血清核酸適配體在肺癌中的研究及其應(yīng)用進展

徐愛蘭 趙蘊偉

在全球范圍內(nèi)，肺癌是癌癥發(fā)病率和死亡率的主要原因，肺癌是最常見的癌癥，也是男性癌癥死亡的主要原因，其次是前列腺癌和結(jié)直腸癌(發(fā)病率)以及肝癌和胃癌(死亡率)。癌癥死亡的主要原因在不同國家和地區(qū)存在很大差異，這主要取決于社會經(jīng)濟發(fā)展程度以及相關(guān)的生活方式因素[1]。已知吸煙是導致肺癌的重要因素之一。但是人們在50歲以前，性別和吸煙這兩個因素對肺癌發(fā)病發(fā)展的影響并不大。我國女性的吸煙率低，但是我國女性的肺癌的發(fā)病率很高，這可能與她們長期接觸油煙、二手煙，煙霧暴露增加，以及環(huán)境的污染等因素相關(guān)[1]。在組織學分型中，肺癌主要是小細胞肺癌和非小細胞肺癌，非小細胞肺癌又可分為腺癌、鱗癌和大細胞癌。肺癌的發(fā)病機制復雜，同時存在基因以及組織學方面的異質(zhì)性，這些導致肺癌在治療方面具有一定的難度。盡管多年的研究和醫(yī)療方面取得進步，肺癌仍然是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因[2]。常規(guī)癌癥治療，如化療和放射治療，表現(xiàn)出嚴重的副作用，包括胃腸道不適、器官損害和低質(zhì)量生活[3]。在臨床中的大多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)肺癌時，可能已經(jīng)是中晚期階段，所以肺癌的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷對癌癥疾病的治愈具有重要意義[4]。隨著分子生物學技術(shù)的進展，核酸適配體(Aptamer)作為一種新型的高親和力、高特異性生物識別配體在生物醫(yī)學基礎(chǔ)與臨床應(yīng)用研究中變得越來越重要。所以本文就核酸適配體在肺癌中的研究及其應(yīng)用進展的情況作一綜述。

核酸適配體

一、核酸適配體的特點

核酸適配體是單鏈DNA(SsDNA)或RNA序列，通過指數(shù)富集(SELEX)技術(shù)系統(tǒng)進化配體從隨機文庫中選擇[5-6]。它們以高親和力和特異性與相對應(yīng)的靶標結(jié)合，并且具有快速靶向腫瘤穿透的能力[7]。核酸適配體可以應(yīng)用于各種疾病的治療，尤其包括肺癌等癌癥，因為它們具有很強的中和活性[8]。早在1990年，Tuerk等報道了一種新型的寡核苷酸篩選技術(shù),該技術(shù)與 PCR 擴增相結(jié)合，在體外人工構(gòu)建的短鏈核苷酸文庫中篩選出RNA核酸適配體[9]。核酸適配體可以折疊成三維結(jié)構(gòu)，可以通過形成不同的形狀結(jié)合到目標上，比如有發(fā)夾的結(jié)構(gòu)、呈凸環(huán)狀、還有的是四角環(huán)狀等，并通過形狀識別對應(yīng)物的方式結(jié)合到目標上，主要是通過范德華力、氫鍵、堿基堆積力等與靶標具有很高的特異性和親和力[8,10]。針對核酸適配體對靶點具有高度的親和力和特異性的特點，所以核酸適配體又稱為“化學抗體”，而且它的應(yīng)用范圍很廣，從目標檢測、傳遞到藥物應(yīng)用等[11]。

二、核酸適配體與抗體的比較

有研究表明，一般在動物身上開發(fā)的單克隆抗體，這種單克隆抗體在臨床應(yīng)用前是人源化的[11]。因此，生產(chǎn)治療性單克隆抗體需要使用非常大的哺乳動物細胞培養(yǎng)，而且需要在良好生產(chǎn)規(guī)范的條件下進行廣泛的純化，生產(chǎn)成本高?？贵w需要體外或體內(nèi)生產(chǎn)，這可能會增加批次之間的差異。總的來說，高生產(chǎn)成本、安全性和短保質(zhì)期，限制了這些抗體的廣泛使用[11]。所以，在許多方面，核酸適配體相對抗體來說具有多種優(yōu)勢，它們是中等分子大小，介于抗體和小分子之間[8]。它在體外化學合成時會減少批次之間的差異[12]，并且主要是以低成本，比單克隆抗體便宜數(shù)千倍，以及以高純度來進行化學合成[11]，可以作為生物特異性識別分子成功地與抗體競爭，并且可以針對幾乎任何靶標進行選擇，而且核酸適配體具有低分子量、無毒性和非免疫原性等特點[13]。非免疫原性和無毒的原因主要是由于核酸適配體的組成部分是核酸[14-15]。與大的單克隆抗體(約150 kDa)相比，核酸適配體的一個重要優(yōu)勢是它們的大小(5～15 kDa)[16]。因為核酸適配體比抗體小得多，所以核酸適配體具有更好的組織穿透能力以及更強的腫瘤組織內(nèi)化能力[12,17]。而且，核酸適配體分子量小，可以結(jié)合那些較大的抗體無法發(fā)現(xiàn)的隱藏的表位[18]。

三、核酸適配體的篩選

核酸適配體的體外篩選的方式是通過指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化技術(shù)(SELEX)產(chǎn)生的。核酸適配體的SELEX篩選技術(shù)發(fā)展很迅速。比如混合SELEX[19]、消減SELEX、毛細管電泳SELEX[20]等。由于核酸適配體是通過指數(shù)富集的配體的系統(tǒng)進化(SELEX)產(chǎn)生的，所以核酸適配體對靶目標具有高度的親和力和特異性。核酸適配體的產(chǎn)生需要經(jīng)歷反復的孵化、洗滌、分離、擴增的一系列步驟[21]。最初的文庫由隨機的RNA和DNA分子組成，與目標物、生物標記物、蛋白質(zhì)甚至整個細胞一起培養(yǎng)孵育。在孵育后，洗去未結(jié)合的序列，來分離和分離結(jié)合的序列。將結(jié)合序列從目標中洗脫出來，用聚合酶聯(lián)反應(yīng)(PCR)(基于RNA的逆轉(zhuǎn)錄PCR)進行擴增，這樣可以產(chǎn)生序列豐富的序列庫[18]。產(chǎn)生的序列庫要經(jīng)歷一輪又一輪的選擇和擴增等循環(huán)步驟，每一輪的循環(huán)都會降低序列庫的異質(zhì)性來進一步增加核酸適配體的親和力和特異性[18]，在進行親和力分析后，把具有最好的親和力和特異性的序列池進行克隆和測序，或者進行下一代測序，來確保核酸適配體的敏感性和特異性。

四、核酸適配體的修飾

核酸適配體在實際應(yīng)用中有一些局限性。在人血清中，由于核酸酶的存在，未經(jīng)修飾的RNA和DNA核酸適配體都容易降解，其中RNA更敏感，因為核糖位置有20個羥基[18,21]。所以人體血清中的核酸酶加大對核酸適配體降解的敏感性，由于核酸適配體是相對較小的分子(5～15 kDa)，它們很容易被腎臟排泄[15]。這些問題都制約著核酸適配體的進一步研究及應(yīng)用。

隨著核酸化學的發(fā)展，可以進一步對核酸適配體進行合成和修飾，增強對肺腺癌等惡性腫瘤具有高度特異性的分子顯像功能，增加選擇性和特異性，以及與癌癥生物標記物結(jié)合的能力，更有助于靶向成像[22]。防止核酸外切酶降解核酸適配體的一種常見方法是限制核酸鏈的30和/或50端[23]，研究延緩核酸適配體從血液中排泄，以及改善它的藥代動力學的解決方案是與膽固醇或聚乙二醇結(jié)合，稱為聚乙二醇化，通過二者結(jié)合來增加低分子物質(zhì)的血清保留時間[15,24]。為了增加對核酸內(nèi)切酶介導的降解的穩(wěn)定性，可以用硫取代磷酸骨架來修飾核苷酸間連接，創(chuàng)建硫代磷酸鍵，增加核酸適配體的穩(wěn)定性[24-25]。RNA核酸適配體，可以通過修飾核糖的高度核酸酶敏感的20-羥基來增加血清半衰期和核糖核酸酶抗性[18,21]，這些修飾包括用氟(F)、烷基、氨基(NH2)或硫基取代20-羥基。修飾的核苷酸可以在SELEX的篩選過程之前或者之后進行，因為修飾的核苷酸和SELEX的步驟不能同時進行，而且在篩選之后的修飾更容易、更便宜，但可能會對核酸適配體的結(jié)合屬性和功能產(chǎn)生一定的影響[22]。

核酸適配體的遞送系統(tǒng)

核酸適配體在臨床治療及應(yīng)用中的研究越來越深入，核酸適配體需要相應(yīng)的遞送系統(tǒng)來發(fā)揮其治療作用。

在之前的報道中，mRNA-29b在mRNA 29家族中表達最豐富[26]。mRNA-29b通過控制細胞分化、凋亡和增殖在肺癌治療中發(fā)揮關(guān)鍵作用[27-30]。mRNA 29b在肺癌細胞中下調(diào)或者沉默，可以抑制腫瘤生長，所以mRNA 29b是一種很大潛力的癌癥候選基因。但是，它們的治療應(yīng)用由于缺乏有效的遞送系統(tǒng)而受到限制。所以，Wu[31]等人利用合成的CuO(氧化銅)納米顆粒開發(fā)了一種新的核酸適配體連接的雜交遞送系統(tǒng)，利用香鞘提取物制備CuO納米粒子，將CuO納米顆粒與MUC1(粘蛋白1)核酸適配體偶聯(lián)，體外將miRNA29b導入肺癌細胞。將miRNA-29b遞送到A549細胞。這種遞送系統(tǒng)可以有效地將miRNAs遞送到癌細胞，成為細胞內(nèi)傳遞miRNA的有效平臺，進一步改善肺癌的治療結(jié)果。此外，Perepelyuk[32]等人研究的是核酸適配體-雜化納米顆粒生物偶聯(lián)遞送系統(tǒng)，同樣是選擇性地將miRNA-29b遞送到表達MUC1(粘蛋白1)的癌細胞。因為MUC1是一種跨膜蛋白，在NSCLC(非小細胞肺癌)中異常過表達[33],在大約80%的肺腺癌中過表達。所以可以利用它在NSCLC中的過表達，通過將MUC1核酸適配體偶聯(lián)到混合納米顆粒表面，實現(xiàn)miRNA-29b對NSCLC的最佳靶向治療。Rab蛋白是調(diào)節(jié)細胞內(nèi)受體轉(zhuǎn)運的GTPase家族之一，MUC-1核酸適配體是NSCLC A549細胞強有力的結(jié)合配體，在Liu[34]等人的研究中，利用精確定制的DNA棱鏡將GTPase Rab26作為新的潛在治療靶點用于肺癌的靶向治療。通過設(shè)計合成了一種具有可調(diào)靶向和siRNA負載能力的DNA棱鏡平臺。通過交換兩個短的單鏈DNA，核酸適配體和siRNA的數(shù)目和位置都可以在每個納米棱鏡的1到6之間調(diào)節(jié)。因為MUC-1核酸適配體是NSCLC A549細胞的結(jié)合配體，其靶向效率與棱鏡結(jié)構(gòu)上的核酸適配體數(shù)目呈正相關(guān)。精確控制納米結(jié)構(gòu)上核酸適配體的能力對開發(fā)靶向遞送系統(tǒng)起著重要作用。所以在研究中，Rab26siRNA與MUC-1核酸適配體聯(lián)合應(yīng)用對非小細胞肺癌(NSCLC)具有良好的抗腫瘤作用[34]。肺癌干細胞(CSCs)被認為是肺癌的種子細胞，CD133是肺CSCs的標志物，在Huang[35]等人的研究中，通過DSPE-PEG2000制成的納米膠束作為藥物輸送系統(tǒng)，增加吉非替尼的溶解性和對肺CSCs的靶向性。該團隊[35]開發(fā)了載吉非替尼的聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺納米膠束和CD133核酸適配體(M-Gef-CD133)來消除CD133+的肺CSCs。通過研究，M-Gef-CD133能有效地將吉非替尼轉(zhuǎn)運至CD133+肺CSCs，并誘導對CD133+肺CSCs的選擇性殺傷作用[35]。APT是單鏈寡核苷酸的核酸適配體，是腫瘤細胞靶向的優(yōu)良核酸適配體，S15-APTs是一種有效的腫瘤細胞靶向配體，即單鏈寡核苷酸為基礎(chǔ)的S15核酸適配體(S15-APTs)，S15-APTs修飾納米顆粒(NPs)，可以實現(xiàn)選擇性的NSCLC靶向。APT修飾的量子點對靶細胞A549具有選擇性結(jié)合和內(nèi)化作用[36]。針對APT作為主動藥物靶向腫瘤細胞的應(yīng)用，Engelberg[36]等人研究了S15-APT內(nèi)化到人非小細胞肺癌A549細胞的機制，即人類NSCLC細胞選擇性內(nèi)化這些S15-APT量子點是通過經(jīng)典的依賴于籠蛋白的受體介導的內(nèi)吞作用實現(xiàn)的。這一發(fā)現(xiàn)可用于開發(fā)基于S15 APT修飾的NPs的主動靶向給藥和診斷系統(tǒng)，這些NPs可以通過受體介導的內(nèi)吞作用選擇性地進入NSCLC，從而繞過MDR(多重耐藥)外排轉(zhuǎn)運體，這些新的發(fā)現(xiàn)對于APT靶向藥物傳遞NPs具有重要的意義。生物相容性嵌段共聚物peg-pcl包埋疏水性化療藥物紫杉醇(Ptx)的NPs，該納米顆粒以人NSCLC細胞為靶點，它的基礎(chǔ)是聚乙二醇(PEG)與聚己內(nèi)酯(PCL)形成PEG-PCL膠束，并以APTS為靶向基團[37]。這些APT-NPs選擇性地將PTX靶向NSCLC A549細胞，對人A549非小細胞肺癌細胞有較高的選擇性，以及較強的殺滅作用。所以通過研究表明，這些修飾的納米粒在不損害正常組織的情況下，在選擇性靶向和根除人類非小細胞肺癌細胞方面具有巨大的臨床前景[37]。

核酸適配體在臨床醫(yī)學中的應(yīng)用

通過SELEX技術(shù)篩選得到的高親和力和特異性的核酸適配體，由于自身相對于抗體來說對環(huán)境溫度更加穩(wěn)定、無毒、非免疫原性，以及具有更強的腫瘤組織穿透能力，在從治療、藥物遞送、診斷、功能基因組學到生物傳感等多種應(yīng)用中的潛力越來越突出。

一、核酸適配體作為傳感元件

在Bashmakova[13]等人的研究中，主要以DNA核酸適配體作為發(fā)光傳感元件，以高靈敏度和特異性去區(qū)分肺癌患者和健康病例，它主要以重組Ca2+(鈣離子)調(diào)節(jié)的光蛋白(obelin)作為高靈敏的生物發(fā)光報告分子，來檢測肺部血液中的腫瘤元素。該研究也表明了核酸適配體作為發(fā)光傳感元件在肺癌檢測方面的應(yīng)用價值很大，以及在未來的研究中將會有更大的潛力。

二、核酸適配體作為載體

Abnous[38]等人通過在研究中發(fā)現(xiàn)兩種核酸適配體組成的十字形DNA納米結(jié)構(gòu)，這兩種核酸適配體是AS1411(26聚體DNA核酸適配體)和FOXM1(ssDNA核酸適配體與Forkhead Box蛋白M1結(jié)合)，這種十字納米結(jié)構(gòu)有助于將抗癌藥物阿霉素(Dox)靶向傳遞給癌細胞，同時減少對非靶細胞的損害和毒性作用。而且還表明FOXM1蛋白的過表達與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和細胞增殖有關(guān)[38].

三、核酸適配體作為靶向及放射性藥物

靶向癌癥治療可以提高治療選擇性和療效。在Russo[39]等人的研究中，將核酸適配體miR-34c和核酸適配體GL21.T相結(jié)合，二者的結(jié)合對非小細胞肺癌細胞增殖有一定的影響。核酸適配體(GL21.T)，結(jié)合并抑制AXL(跨膜受體酪氨酸激酶家族(RT Ks)的Axl亞家族)跨膜受體。而且，將miR-34c偶聯(lián)到GL21.T核酸適配體作為靶向部分，以選擇性傳遞給表達AXL的NSCLC細胞，可以影響NSCLC細胞增殖，并能夠通過靶向AXL受體克服了獲得性RTK(受體型酪氨酸激酶)抑制劑的耐藥性。因此，GL21.T/miR-34c嵌合體在轉(zhuǎn)錄水平上對AXL具有雙重抑制作用，是治療NSCLC的一種新的治療工具[39]。

在Hamamoto[8]等人研究得出了FGF2(成纖維細胞生長因子2)核酸適配體抑制FGF2-FGFR途徑驅(qū)動的肺癌細胞生長，即FGF2核酸適配體對FGF2依賴性肺癌細胞的治療是有效的，這些發(fā)現(xiàn)提供了臨床前的證據(jù)，證明核酸適配體對癌癥的治療是有作用的，并且在臨床的應(yīng)用潛力很大。

Zhao等人的團隊已經(jīng)為A549腺癌(非小細胞肺癌最常見的亞型)開發(fā)了S6核酸適配體探針[40]，核酸適配體探針對NSCLC腺癌和NSCLC大細胞癌細胞有選擇性結(jié)合，但與正常細胞的結(jié)合特性很小。這對于檢測癌細胞很重要。Zhang[41]等人的研究采用抗A549肺癌細胞的核酸適配體S6對漿膜腔積液中的癌細胞進行分化，而且研究證實細胞特異性核酸適配體可成功應(yīng)用于ICC(免疫細胞化學)快速診斷腺癌細胞，它具有更高的特異性和敏感度。

在Nuzzo[42]等人的研究中提供了由核酸適配體(GL21.T)和miR-137組成的核酸適配體-microRNA(MiR)復合物(AMIC)，該核酸適配體能夠結(jié)合和拮抗致癌受體Axl，減少細胞遷移和腫瘤生長的能力。通過研究表明，GL21.T-137復合物能有效抑制NSCLC小鼠移植瘤的體內(nèi)生長。并且GL21.T-137復合物在癌癥治療中具有廣泛的適用性，是治療非小細胞肺癌的潛在工具。

Zhou[43]等人通過SELEX細胞產(chǎn)生的核酸適配體作用于小細胞肺癌(SCLC)細胞，鑒定出了一種新的小細胞肺癌蛋白生物標記物，即高密度脂蛋白結(jié)合蛋白(HDLBP)。在該研究中的免疫組化的結(jié)果顯示小細胞肺癌組織中的HDLBP水平升高。用核酸適配體siRNA抑制HDLBP的表達，從而在體外抑制了SCLC細胞的增值和轉(zhuǎn)移，在體內(nèi)抑制了腫瘤的形成，并且抑制HDLBP的表達可以使腫瘤細胞阻滯在G0/G1期，抑制小細胞肺癌的進展[43]。

展 望

核酸適配體因為具有高度親和力、高特異性等特點，使其在臨床腫瘤的診斷和治療中的作用越來越突出。核酸適配體介導的靶向給藥系統(tǒng)也會隨著研究的進一步發(fā)展，在疾病的治療中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。核酸適配體現(xiàn)已成為生物醫(yī)學研究和藥物篩選等領(lǐng)域中的重要工具，在疾病臨床診斷與治療方面已經(jīng)有了一些實際的應(yīng)用并具有巨大的潛能，以及隨著 SELEX 的技術(shù)不斷完善和化學修飾方法的進步，將會有越來越多的針對腫瘤治療與診斷的核酸適配體從實驗室應(yīng)用于臨床。