鎮(zhèn)江地區(qū)2018年不同來源副溶血性弧菌毒力基因及耐藥性分析*

許金鳳，曹文婷，張瀟丹，巢秀琴，宋寅生，徐虹

(鎮(zhèn)江市疾病預(yù)防控制中心檢驗(yàn)科，江蘇鎮(zhèn)江 212000)

副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)是一種噬鹽菌，是我國大陸沿海地區(qū)食物中毒中最常見的一種病原菌，也是引發(fā)胃腸炎等食源性疾病的主要致病菌之一[1]。鎮(zhèn)江地處長江沿岸，由副溶血性弧菌引起的食物中毒事件多有發(fā)生[2]。副溶血性弧菌的主要致病因子是溶血素，分別由tlh、tdh和trh基因編碼不耐熱溶血素、耐熱直接溶血素和耐熱直接溶血素相關(guān)溶血素[3]。其中tdh和trh為毒力基因，具有溶血毒性、細(xì)胞毒性、心臟毒性和腸毒性[4]。為了解鎮(zhèn)江地區(qū)食品及疾病患者中副溶血性弧菌的檢測情況以及毒力基因和耐藥性差異，本研究就鎮(zhèn)江地區(qū)2018年食品水產(chǎn)品及食源性疾病病例檢出的副溶血性弧菌進(jìn)行比較，旨在為副溶血性弧菌的研究提供一定的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1樣本來源 2018年鎮(zhèn)江地區(qū)食品微生物及其致病因子監(jiān)測的水產(chǎn)品35份(采集時(shí)間為5月—10月；個體較大水產(chǎn)品以一個個體為單位單獨(dú)取樣，個體較小的魚類、蝦、蟹等，混合采取樣品，取樣部位為內(nèi)容物，應(yīng)包括腸、消化腺)，食源性疾病監(jiān)測的病例樣本608份；食品采樣環(huán)節(jié)包括流通環(huán)節(jié)(批發(fā)市場、農(nóng)貿(mào)市場、超市等)和餐飲服務(wù)環(huán)節(jié)(大中小型餐館、小吃店)；病例監(jiān)測包含潤州區(qū)、丹徒區(qū)、丹陽市、句容市4個地區(qū)的哨點(diǎn)醫(yī)院，監(jiān)測的致病菌包括沙門菌、志賀菌、副溶血性弧菌和致瀉性大腸埃希菌4種。

1.2主要試劑及儀器 弧菌顯色培養(yǎng)基(法國科瑪嘉公司)，TCBS培養(yǎng)基(北京陸橋生物技術(shù)公司)，腸桿菌和其他非苛養(yǎng)革蘭陰性桿菌鑒定試劑盒API 20E(法國生物梅里埃公司)，副溶血性弧菌tlh/tdh/trh三重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測試劑盒、細(xì)菌DNA提取試劑盒(北京卓誠惠生生物科技公司)；全自動藥敏加樣判讀系統(tǒng)及陰性藥敏板、生物安全柜(美國賽默飛公司)，ABI 7500熒光定量PCR儀(美國ABI公司)。

1.3菌株分離鑒定 樣品處理、副溶血性弧菌的檢測鑒定均參照《GB 4789.7-2013 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 副溶血性弧菌檢驗(yàn)》[5]進(jìn)行，所有菌株用API 20E生化鑒定試紙條進(jìn)行生化鑒定，并經(jīng)德國Bruker MTP384 MALDI-TOF MS飛行時(shí)間質(zhì)譜儀確認(rèn)為副溶血性弧菌。

1.4毒力基因檢測 采用金屬浴加熱法提取副溶血性弧菌DNA：挑取新鮮純培養(yǎng)菌落至1 mL滅菌ddH2O比濁管中，調(diào)至0.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝缓筠D(zhuǎn)移至EP管，13 000 r/min離心3 min，棄上清液。加入50 μL核酸提取液，100 ℃金屬浴加熱10 min，13 000 r/min離心10 min，取上清液為PCR模板，-20 ℃保存?zhèn)溆谩２捎酶比苎曰【鷗lh/tdh/trh三重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測試劑盒進(jìn)行不耐熱溶血素基因(tlh)、耐熱直接溶血毒素基因(tdh)和耐熱相關(guān)溶血毒素基因(trh)3種基因檢測。檢測方法詳見試劑盒說明書。

1.5藥敏試驗(yàn) 采用微量肉湯法，根據(jù)美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)2018版M100[6]和國家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評估中心《2018年國家食源性疾病監(jiān)測工作手冊》[7]食源性致病菌藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作程序，對副溶血性弧菌進(jìn)行11類15種抗菌藥物檢測：氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、頭孢唑啉、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢西丁、亞胺培南、慶大霉素、紅霉素、阿奇霉素、四環(huán)素、氯霉素、萘啶酸、環(huán)丙沙星、復(fù)方磺胺甲噁唑。藥敏試驗(yàn)操作和結(jié)果判讀嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。以對3類及以上抗菌藥物同時(shí)耐藥定義為多重耐藥[8]。以大腸埃希菌ATCC 25922作為藥敏質(zhì)控菌株。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行。對陽性率進(jìn)行χ2檢驗(yàn)(當(dāng)n<40，或T<1時(shí)，需用Fisher確切概率法)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1食品來源及疾病來源的副溶血性弧菌的檢出率 2018年鎮(zhèn)江地區(qū)進(jìn)行副溶血性弧菌檢測的相關(guān)食品35份，檢出副溶血性弧菌21份，檢出率為60.00%；食源性疾病病例608例，檢出副溶血性弧菌9例，檢出率為1.48%。食品來源和疾病來源檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=241.82，P<0.01)。食品采樣環(huán)節(jié)覆蓋流通環(huán)節(jié)和餐飲服務(wù)環(huán)節(jié)，檢出率分別為53.85%(14/26)和77.78%(7/9)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.60，P>0.05)。食源性疾病監(jiān)測的潤州區(qū)、丹徒區(qū)、丹陽市、句容市4個地區(qū)副溶血弧菌檢出率分別為0%(0/152)、1.92%(3/156)、2.67%(4/150)和1.33%(2/150)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.96，P>0.05)；食源性疾病4種致病菌中副溶血性弧菌占比為36.00%(9/25)，低于沙門菌(52.00%)，高于志賀菌(12.00%)和致瀉性大腸埃希菌(0)。

2.2不同來源副溶血性弧菌毒力基因陽性率 來自食品的菌株(簡稱食品株)和來自疾病患者的菌株(簡稱疾病株)tlh基因均陽性；食品株tdh基因陽性率為0，疾病株為88.89%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=25.45，P<0.01)；食品株trh基因陽性率為0，疾病株陽性率為11.11%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.41，P>0.05)。

2.3不同來源副溶血性弧菌耐藥情況 30株副溶血性弧菌，無任何一菌株對15種抗菌藥物全部敏感；食品株與疾病株對頭孢唑啉均耐藥(100.00%，30/30)；疾病菌株對氨芐西林和紅霉素的耐藥率(88.89%)高于食品株(66.67%)，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.59，P>0.05)；另在食品中檢出耐萘啶酸菌株2株(9.52%)，耐頭孢他啶菌株1株(4.76%)。見表1。耐3類及以上的多重耐藥菌為18株，多重耐藥率為60.00%(18/30)，疾病株的多重耐藥率(77.78%，7/9)高于食品株(52.38%，11/21)。食品株與疾病株均以氨芐西林+頭孢唑啉+紅霉素多重耐藥譜占比最高，其次分別為頭孢唑啉+紅霉素和氨芐西林+頭孢唑啉，單一耐藥以頭孢唑啉為主。

表1鎮(zhèn)江地區(qū)2018年不同來源副溶血性弧菌耐藥結(jié)果[n(%)]

抗菌藥物食品株耐藥疾病株耐藥合計(jì)氨芐西林14(66.67)8(88.89)22(73.33)氨芐西林/舒巴坦0(0)0(0)0(0)頭孢唑啉21(100.00)9(100.00)30(100.00)頭孢他啶1(4.76)0(0)1(3.33)頭孢噻肟0(0)0(0)0(0)頭孢西丁0(0)0(0)0(0)亞胺培南0(0)0(0)0(0)慶大霉素0(0)0(0)0(0)紅霉素14(66.67)8(88.89)22(73.33)阿奇霉素0(0)0(0)0(0)四環(huán)素0(0)0(0)0(0)氯霉素0(0)0(0)0(0)萘啶酸2(9.52)0(0)2(6.67)環(huán)丙沙星0(0)0(0)0(0)復(fù)方磺胺甲噁唑0(0)0(0)0(0)

3 討論

鎮(zhèn)江地區(qū)2018年水產(chǎn)品中副溶血性弧菌檢出率為60.00%，高于江蘇省其他城市[1]及省平均水平[8]，由食品污染引起感染的概率大大增加；本地區(qū)食源性疾病中副溶血性弧菌檢出率為1.48%，占所檢致病菌總數(shù)的36.00%，可見副溶血性弧菌是本地區(qū)食源性疾病的主要致病菌之一。鎮(zhèn)江地處長江沿岸，東接沿海城市及東海和黃海，其污染率之高及食源性疾病時(shí)有發(fā)生的情況提示可能與其地理位置及交通便利密切相關(guān)，下一步應(yīng)加強(qiáng)水源等的監(jiān)測。

分子流行病學(xué)研究表明攜帶tdh、trh毒力基因的產(chǎn)毒株與人類食源性疾病的暴發(fā)密切相關(guān)[9]。tlh溶血素基因本身不具溶血活性，是副溶血性弧菌的一種特異性基因[8-9]。本研究30株副溶血性弧菌tlh基因均陽性，與文獻(xiàn)報(bào)道相符。食品株均未檢出tdh和trh毒力基因，一方面由于樣本量少，另一方面可能與食品株經(jīng)過人體的進(jìn)一步轉(zhuǎn)化產(chǎn)生毒力，進(jìn)而變成產(chǎn)毒株有關(guān)。疾病株攜帶tdh和trh基因情況有差異，其中tdh基因的陽性率顯著高于trh基因，也更加驗(yàn)證了tdh基因可作為Vp致病性的可靠分子標(biāo)志物。

本次監(jiān)測顯示副溶血性弧菌對15種抗菌藥物有不同程度耐藥，食品株和疾病株對頭孢唑啉均100.00%耐藥，遠(yuǎn)高于本地區(qū)2015年副溶血性弧菌的耐藥監(jiān)測結(jié)果[10]和江蘇省2015—2017年副溶血性弧菌的耐藥率[8]。疾病株對氨芐西林和紅霉素的耐藥率及多重耐藥率均高于食品株，與蔡彥秋等[1]的研究結(jié)果一致。綜上，說明不同來源的副溶血性弧菌對常用抗菌藥物的耐藥程度均呈上升趨勢，多重耐藥率及耐藥譜不盡相同[11-12]，多重耐藥譜以氨芐西林+頭孢唑啉+紅霉素為主。

本研究發(fā)現(xiàn)不同來源的副溶血性弧菌的病原分離、產(chǎn)毒性及耐藥性存在差異，為副溶血性弧菌導(dǎo)致的食源性疾病的防控提供指導(dǎo)。在下一步的研究中，應(yīng)加大水產(chǎn)品的檢測，擴(kuò)大藥敏監(jiān)測種類，聯(lián)合應(yīng)用副溶血性弧菌的脈沖場凝膠電泳及多位點(diǎn)序列分型等技術(shù)，從分子特征方面研究食品株與疾病株、產(chǎn)毒株與非產(chǎn)毒株的差異，也為防止副溶血性弧菌引起的突發(fā)事件做好保障。