氧甾醇在肺部疾病中的作用及研究進(jìn)展

楚師成 高學(xué)軍 薛寶函 宋云浩 吳天宇

氧甾醇是膽固醇的氧化衍生物，由細(xì)胞色素P450家族酶介導(dǎo)的酶促反應(yīng)或涉及活性氧和氮類物質(zhì)的非酶反應(yīng)生成。氧化反應(yīng)促進(jìn)羥基、酮基、高氧基、羰基或環(huán)氧基添加到膽固醇主干上，主要是在側(cè)鏈的C4-C7位、C24、C25和C27位[1]。這一過(guò)程產(chǎn)生了一大類不同的氧甾醇，可以在正常的細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮著多種調(diào)節(jié)作用，如膽固醇穩(wěn)態(tài)，也可以參與多種病理生理過(guò)程，如炎性疾病、動(dòng)脈粥樣硬化、神經(jīng)疾病和癌癥。研究發(fā)現(xiàn)[2]，相同的氧甾醇對(duì)不同的細(xì)胞系具有不同的作用，而相同的細(xì)胞系對(duì)不同的氧甾醇反應(yīng)也不同?，F(xiàn)就氧甾醇在不同肺部疾病中的作用進(jìn)行綜述。

氧甾醇對(duì)免疫反應(yīng)的影響

先天淋巴細(xì)胞(Innate lymphoid cells, ILCs)是一種淋巴來(lái)源的免疫細(xì)胞，能對(duì)組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)的破壞迅速做出反應(yīng)。ILCs的器官分布不同，其主要存在于過(guò)多暴露在環(huán)境中的黏膜組織(如腸、肺)[3]。在穩(wěn)態(tài)組織和炎癥組織中ILCs的豐度也不盡相同[4]，哮喘患者的肺泡腔中存在產(chǎn)生IL-17的ILC3s。同樣，患有特發(fā)性肺纖維化的人的支氣管肺泡灌洗液中ILC2s含量增加。而在同一器官或組織中，ILCs的分布也有差異[5]。例如，ILC2s在肺內(nèi)靠近間質(zhì)細(xì)胞的血管周圍有明顯的聚集性。ILCs的這種分布差異可能與它們的遷移行為有關(guān)。GPR183-氧甾醇途徑在控制炎癥組織中ILCs遷移方面起著重要作用[6]。GPR183可以識(shí)別膽固醇的羥化代謝產(chǎn)物，即氧甾醇，其中7α,25-二羥基膽固醇(7α,25-dihydroxycholesterol,7α,25-OHC)是GPR183的主要配體。Tim等[7]證明了通過(guò)GPR183-氧甾醇途徑可以使ILC3s定位于炎性結(jié)腸部位，這對(duì)于結(jié)腸淋巴組織的形成至關(guān)重要。類似地，ILC2s可以定位于肺的炎性部位減輕病毒對(duì)肺的損傷。由此可以合理地假設(shè)，組織損傷引起的氧甾醇合成，增加向免疫系統(tǒng)傳遞組織穩(wěn)態(tài)的擾動(dòng)，啟動(dòng)ILCs運(yùn)動(dòng)和炎癥反應(yīng)。

氧甾醇與哮喘

哮喘被認(rèn)為是由于免疫穩(wěn)態(tài)失衡所致[8]，而免疫穩(wěn)態(tài)的恢復(fù)可以通過(guò)IL-10的表達(dá)來(lái)定義，IL-10是一種典型的抗炎細(xì)胞因子，可以協(xié)調(diào)終止免疫反應(yīng)[9]，缺乏這個(gè)調(diào)控檢查點(diǎn)可能會(huì)導(dǎo)致持續(xù)的炎癥反應(yīng)。因此有學(xué)者認(rèn)為IL-10在哮喘發(fā)生中起著重要作用[10]，它可以通過(guò)抑制肥大細(xì)胞分泌IL-13減少杯狀細(xì)胞增生以及減少嗜酸性粒細(xì)胞的產(chǎn)生控制哮喘發(fā)作。

研究表明，膽固醇生物合成途徑(cholesterol biosynthesis pathway,CBP)可以產(chǎn)生氧甾醇，如7-酮膽固醇(7-ketocholesterol,7-keto)，其參與了調(diào)節(jié)性T細(xì)胞中IL-10的基因表達(dá)[11]。 Esperanza等[12]通過(guò)免疫印記分析(Ingenuity pathway analysis,IPA)提出膽固醇生物合成相關(guān)的多條路徑與IL-10表達(dá)顯著相關(guān)；IPA還顯示，IL-10前體群表達(dá)的CBP基因與IFN-γ+IL-10+雙陽(yáng)性群體中IL-10蛋白水平呈負(fù)相關(guān)，提示可能需要活躍的膽固醇生物合成來(lái)許可Th1細(xì)胞表達(dá)IL-10。而與IL-10-人群相比，IL-10+的人群具有更高水平的CBP相關(guān)基因。由此可以看出，Th1轉(zhuǎn)換為IL-10表達(dá)與CBP有直接聯(lián)系，也為哮喘的控制提供了新的治療思路。

氧甾醇與慢性阻塞性肺疾病

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是全世界慢性死亡和發(fā)病的主要原因，其治療選擇有限，特點(diǎn)是由于長(zhǎng)期暴露于有毒氣體和顆粒物，特別是香煙煙霧(Cigarette Smoke,CS)中，導(dǎo)致漸進(jìn)性且不可逆的氣流受限[13]。越來(lái)越多的證據(jù)支持誘導(dǎo)性支氣管相關(guān)淋巴組織(inducible bronchus-associated lymphoid tissue,iBALT)在COPD發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用[14-15]。iBALT是一種三級(jí)淋巴器官，主要位于支氣管上皮旁，具有抗病毒感染的能力。然而，它們可能對(duì)COPD等慢性炎癥產(chǎn)生不利影響[16]。膽固醇的氧甾醇代謝最近已成為調(diào)節(jié)次級(jí)淋巴組織結(jié)構(gòu)和功能的中心途徑[17]。

iBALT的大小和數(shù)量與患者COPD的嚴(yán)重程度相關(guān)[14]，膽固醇25-羥化酶(cholesterol 25-hydroxylase,CH25H)和膽固醇25α7羥化酶(25-hydroxycholesterol-7α-hydroxylase,CYP7B1)共同參與7α,25-OHC的合成。Jie等[18]通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，在COPD患者和CS暴露的小鼠中，氣道上皮細(xì)胞CH25H和CYP7B1的表達(dá)上調(diào)，調(diào)節(jié)了CS誘導(dǎo)的B細(xì)胞遷移和iBALT的形成，而CH25H缺乏的小鼠在慢性CS暴露后不在肺內(nèi)產(chǎn)生iBALT，并對(duì)COPD的發(fā)生有保護(hù)作用。有趣的是，單獨(dú)的促炎細(xì)胞因子TNF-α也能夠誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞CH25H的表達(dá)增強(qiáng)，這表明除了CS暴露對(duì)氣道上皮細(xì)胞的直接影響外，促炎環(huán)境也能夠增強(qiáng)CH25H的表達(dá)?？嗣惯蛲ㄟ^(guò)抑制CYP7B1抑制7α,25-OHC的產(chǎn)生，不僅可以阻止iBALT的形成，而且能夠破壞已建立的iBALT，并減弱CS誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性COPD。有學(xué)者觀察到COPD患者的成纖維細(xì)胞和氣道上皮細(xì)胞衰老明顯加快[19]，他們發(fā)現(xiàn)COPD患者的氣道中還存在由CYP7B1驅(qū)動(dòng)合成的27-羥基膽固醇(27-hydroxycholesterol,27-OHC)，其水平是健康人的30～100倍，它可以通過(guò)PGE2-RNS途徑加速成纖維細(xì)胞及氣道上皮細(xì)胞的衰老。綜上所述，這表明COPD存在治療機(jī)會(huì)，特別是考慮到目前針對(duì)COPD的治療方案并不能逆轉(zhuǎn)肺氣腫的進(jìn)展，這為COPD的治療提供了新的靶點(diǎn)。

氧甾醇與急性肺損傷

急性肺損傷(acute lung injury,ALI)具有相當(dāng)高的死亡率，特點(diǎn)是難治性低氧血癥、非心源性肺水腫、肺順應(yīng)性降低和彌漫性肺浸潤(rùn)，常導(dǎo)致呼吸衰竭。重癥肺炎是它的主要原因，其治療方法極其有限，目前尚無(wú)針對(duì)性的特效藥物[20]。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是引起包括危及生命的肺炎在內(nèi)的嚴(yán)重疾病的革蘭氏陰性細(xì)菌的一種成分，LPS觸發(fā)的免疫反應(yīng)需要它與細(xì)胞表面的Toll樣受體4(Toll‐like receptor 4，TLR4)輔助受體髓樣分化蛋白2(myeloid differentiation protein -2， MD-2)結(jié)合。TLR4通過(guò)輔助蛋白的介導(dǎo)識(shí)別與MD-2相互作用的LPS的脂鏈，并與其形成LPS-TLR4-MD-2復(fù)合體，激活NF-κB的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致IL-6、TNF-α和IL-8等促炎細(xì)胞因子的過(guò)度產(chǎn)生[21]。

最近的一項(xiàng)研究觀察到[22]，25-羥基膽固醇(25-hydroxycholesterol,25HC)減少了IL-1β的產(chǎn)生和炎性小體的活性，從而促進(jìn)了感染性休克的恢復(fù)，Ouyang等[23]通過(guò)實(shí)驗(yàn)得出25HC預(yù)處理可顯著降低LPS誘導(dǎo)的IL-1β、IL-6、TNF-α、KC和MIP-2等促炎細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生，驗(yàn)證了這一結(jié)果。他們通過(guò)熒光光譜進(jìn)一步觀察到，隨著25HC濃度的增加，重組人MD-2(Recombinant human MD-2,rhMD-2)的熒光強(qiáng)度逐漸降低，表明25HC與MD-2具有較高的結(jié)合親和力。利用AutoDock程序?qū)?5HC的結(jié)合預(yù)測(cè)表明，在最有利的條件下，它與MD-2的Tyr-102、Tyr-65、Ile-117和Leu-71殘基接近，與Tyr-102殘基形成氫鍵?？偟膩?lái)說(shuō)，他們揭示了25HC的抗炎機(jī)制主要是通過(guò)與MD-2的疏水結(jié)構(gòu)結(jié)合，阻止LPS與TLR4-MD-2復(fù)合物結(jié)合，從而削弱下游Akt/NF-κB信號(hào)通路的激活，抑制炎性細(xì)胞因子的誘導(dǎo)，這預(yù)示著MD-2有可能成為治療LPS毒性作用的靶點(diǎn)，為ALI的治療提供了新思路。

氧甾醇的促癌作用

除了在炎癥和免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用外，氧甾醇還與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。羥基膽固醇可以通過(guò)肝X受體(liver X receptors,LXR)依賴途徑抑制樹(shù)突細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)[24]，也可以通過(guò)LXR非依賴途徑招募大量具有致腫瘤作用的免疫細(xì)胞[25]。羥基膽固醇通過(guò)激活LXR顯著促進(jìn)乳腺癌的轉(zhuǎn)移，但LXR的激活抑制黑色素瘤的轉(zhuǎn)移[26]。25HC還可以通過(guò)影響巨噬細(xì)胞分泌IL-1β[22]，參與多種類型腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[27]。根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)推測(cè)氧甾醇可能參與了肺癌的侵襲和遷移。

為了驗(yàn)證這一猜想，Chen等[28]對(duì)肺腺癌(Lung adenocarcinoma,ADC)細(xì)胞(A549和NCL-H1975)和THP1來(lái)源的巨噬細(xì)胞單獨(dú)或共同培養(yǎng)，通過(guò)在培養(yǎng)液中加入25HC形成對(duì)照，觀察25HC在肺癌中的作用。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)25HC通過(guò)劑量依賴性抑制肺癌細(xì)胞的增殖，而為排除這種效應(yīng)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，他們選用微摩爾濃度(0.1 μM)的25HC用于之后的實(shí)驗(yàn)。通過(guò)實(shí)驗(yàn)得出25HC可以提高LXR及腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移性蛋白Snail的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)ADC細(xì)胞遷移和侵襲。在敲除LXR之后，25HC的這些效應(yīng)則被阻斷。他們發(fā)現(xiàn)在含有25HC的單培養(yǎng)中THP1來(lái)源的巨噬細(xì)胞分泌IL-1β水平略有下降，這與以前的結(jié)果一致[22]。而有趣的是，在含有25HC的共培養(yǎng)體系中，IL-1β水平顯著升高，且IL-1β能模擬25HC促進(jìn)ADC細(xì)胞遷移、侵襲以及上調(diào)Snail表達(dá)的效應(yīng)，但對(duì)LXR的表達(dá)沒(méi)有影響。在敲除LXR后其效應(yīng)也沒(méi)有明顯改變。因此，25HC可以通過(guò)提高LXR表達(dá)及誘導(dǎo)IL-1β分泌以非LXR依賴的方式來(lái)促進(jìn)ADC細(xì)胞的遷移和浸潤(rùn)，這為肺腺癌的治療提供了新思路。

氧甾醇的抑癌作用

HH-GLI通路與肺癌等眾多癌癥發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[29]。雖然這一途徑是由HH配體通過(guò)自分泌信號(hào)激活的，但它也可以啟動(dòng)腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞的旁分泌。以旁分泌為橋梁，HH信號(hào)可以影響腫瘤微環(huán)境中的基質(zhì)細(xì)胞，基質(zhì)細(xì)胞反過(guò)來(lái)產(chǎn)生可能支持腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的因子。因此，這種共振串?dāng)_可以放大HH信號(hào)并促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[30]。致病的HH-GLI通路激活可能發(fā)生在HH信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)的多個(gè)水平，包括Ptch1、Smo和Sufu的突變，以及通過(guò)產(chǎn)生HH蛋白和自分泌旁分泌信號(hào)，對(duì)HH信號(hào)進(jìn)行無(wú)調(diào)控的刺激[30]。直接的Smo拮抗劑已經(jīng)被研究用來(lái)抑制異常的HH信號(hào)以干預(yù)腫瘤的形成。不過(guò)到目前為止，Smo拮抗劑在人類癌癥的臨床試驗(yàn)中幾乎沒(méi)有顯示出療效[31]。GLI轉(zhuǎn)錄因子是HH信號(hào)的效應(yīng)因子，介導(dǎo)了HH-GLI途徑激活的轉(zhuǎn)錄效應(yīng)[32]。突變的KRAS和TGF-β信號(hào)都可以以不依賴于Smo的方式誘導(dǎo)GLI活性[33]。實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，GLI1與小細(xì)胞和非小細(xì)胞肺癌都有不可忽視的聯(lián)系[34]。Kasai[35]認(rèn)為GLI1可以被認(rèn)為是Smo下游HH-GLI途徑中的一個(gè)可用藥的治療靶點(diǎn)。因此，與Smo拮抗劑相比，直接靶向GLI可能是實(shí)現(xiàn)肺癌等其他癌癥精準(zhǔn)治療的一種更有效的策略。

氧甾醇20α,22(R)-二羥基膽固醇(20α, 22(R)‐dihydroxycholesterol,Oxy16)，是類固醇激素生物合成中膽固醇的天然代謝物。Wang等[31]發(fā)現(xiàn)Oxy16可以阻斷由胰腺癌細(xì)胞產(chǎn)生的HH蛋白激活的間質(zhì)細(xì)胞中的HH信號(hào)。在熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)Oxy16顯著抑制了NIH3T3-E1成纖維細(xì)胞中過(guò)表達(dá)的GLI1的轉(zhuǎn)錄活性和Sufu-/-小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonic fibroblasts,MEF細(xì)胞)中內(nèi)源性GLI的轉(zhuǎn)錄活性。因此，我們有理由認(rèn)為Oxy16和具有相似或改進(jìn)特性的類似物成為肺癌等惡性腫瘤的新的候選治療藥物。基于這種設(shè)想，他們又驗(yàn)證了Oxy16類似物Oxy186對(duì)HH-GLI通路的抑制作用[36]。他們發(fā)現(xiàn)Oxy186對(duì)配體誘導(dǎo)和非配體依賴的HH信號(hào)有強(qiáng)烈的抑制作用。在HH配體激活的NIH3T3-E1細(xì)胞中，Oxy186對(duì)GLI的抑制作用明顯高于Oxy16，且優(yōu)于Gant61和HPI-1(它們已被確定可以在Smo下游抑制HH-GLI的先導(dǎo)分子[37])。此外，Oxy186有效地抑制了Smo變構(gòu)激活引起的HH信號(hào)，在Sufu-/-MEF細(xì)胞中，Oxy186顯著抑制HH靶基因的表達(dá)和GLI的內(nèi)源性活性。當(dāng)在人類癌細(xì)胞中檢測(cè)Oxy186時(shí)，他們觀察到PANC-1、A549和H2030細(xì)胞中內(nèi)源性GLI1的表達(dá)顯著受到抑制，這與在這些細(xì)胞中檢測(cè)到的Oxy186的抗增殖作用非常一致。因此，可以推測(cè)，氧甾醇，如Oxy186，可以通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞中配體的產(chǎn)生和成纖維細(xì)胞中對(duì)配體的間質(zhì)反應(yīng)，在腫瘤微環(huán)境中產(chǎn)生協(xié)同抑制效應(yīng)。同樣的，他們發(fā)現(xiàn)Oxy210[38]也具有相似的作用。這為肺癌的治療提供了新靶點(diǎn)。

綜上所述，氧甾醇作為膽固醇的中間代謝產(chǎn)物，不僅參與了肺部炎性疾病的發(fā)展與轉(zhuǎn)歸，還對(duì)肺癌的發(fā)展有著不可忽視的作用。尤其是一些新靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)，對(duì)肺部疾病的治療有著積極的推動(dòng)作用。但我們?nèi)孕柽M(jìn)一步研究氧甾醇及其對(duì)肺部疾病的影響，以制定更好的預(yù)防和治療策略。