右美托咪定上調(diào)PI3K/AKT通路促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的作用機(jī)制

于 芝，汪 婷，徐卉芳

隨著我國工業(yè)及交通事業(yè)的迅猛發(fā)展以及人口老齡化的發(fā)展，骨折已成為目前臨床中最常見的疾病，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)在骨折愈合中起著關(guān)鍵作用。右美托咪定具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、穩(wěn)定血流動(dòng)力學(xué)、無呼吸抑制作用等優(yōu)點(diǎn)，目前被廣泛應(yīng)用于麻醉、ICU等領(lǐng)域[1]。相關(guān)研究表明，右美托咪定可以通過上調(diào)PI3K/AKT通路產(chǎn)生促增殖、抑制細(xì)胞凋亡、抗炎等作用[2-4]，但右美托咪定是否通過PI3K/AKT通路影響B(tài)MSCs增殖目前尚無文獻(xiàn)資料報(bào)道。

1 資料與方法

1.1 一般資料：人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞購自中國科學(xué)院昆明細(xì)胞庫，干細(xì)胞培養(yǎng)基購自Thermo Scientific公司，PI3K/AKT通路抑制劑LY294002購自MCE公司，右美托咪定購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)：人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，干細(xì)胞培養(yǎng)基參照試劑使用說明配置使用，當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)到80%左右進(jìn)行傳代。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組：處于對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞依照細(xì)胞處理方式，分為：①對(duì)照組，細(xì)胞正常培養(yǎng)；②Dex組，細(xì)胞培養(yǎng)液中加入1 nM/L[5]右美托咪定;③抑制劑組，細(xì)胞加入10 mmol/L[6]抑制劑LY294002 15 min后加入1nM/L右美托咪定。

1.4 細(xì)胞周期檢測：參照凱基(KGA512)細(xì)胞周期檢測試劑盒說明書，收集細(xì)胞，染色，流式細(xì)胞儀檢測，用ModFit LT軟件分析數(shù)據(jù)。

1.5 Western Blotting：細(xì)胞在裂解液中裂解，離心收集上清液，定量上清液中的總蛋白濃度，加熱,變性；4%～12% Bis-Tris凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h；加入一抗(4 ℃孵育過夜)，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，ECL發(fā)光檢測，采用ImageJ軟件進(jìn)行相對(duì)定量分析。

2 結(jié)果

2.1MTT細(xì)胞增殖檢測：細(xì)胞增殖檢測Dex組24、48 h細(xì)胞OD值明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；抑制劑組24、48 h 細(xì)胞OD值明顯低于Dex組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖1(目錄后)。

2.2 細(xì)胞周期檢測：細(xì)胞周期檢測Dex組細(xì)胞G1期(47.43±0.32)、S期(28.21±0.42)細(xì)胞比例，低于對(duì)照組的G1期(52.41±0.32)、S期(32.83±0.75)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=為23.26、9.32，P<0.05)；G2期細(xì)胞(24.36±0.26)分布比例高于對(duì)照組(14.75±0.44)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=32.46，P<0.05)；抑制劑組細(xì)胞G1期(67.91±0.57)細(xì)胞比例高于Dex組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=59.46，P<0.05)；G2期(3.36±0.14)細(xì)胞分布比例低于Dex組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=125.79，P<0.05)。

2.3 細(xì)胞增殖蛋白檢測：Western Blotting檢測細(xì)胞增殖蛋白表達(dá)，DEX組CCNB1、CDC2蛋白表達(dá)較對(duì)照組上調(diào)，抑制劑組CCNB1、CDC2蛋白表達(dá)較Dex組下調(diào)，見圖2(目錄后)。

2.4 PI3K/AKT通路蛋白表達(dá)情況：Western Blotting檢測PI3K/AKT通路蛋白表達(dá)，DEX組PI3K、AKT、p-AKT蛋白表達(dá)較對(duì)照組上調(diào)，抑制劑組PI3K、AKT、p-AKT蛋白表達(dá)較Dex組下調(diào)，見圖3(目錄后)。

3 討論

骨形成包括兩個(gè)重要的過程，即膜內(nèi)成骨導(dǎo)致扁平骨和軟骨內(nèi)成骨形成長骨。BMSCs具有多能性，可分化為多種細(xì)胞類型，包括軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞[7]，分別用于軟骨內(nèi)成骨和膜內(nèi)成骨[8]。BMSCs對(duì)骨再生也至關(guān)重要，骨愈合的關(guān)鍵一步是BMSCs定位到損傷部位[9]。BMSCs在骨折愈合的各個(gè)階段發(fā)揮其再生功能，骨折早期BMSCs能有效抑制白細(xì)胞介素1 (IL-1)、IL-6、IL-10、腫瘤壞死因子(TNF)等炎性因子分泌，加速纖維性愈傷組織的形成；在骨折后期MSCs到達(dá)骨折內(nèi)膜，通過促進(jìn)BMP2的表達(dá)加速骨痂的形成和愈傷組織的重塑[10]。

右美托咪定目前被應(yīng)用為一線鎮(zhèn)靜劑及包括骨科手術(shù)在內(nèi)的各類麻醉輔助用藥[11-12]。本結(jié)果顯示，研究Dex組細(xì)胞G2期細(xì)胞比例明顯增加，CCNB1、CDC2蛋白表達(dá)較對(duì)照組上調(diào)，抑制劑組細(xì)胞增殖明顯受到抑制，同時(shí)CCNB1、CDC2蛋白表達(dá)下調(diào)。文獻(xiàn)資料顯示細(xì)胞周期G2/M檢查點(diǎn)調(diào)控細(xì)胞增殖方面具有重要作用，可防止DNA損傷的細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂，CDC2-CCNB復(fù)合物為調(diào)節(jié)G2/M檢查點(diǎn)的關(guān)鍵因素，上調(diào)CCNB1、CDC2可促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入G2期，加快細(xì)胞有絲分裂進(jìn)程[13]。表明右美托咪定通過上調(diào)CCNB1、CDC2蛋白表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入G2期，進(jìn)而促進(jìn)BMSCs細(xì)胞增殖。

有研究表明，PI3K/AKT通路在維持BMSCs增殖及功能方面具有重要作用[14-15]。本研究結(jié)果顯示，Dex組PI3K、AKT、p-AKT蛋白表達(dá)較對(duì)照組上調(diào)，而加入PI3K/AKT通路抑制劑后PI3K、AKT、p-AKT蛋白表達(dá)較Dex組顯著下調(diào)，同時(shí)細(xì)胞增殖受到抑制，表明右美托咪定通過上調(diào)BMSCs細(xì)胞PI3K/AKT信號(hào)通路促進(jìn)BMSCs細(xì)胞增殖。