環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)檢測呼吸道樣本中肺炎克雷伯菌*

司玉瑩，趙望，葉蓓，成宇，張雯雁，葉楊芹，王玉超，王嵐，范列英

(1. 同濟大學附屬東方醫(yī)院檢驗科，上海 200120；2. 復(fù)旦大學環(huán)境科學與工程系，上海 200438)

呼吸道感染是一種常見并嚴重威脅人們身體健康的感染性疾病，肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae，Kpn)感染在呼吸道感染中居于前列[1]。目前Kpn臨床檢測常規(guī)方法是細菌培養(yǎng)法，需3 d左右，不利于早期診斷和治療；菌種鑒定金標準是DNA測序法，設(shè)備昂貴、實驗條件嚴格，不適于基層實驗室推廣應(yīng)用。因此，臨床上需要一種快速可靠的鑒定方法。環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)具有特異性強，靈敏度高，擴增快速高效，操作容易等優(yōu)點[2]，目前國內(nèi)已有學者建立了應(yīng)用于食品中Kpn檢測的LAMP體系[3]。本研究擬建立一種用于檢測呼吸道感染Kpn的LAMP方法，同時與細菌培養(yǎng)法、DNA測序法結(jié)果進行比較，評估該體系并初步臨床應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1臨床樣本及菌株 收集2018年5—11月同濟大學附屬東方醫(yī)院就診的疑似呼吸道感染患者痰液樣本308例，其中男性248例，女性60例，年齡范圍19～95歲，年齡(66.39±12.81)歲?；颊呷朐呵鍧嵖谇缓蟛捎米匀豢忍捣ㄓ昧瘸錾畈刻祷蚪?jīng)吸痰管、纖維支氣管鏡氣道內(nèi)吸取法采集痰液樣本，根據(jù)第4版《全國臨床檢驗操作規(guī)程》[4]初步判斷痰液樣本是否合格。肺炎克雷伯菌ATCC 13883、銅綠假單胞菌ATCC 27853、鮑曼不動桿菌ATCC 19606、大腸埃希菌ATCC 35218、金黃色葡萄球菌ATCC 25923、肺炎鏈球菌ATCC 49619、流感嗜血桿菌ATCC 9007、卡他莫拉菌ATCC 25238、產(chǎn)酸克雷伯菌ATCC 700324均購自上海北諾生物科技有限公司，用于LAMP法的特異性、靈敏度試驗。

1.2主要試劑與儀器 10×ThermoPol Reaction Buffer、Bst2.0 DNA聚合酶(New England Biolab公司)，LAMP引物、SYBR GreenⅠ、甜菜堿(Invirtrogen公司)，dNTP(天根生化科技公司)，MgSO4(Sigma公司)，核酸提取試劑盒(上海信長醫(yī)療器械公司)，血平板、巧克力平板、麥康凱平板(賽默飛公司)；核酸提取儀(上海復(fù)星醫(yī)藥集團)，7300型實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)，Vitek 2 Compact全自動細菌分析儀(法國生物梅里埃公司)，Nanodrop 2000 超微量分光光度計(賽默飛公司)，DNA測序由上海生工生物工程公司完成。

1.3臨床痰液樣本細菌培養(yǎng) 收集痰液樣本并于2 h內(nèi)分別接種于血平板、巧克力、麥康凱平板上，37 ℃、5% CO2孵育24～48 h觀察結(jié)果，分離潛在病原菌，應(yīng)用Vitek 2 Compact全自動細菌分析儀進行細菌鑒定。

1.4核酸提取 痰液樣本中加入等體積40 g/L NaOH液化[5]，室溫放置30 min后輕柔混勻，避免出現(xiàn)大量泡沫，取液化樣本300 μL；將標準菌株配制成108CFU/mL菌懸液[6]，取菌懸液300 μL。用核酸提取試劑盒在核酸提取儀上進行核酸提取，按照說明書進行。制備核酸用于LAMP 反應(yīng)，余下-40 ℃保存。

1.5LAMP反應(yīng)的建立

1.5.1LAMP引物 通過GenBank序列搜集和BLAST比對分析，選擇KpnphoE基因[7]為靶基因，運用在線引物設(shè)計軟件Primer Explorer V5(http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html)，針對6個區(qū)域設(shè)計4條特異引物：2條外引物(F3和B3)和2條內(nèi)引物(FIP和BIP，F(xiàn)IP由F1的一個互補序列和正向序列F2構(gòu)成，BIP由B1的一個互補序列和正向序列B2構(gòu)成)。LAMP引物信息見圖1。引物序列如下，F(xiàn)3：5′-CCGACATTGTCACTGAGT-3′；B3：5′-CCTGAATACCGGAGGTGAT-3′； FIP：5′-GCTTTGATGTTCATTTGCGTTGAGACAAATATGCTGCAAATGTG-3′；BIP：5′-GCTTTGATGTTCATTTGCGTTGAGACAAATATGCTGCAAATGTGG-3′。

圖1 LAMP引物信息

1.5.2LAMP反應(yīng)條件優(yōu)化 以Kpn標準株核酸為模板，進行LAMP擴增。反應(yīng)體系為25 μL：10×ThermoPol Reaction Buffer 2.5 μL、ddH2O(加入Mg2+和甜菜堿)18.5 μL、引物1 μL(包括F3 0.2 μmol/L、B3 0.2 μmol/L、FIP 1.6 μmol/L、BIP 1.6 μmol/L)、BstDNA聚合酶1 μL、SYBR GreenⅠ1 μL、模板1 μL。反應(yīng)溫度63 ℃[8]、時間45 min，優(yōu)化Mg2+和甜菜堿的濃度。分別在有、無Kpn模板的體系中加入4、6、8、10、12 mmol/L不同濃度的Mg2+，0、0.4、0.8、1.2、1.6 mmol/L不同濃度的甜菜堿，觀察實驗結(jié)果以選擇最佳擴增濃度。

1.5.3LAMP法特異性、靈敏度試驗 采用優(yōu)化后體系分別以肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌、產(chǎn)酸克雷伯菌標準株核酸為模板，進行LAMP特異性驗證；將原始濃度為108CFU/mL Kpn標準株菌懸液濃度梯度稀釋[9]至107、106、105、104、103、102、101CFU/mL，取各濃度菌懸液300 μL進行核酸提取，制備的核酸用于LAMP靈敏度試驗。

1.6LAMP法檢測臨床痰液樣本 LAMP法檢測308例臨床痰液樣本，樣本提取核酸作為模板，ddH2O為陰性對照，Kpn標準株核酸為陽性對照，在7300型實時熒光定量PCR儀上采用已建立LAMP體系進行檢測。Ct值≤30定義為陽性。

1.7DNA測序 將制備的臨床痰液樣本核酸用Nanodrop 2000超微量分光光度計進行質(zhì)檢，均符合測序要求(DNA純度1.8～2.0，濃度30 ng/μL以上)，取20 μL樣品量送至上海生工生物工程公司進行DNA測序。根據(jù)KpnphoE基因利用NCBI網(wǎng)站設(shè)計常規(guī)PCR引物，上游引物序列：5′-TGCCCAGACCGATAACTTTA-3′，下游引物序列：5′-CTGTTTCTTCGCTTCACGG-3′。引物與單鏈 DNA 模板分子結(jié)合后，DNA 聚合酶用 dNTP 延伸引物，混入限量的缺乏延伸所需要的3′-OH基團的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)，使延長的寡聚核苷酸隨機在某一個特定的堿基處終止，并在每個堿基后面進行熒光標記，產(chǎn)生以A、T、C、G 結(jié)束的4組不同長度的一系列核苷酸，然后在PAGE膠上電泳進行檢測，從而獲得DNA 堿基序列。

1.8統(tǒng)計學分析 用SPSS 20.0軟件進行。陽性率比較采用χ2檢驗，方法學一致性檢驗采用Kappa檢驗(Kappa系數(shù)<0.4提示一致性差，>0.8說明一致性極好)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 實驗與結(jié)果

2.1LAMP反應(yīng)條件優(yōu)化 Mg2+濃度為8 mmol/L、甜菜堿濃度為0.4 mmol/L時，核酸擴增出峰較早且無假陽性結(jié)果，確定為最佳擴增所需濃度。見圖2。

注：A，Mg2+濃度優(yōu)化；B，甜菜堿濃度優(yōu)化。(+)，有Kpn模板體系；(-)，無Kpn模板體系。

圖2Mg2+和甜菜堿濃度優(yōu)化試驗擴增曲線

2.2LAMP法特異性、靈敏度試驗 以肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌、產(chǎn)酸克雷伯菌標準株核酸進行LAMP檢測，結(jié)果僅Kpn核酸為模板時獲得陽性擴增曲線，而其余菌種均未獲得擴增曲線。Kpn核酸模板濃度低至104CFU/mL時可獲得陽性擴增，而其他更低濃度均未獲得擴增，最終確認靈敏度達到104CFU/mL。見圖3。

注：A，特異性試驗(細菌標準株核酸分別為肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌、產(chǎn)酸克雷伯菌)；B，靈敏度試驗(模板分別為108、107、106、105、104、103、102、101CFU/mL Kpn菌懸液提取核酸)。

圖3LAMP法特異性、靈敏度試驗擴增曲線

2.3細菌培養(yǎng)法結(jié)果 308例痰液樣本培養(yǎng)鑒定檢出Kpn陽性樣本130例、Kpn陰性樣本178例(包括無細菌生長樣本60例、非Kpn其他細菌陽性樣本118例)，檢出率為42.20%(130/308)。

2.4LAMP法檢測臨床痰液樣本結(jié)果 308例痰液樣本LAMP法檢測陽性166例，陰性142例，檢出率為53.89%(166/308)。LAMP 法檢出率(53.89%)高于培養(yǎng)法(42.20%)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=161.65，P<0.05)。Kpn陽性樣本中LAMP法與細菌培養(yǎng)法一致率為96.15%，無細菌生長樣本的一致率為100%，而非Kpn其他細菌陽性樣本的一致率為65.25%。見表1。

表1 LAMP法與細菌培養(yǎng)法的比較

2.5DNA測序驗證 各樣本測序結(jié)果峰圖均顯示波峰與波谷清晰，峰與峰之間的距離均勻，底部無雜峰干擾，將測序結(jié)果進行BLAST比對，證明確實為Kpn。見圖4。對表1中46例LAMP法與細菌培養(yǎng)法結(jié)果不一致樣本進行DNA測序鑒定， LAMP法與測序結(jié)果一致40例，假陰性2例、假陽性4例，符合率為86.95%(40/46)。其中LAMP法陰性的5例樣本測序結(jié)果為2例陽性、3例陰性，LAMP法陽性的41例樣本測序結(jié)果為37例陽性、4例陰性。除上述46例不一致樣本外，另隨機選擇85例結(jié)果一致的樣本，共計131例進行DNA測序后，與本研究建立的LAMP法結(jié)果進行比較，結(jié)果顯示LAMP法與測序有極好的一致性(Kappa系數(shù)=0.817)。見表2。

注：Kpn陽性樣本正向測序結(jié)果(上圖)和反向測序結(jié)果(下圖)。

表2 LAMP法與DNA測序法檢測Kpn的比較

3 討論

本研究針對KpnphoE基因自行設(shè)計LAMP引物，對Mg2+、甜菜堿濃度進行了優(yōu)化，并利用細菌標準株證明自行設(shè)計引物具有較高的特異性和靈敏度。以測序結(jié)果為金標準，進行ROC曲線分析，LAMP診斷Kpn的cut off值為30(Ct值)，該水平的靈敏性為75.00%，特異性為87.50%。

本研究對308例疑似呼吸道感染患者痰液樣本進行LAMP檢測，與細菌培養(yǎng)法、DNA測序結(jié)果進行比較，評估Kpn的LAMP檢測體系。結(jié)果顯示Kpn陽性和無細菌生長樣本中LAMP法與細菌培養(yǎng)法一致率較高，而非Kpn其他細菌陽性樣本中，一致率較低(65.25%,77/118)，不一致的41例(LAMP檢測Kpn陽性而細菌培養(yǎng)法陰性)測序結(jié)果為37例陽性、4例陰性，可見相比細菌培養(yǎng)法，LAMP技術(shù)在篩查Kpn病原體中具有更高的靈敏度，與國內(nèi)外文獻報道結(jié)果一致[10-11]。產(chǎn)生此差別的可能原因：LAMP技術(shù)是針對病原體靶基因的快速檢測手段，可以有效避免傳統(tǒng)培養(yǎng)法在檢測多重感染樣本時因某些細菌優(yōu)勢生長而導(dǎo)致的漏檢；因痰液樣本的復(fù)雜性，LAMP技術(shù)可檢出少量或死亡菌體的基因，造成假陽性，多項研究也表明培養(yǎng)結(jié)果和基因篩檢方法之間存在差異[12]。本研究建立的LAMP法與測序結(jié)果進行比較，顯示兩者具有極好的一致性(Kappa系數(shù)=0.817)，與文獻報道描述一致[11]。

LAMP技術(shù)具有準確性高、靈敏度高、特異性強、反應(yīng)省時等優(yōu)勢，已被成功開發(fā)并應(yīng)用于病原微生物檢測[13]。目前國內(nèi)已有LAMP恒溫擴增儀生產(chǎn)，只需要恒溫裝置和熒光檢測系統(tǒng)，比常規(guī)實時熒光定量PCR儀更加體積小巧，便于操作，價格低廉。但LAMP法也有一定不足，例如無法提供藥敏信息，只能做定性分析，在復(fù)雜性痰液樣本中基因篩檢與真實致病情況存在差異等，應(yīng)該結(jié)合細菌培養(yǎng)結(jié)果和臨床實際情況判斷。