滴在載玻片上，風(fēng)干后以4%多聚甲醛固定，用含0.2% TritonX100的PBS洗滌3次，10 min/次，5%的牛奶封閉30 min，在含有1% BSA的PBS溶液中孵育兔源一抗iNOS，4 ℃過夜。PBS洗滌3次，山羊抗兔的熒光二抗Alexa Flour 488室溫孵育1 h，PBS洗滌3次，含DAPI染料的防淬滅封片劑封片。用萊卡共聚焦顯微鏡拍照。

2 結(jié)果

2.1 SB203580對肺泡巨噬細胞中IRF5蛋白表達的影響：Western blot檢測肺泡巨噬細胞中IRF5蛋白表達變化，LPS組中 IRF5蛋白與β-actin內(nèi)參蛋白條帶的灰度比值為0.496 3，對照組為0.395 4，SB203580處理組為0.305 7。用LPS刺激后，細胞中IRF5蛋白表達增加，蛋白條帶灰度分析與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。給予SB203580后，IRF5蛋白表達顯著被抑制，蛋白條帶灰度分析結(jié)果顯示，與LPS刺激組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1(目錄后)。

2.2 SB203580對肺泡巨噬細胞M1表型標志蛋白的影響：巨噬細胞M1表型的標志蛋白iNOS在LPS刺激后表達增加(與內(nèi)參條帶灰度比為0.8185)，與對照組(與內(nèi)參條帶灰度比為0.0832)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；給予抑制劑SB203580處理后(與內(nèi)參條帶灰度比為0.66)iNOS的表達下降，與LPS刺激組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。細胞免疫熒光實驗顯示在LPS處理后，細胞中iNOS的熒光強度增加；SB203580處理后，細胞中iNOS的熒光強度減弱。因此，SB203580抑制了肺泡巨噬細胞NR8383的促炎表型，見圖2(目錄后)。

2.3 SB203580對肺泡巨噬細胞中NFκB信號通路的影響：LPS刺激肺泡巨噬細胞后，NFκB信號通路被激活，p-NFκB p65高表達(與內(nèi)參條帶灰度比為1.222)，與對照組(與內(nèi)參條帶灰度比為0.360 1)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；給予SB203580后，抑制了LPS誘導(dǎo)的肺泡巨噬細胞中NFκB信號通路的激活，p-NFκB p65表達被抑制(與內(nèi)參條帶灰度比為0.679 7)，與LPS刺激組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

肺泡巨噬細胞是肺組織常駐細胞，在肺組織的穩(wěn)態(tài)和各種肺部疾病的免疫防御中發(fā)揮重要的作用，如在急性呼吸窘迫綜合征、慢性阻塞性肺疾病、囊性纖維化等疾病中發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[8-9]。多樣性和可塑性是巨噬細胞的顯著特征，在不同的環(huán)境下，肺泡巨噬細胞呈現(xiàn)出不同的表型，即經(jīng)典的M1和可選擇性的M2型，發(fā)揮不同的免疫調(diào)節(jié)作用。IFN-γ，TNF或Toll-like receptor(TLR)的配體刺激巨噬細胞，巨噬細胞呈現(xiàn)M1表型，釋放促炎的因子，加劇組織的損傷；IL-4，IL-13或M-CSF刺激巨噬細胞呈現(xiàn)M2型，釋放抗炎的因子，促進組織的修復(fù)。不同的微環(huán)境下，巨噬細胞呈現(xiàn)不同的表型，同時涉及各種蛋白的過表達及各種信號通路的激活。本研究在體外的肺泡巨噬細胞炎癥模型中，給予p38MAPK信號通路的抑制劑SB203580，抑制了肺泡巨噬細胞的促炎表型；此外，SB203580還抑制了肺泡巨噬細胞中NFκB信號途徑的激活，這說明在LPS誘導(dǎo)的肺泡巨噬細胞的炎癥表型中，伴隨著NFκB信號途徑的激活。

IRF5是干擾素家族的一個重要成員，表達在很多細胞中，如巨噬細胞、樹突細胞和B細胞[10]。IRF5在確定M1型炎癥巨噬細胞中起到關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，在人單核細胞和鼠骨髓細胞分化成炎癥巨噬細胞期間，IRF5被誘導(dǎo)表達，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)促炎因子[7，11]。本研究中，LPS刺激肺泡巨噬細胞NR8383后，IRF5表達顯著增加，M1巨噬細胞標志蛋白iNOS表達顯著增加，給予p38MAPK抑制劑SB203580后，IRF5表達被抑制，iNOS表達顯著下調(diào)，表明SB203580顯著地抑制了肺泡巨噬細胞的促炎表型。

NFκB信號途徑被認為典型的促進炎癥反應(yīng)的信號通路，能夠上調(diào)促進炎癥反應(yīng)的細胞因子，趨化因子和黏附分子的表達，在肺部疾病的炎癥反應(yīng)中有關(guān)鍵的免疫調(diào)節(jié)作用[12-13]。在本研究中，LPS誘導(dǎo)的肺泡巨噬細胞炎癥模型中，NFκB信號途徑被激活，p-NFκB p65表達顯著增加，給予SB203580后，p-NFκB p65表達下調(diào)，NFκB信號途徑的激活被抑制。SB203580對肺泡巨噬細胞促炎表型的抑制作用可能依賴于NFκB信號途徑激活。因此，SB203580具有通過抑制體內(nèi)肺泡巨噬細胞的促炎表型，進而抑制細胞內(nèi)促進炎癥反應(yīng)的NFκB信號通路的激活，達到治療肺組織炎癥疾病的目的。

總之，SB203580能夠體外抑制誘導(dǎo)的肺泡巨噬細胞的促炎表型，同時也抑制NFκB信號途徑的激活，這為臨床通過抑制肺泡巨噬細胞的促炎表型降低肺組織炎癥損傷提供實驗依據(jù)和理論基礎(chǔ)。