真菌漆酶及其介體系統(tǒng)：來源、機理與應(yīng)用

徐鑫, 張國慶,2*, 胡渤洋, 劉子璐, 孫悅

1.北京農(nóng)學(xué)院生物與資源環(huán)境學(xué)院, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點實驗室, 北京 102206;

2.北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 北京林木分子設(shè)計育種高精尖創(chuàng)新中心, 農(nóng)業(yè)應(yīng)用新技術(shù)北京市重點實驗室, 北京 102206

漆酶(laccase, Lac,p-diphenol: dioxygen oxidoreductases, EC 1.10.3.2)是一類含銅的多酚氧化酶，其研究歷史最早可以追溯到19世紀末。漆酶廣泛分布于植物、真菌、細菌、昆蟲等中，其中尤以真菌漆酶在環(huán)境污染物降解中的重要作用成為近年來的研究熱點[1]。漆酶的作用底物廣泛，能夠催化木質(zhì)素、酚類、胺類等芳香族、非芳香族化合物的氧化分解，最終將分子氧還原成水，不產(chǎn)生其他副產(chǎn)物，因而也被稱為“綠色催化劑”，被廣泛應(yīng)用于環(huán)保、造紙、紡織、食品加工、藥品改良等領(lǐng)域[2]。另外，漆酶結(jié)合小分子化合物構(gòu)成漆酶/介體系統(tǒng)(laccase mediator system，LMS)，對多種酚類、胺類、蒽醌類、雜環(huán)類以及有機磷化合物表現(xiàn)出更高效的降解能力[3]。本文就近年來真菌漆酶及其介體系統(tǒng)研究進行了綜述，以期為后續(xù)漆酶相關(guān)研究提供參考。

1 漆酶的來源與功能

漆酶早在1883年就被日本科學(xué)家Yoshida[4]從日本漆樹(Rhusvernicifera)的汁液中分離出來，并對其進行命名。1896年Bertrand[5]證實漆酶是一種含金屬蛋白，這一發(fā)現(xiàn)為后續(xù)漆酶結(jié)構(gòu)以及功能研究奠定了基礎(chǔ)。后經(jīng)大量研究發(fā)現(xiàn)，漆酶還存在于昆蟲、細菌和真菌中，可以說漆酶是一類廣泛存在的活性蛋白[6, 7]。依據(jù)來源不同，漆酶可主要分為兩個大的類群，即植物漆酶和微生物漆酶，另外還有少量動物漆酶[8]。植物漆酶研究歷史最為悠久，如野漆樹(Rhussuccedanea)[4]、茶樹(Camelliasinensis)[9]、白樺(Betulaplatyphylla)[10]等。而真菌漆酶分布最廣、報道最多，廣泛分布于白腐真菌、軟腐真菌、腐生真菌、菌根真菌、病原真菌等，尤以白腐真菌的研究和應(yīng)用最廣泛[1,11]，如云芝(Trametesversicolor)[12]和一色齒毛菌(Cerrenaunicolor)[13]等。

不同物種來源的漆酶功能不同。茶樹(Camelliasinensis)[9]和龍眼(Dimocarpuslongan)[14]等植物的漆酶分布于細胞壁中，主要功能是參與木質(zhì)素的合成反應(yīng)、病蟲害防治以及多種抗逆反應(yīng)[8-9,15]。在云芝(T.versicolor)、糙皮側(cè)耳(P.ostreatus)和粗毛栓菌(Trametestrogii)等真菌中，漆酶所發(fā)揮的作用更加多樣，參與多種生理生化反應(yīng)，如真菌形態(tài)的產(chǎn)生、真菌病原體與宿主的相互作用、木質(zhì)素的降解與利用以及脅迫反應(yīng)和防御機制等[8]。細菌漆酶多來自芽孢桿菌屬細菌，其存在與細菌本身的形態(tài)有關(guān)，并參與棕色孢子的形成以及孢子保護系統(tǒng)的構(gòu)建[15]。另外，在棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera)[16]和亞洲玉米螟(Ostriniafurnacalis)[17]等昆蟲中，漆酶的主要功能是參與昆蟲的生長發(fā)育與變態(tài)，并在角質(zhì)層的形成及硬化和免疫防御過程中起重要作用。

漆酶有眾多的同工酶，共同發(fā)揮作用，以實現(xiàn)對木質(zhì)素等高分子底物的高效降解[18]。如已報道的一色齒毛菌(C.unicolor)漆酶同工酶有14種[13]。到目前為止，已有100多種漆酶從真菌中成功分離純化，并完成了性質(zhì)研究，其中多數(shù)已經(jīng)進行工業(yè)化生產(chǎn)并投入使用，植物漆酶和動物漆酶還未見工業(yè)化生產(chǎn)，這是由于植物和動物的粗提液成分十分復(fù)雜，從中分離純化出單純漆酶難度較大[1, 6, 18]。因此，目前具有實際應(yīng)用價值的漆酶主要是真菌漆酶。

2 真菌漆酶的結(jié)構(gòu)

真菌漆酶一般為胞外分泌且高度糖基化的單亞基蛋白，由500～550個氨基酸組成，分子量約60～90 kDa、等電點在pH 4.0左右，伴有不同程度的糖基化，糖基含量約為10%～25%，主要有葡萄糖、甘露糖、半乳糖、氨基己糖等[16]。漆酶很少以單體形式參與反應(yīng)，多數(shù)情況下在反應(yīng)前多種同工酶通過寡聚化形成多聚復(fù)合體而進行催化反應(yīng)，復(fù)雜的肽鏈保證了復(fù)合酶的穩(wěn)定性，而高度的糖基化決定了復(fù)合酶的特異性[19]。

漆酶與抗壞血酸氧化酶、銅藍蛋白、鐵氧化酶和膽紅素氧化酶同屬于多銅氧化酶家族(multicopper oxidase family)。典型漆酶含有的4個銅離子，分別構(gòu)成了T1-Cu、T2-Cu和T3-Cu三型銅離子(銅離子活性中心)，其中T1型銅離子(T1-Cu)為順磁性“藍色”銅，在610 nm有特征吸收峰；T2型(T2-Cu)為非“藍色”順磁性銅，無特征吸收峰；T3型(T3-Cu)為2個銅離子構(gòu)成的抗磁自旋耦合銅-銅對，在330 nm處有特征吸收峰。含有藍色銅離子的漆酶被稱作藍漆酶，后發(fā)現(xiàn)有些漆酶與傳統(tǒng)藍漆酶不同，缺失藍色銅，因此也將其稱作黃漆酶或白漆酶[20-23]。漆酶的高級結(jié)構(gòu)是在肽鏈的基礎(chǔ)上圍繞Cu中心纏繞而成，多呈現(xiàn)球狀或杯狀，這既加快了底物與漆酶的結(jié)合，也對活性中心內(nèi)的金屬離子起到了保護作用。至今已有多種真菌漆酶的高級結(jié)構(gòu)被解析[24]。2007年Matera等[25]從粗毛栓菌(Trametestrogii)中分離得到一種漆酶(PDB ID: 2HRH，圖1A)，是傳統(tǒng)的藍漆酶。隨后在2015年Glazunova等[26]從硬毛革孔菌(Coriolopsiscaperata)中得到了一種T2-Cu缺失型漆酶(PDB ID: 4JHV，圖1B)。伴隨基因克隆技術(shù)的發(fā)展，真菌漆酶基因及其4個銅離子對應(yīng)的Cu保守區(qū)氨基酸序列被逐步解析，毛栓菌(T.hirsuta)、云芝(Trametesversicolor)等多種栓菌屬漆酶含4個Cu保守區(qū)(Cu I、Cu II、Cu III和Cu IV),其序列分別為HWHGFFQ、YHSHLSTQY、PHPFHLHGH和HCHIDFH。

A:藍漆酶；B:T2-Cu缺失型漆酶。

3 真菌漆酶的反應(yīng)機理

真菌漆酶的催化機理是利用自身與底物的氧化還原電勢差將底物氧化。漆酶分子中的T1-Cu從底物中奪取電子，由Cu2+轉(zhuǎn)變?yōu)镃u+，電子再經(jīng)由保守的His-Cys-His三肽結(jié)構(gòu)，傳遞給T2-Cu、T3-Cu三核銅離子中心，最終分子氧在該中心轉(zhuǎn)化為水[27-29]。以云芝(T.versicolor)漆酶為例，其活性中心結(jié)構(gòu)由1個T2-Cu、2個T3-Cu構(gòu)成的三核銅離子中心(trinuclear cluster, TNC)和T1-Cu構(gòu)成的單核中心組成，主要負責底物的氧化以及氧化過程產(chǎn)生的電子向TNC方向傳遞(圖2A)[30-31]。4個銅離子共與10個His殘基相連，其中三核銅離子中心共與8個His殘基相連，T3-Cu與6個His相連，T2-Cu與2個His殘基相連，剩余2個His殘基則與T1-Cu相連，T1-Cu構(gòu)成的單核中心通?？拷崦副砻妫蛊涓着c底物結(jié)合，將底物從還原態(tài)氧化為氧化態(tài)，同時向內(nèi)嵌在漆酶結(jié)構(gòu)凹陷處的TNC釋放4個電子，在TNC內(nèi)部，4個電子被傳遞給氧分子，形成2分子H2O(圖2B)[27-28]。由于T1-Cu承擔從底物中奪取電子的功能，其氧化還原電勢高低直接影響著漆酶氧化能力的強弱[28,32]。

4 漆酶/介體系統(tǒng)(LMS)

4.1 定義及作用特點

漆酶對于底物的氧化是一種選擇性反應(yīng)，只有能進入漆酶活性中心并且與漆酶存在一定氧化還原電勢差的底物才能被氧化[31-33]。單一漆酶介導(dǎo)的底物氧化流程見圖3A。漆酶的氧化還原電位為0.5～0.8 V[相對于標準氫電極(normal hydrogen electrode, NHE)]，低于木素過氧化物酶(>1 V, 相對于NHE)，而漆酶的典型底物酚類化合物氧化還原電位為0.5～1.0 V(相對于NHE)，足以讓漆酶的T1-Cu中心獲得電子，因而最初認為只能氧化木質(zhì)素含量占20%以下的酚類底物[15,34]。具有高氧化還原電位的非酚類底物不能被漆酶直接氧化，因此為了拓展能夠被氧化的底物范圍，漆酶需要介質(zhì)的幫助。

介體(mediator)是一類低氧化還原電勢的小分子化合物，容易得失電子，在漆酶作用下形成高氧化還原電勢的穩(wěn)定中間體，并作用于底物使其被氧化[15,31,35]。1990年，Bourbonnais和Paice[36]首次報道，人工合成的小分子化合物2,2-聯(lián)氨-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)[2,2′-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6 sulphonic acid), ABTS]能夠增強云芝(T.versicolor)降解木質(zhì)素的能力。此后，對漆酶與這些小分子化合物在木質(zhì)素降解和紙漿生物漂白方面開展了廣泛的研究。漆酶與這些介體構(gòu)成的系統(tǒng)稱為漆酶/介體系統(tǒng)(LMS)，能夠?qū)崿F(xiàn)對高氧化還原電勢或不能進入漆酶活性中心的底物分子的快速降解，拓展了漆酶降解底物的范圍；同時介體的存在還能夠提高漆酶的催化效率和穩(wěn)定性，因而近年來被廣泛用于漆酶的應(yīng)用研究[37]。LMS催化底物氧化的流程見圖3B。

圖2 云芝漆酶活性中心結(jié)構(gòu)(A)[19,30-31]及其氧化松柏醇的反應(yīng)機理(B)[27-28]

4.2 介體類型

迄今為止，已有超過100種漆酶介體被報道[7]。根據(jù)其來源，常見介體主要分為兩大類，即天然介體(natural mediators)和合成介體(synthetic mediators)[7,38]。天然介體有乙酰丁香酮(acetosyringone,AS)、乙酰香草酮(acetovanillone)、肉桂酸(cinnamic acid)、鄰苯二酚(catechol)、針葉醇(coniferyl alcohol)、2,6-二甲基苯酚(2,6-dimethylphenol)、乙基香蘭素(ethyl vanillin)、阿魏酸(ferulic acid)、沒食子酸(gallic acid)、3-羥基鄰氨基苯甲酸(3-hydroxyanthranilic acid)、4-羥基苯甲酸(4-hydroxybenzoic acid)、對香豆酸(p-coumaric acid，p-PCA)、芥子酸(sinapic acid)、丁香醛(syringaldehyde, SA)、丁香酸(syringic acid)、2,4,6-三甲基苯酚(2,4,6-trimethylphenol)、香草醛(vanillin)、香草酰醇(vanillyl alcohol)等。合成介體有ABTS、N-羥基-N-乙酰基苯胺(N-hydroxyacetanilide, NHA)、1-羥基苯并三唑(1-hydroxybenzotriazole, HBT)、N-羥基鄰苯二甲酰亞胺(N-hydroxyphthalimide, HPI)、酚紅(phenol red)、2,2′,6,6′-四甲基呱啶氧化物(2,2′,6,6′-tetramethyl-piperidine-N-oxyl, TEMPO)、1-(3′-磺苯基)-3-甲基吡唑啉酮-5[1-(3′-sulphophenyl)-3-methylpyrazolone-5, SPP-m]、紫脲酸(violuric acid, VA)等[7]。另外，一些多金屬氧酸鹽(polyoxometalates，POM)具有氧化還原和催化的雙功能，被作為漆酶介體用于輔助降解木質(zhì)素和染料脫色[39]。筆者認為，介體也可以根據(jù)其主要結(jié)構(gòu)的復(fù)雜程度劃分為單苯環(huán)介體和多環(huán)或雜環(huán)介體。單苯環(huán)介體多為酚類的衍生醛、酮、酸等，如香草醛、丁香醛、芥子酸、乙酰丁香酮、乙酰香草酮和阿魏酸等。多環(huán)或雜環(huán)介體多為含氮、硫的雜環(huán)化合物，如ABTS、HBT、NHA、TEMPO、VA等。

A: 無介體; B: 有介體。

理想的漆酶介質(zhì)同時必須是一種良好的漆酶底物，其氧化還原形式必須穩(wěn)定、且不能抑制酶的活性，其氧化還原態(tài)轉(zhuǎn)換必須是可循環(huán)的[40-41]。另外，介體價格應(yīng)相對便宜且環(huán)境友好[39,42]。最初人們發(fā)現(xiàn)ABTS、HBT等雜環(huán)類介體與漆酶構(gòu)成的LMS對木質(zhì)素等多種底物具有良好的降解效果，但雜環(huán)和多環(huán)介體給環(huán)境造成了負擔，且對漆酶活性也有一定的影響[43～45]。而單苯環(huán)介體中多數(shù)是天然型介體，如乙酰丁香酮和丁香醛，最早在丁香的花瓣中和汁液中被發(fā)現(xiàn)，與人工合成的雜環(huán)或多環(huán)介體相比，具有來源清潔、價格低廉、低毒環(huán)保等特點。目前漆酶的天然介體日益受到人們的關(guān)注[39]。

4.3 LMS的作用機理

目前研究較為清晰的LMS作用機理有2大類，包括電子轉(zhuǎn)移(electron transfer, ET)途徑和自由基轉(zhuǎn)移(radical transfer, RT)途徑[34,38,40,46-47]。其中，自由基轉(zhuǎn)移途徑類型又可以分為氫原子轉(zhuǎn)移(hydrogen atom transfer, HAT)和離子機制(ionic mechanism, IM)途徑，二者催化底物氧化的功能基團分別為氮氧自由基(N-oxyl radicals, >N-O·)和氧合銨離子(Oxo-ammonium ion, >N=O+)[39]。電子轉(zhuǎn)移型介體如ABTS；HAT型介體結(jié)構(gòu)中往往含有氮羥基(>N-OH)單元，如HBT、HPI、VA、HAA等；IM型介體結(jié)構(gòu)中含有氮氧自由基(>N-O·)單元，如TEMPO(圖4)。

以ABTS為介體的LMS最早被發(fā)現(xiàn)，其作用機制屬于電子轉(zhuǎn)移機制[47-48]。漆酶介導(dǎo)的ABTS氧化經(jīng)過兩個階段，首先形成ABTS+·陽離子自由基，進而被緩慢氧化成ABTS2+(圖5A)[40,47]。以Ag/AgCl電極作參照的電化學(xué)研究表明，ABTS/ABTS+·和ABTS+·/ABTS2+的氧化還原電勢分別為0.472 V和0.885 V[48]。前人對云芝(T.versicolor)、嗜熱毀絲霉(Myceliophthorathermophila)漆酶研究發(fā)現(xiàn)，其T1-Cu中心的氧化還原電勢分別為0.585 V和0.3～0.4 V(以Ag/AgCl電作參照)[41]。因而，具有更高還原電勢的ABTS2+(而不是ABTS+·)在漆酶-ABTS系統(tǒng)中承擔著更重要的功能，介導(dǎo)非酚木質(zhì)素底物的氧化(圖5B)[40, 49-51]。

圖4 >N-OH和>N-O 型漆酶介體結(jié)構(gòu)[40]

在HAT途徑中，LMS介導(dǎo)的非酚木質(zhì)素底物氧化，更傾向于利用自由基氫原子轉(zhuǎn)移(radical H-atom transfer)[47]。由長絨毛栓菌(Trametesvillosa)和HBT構(gòu)成的LMS中，漆酶先將HBT氧化形成HBT+·自由基形式，再進一步去質(zhì)子化產(chǎn)生氮氧自由基(N-O·)，后者催化非酚木質(zhì)素底物芐基脫氫生成醛和HBT再生(圖6)[47,50]。另外，該途徑中底物氧化還原電位與反應(yīng)的相關(guān)性較低，主要取決于反應(yīng)體系的pH[47]。IM途徑與HAT途徑類似，但催化底物氧化的介體活性形式是氧合銨離子(>N=O+)[34,47]。漆酶氧化TEMPO生成離子型TEMPO(>N=O+)(圖7A)，其活化的氧合銨離子氧化非酚類底物芐基生成醛/酮，而自身被還原成還原型TEMPO(>N-OH)，然后漆酶再將還原型TEMPO依次氧化為自由基型TEMPO(>N-O·)和離子型TEMPO(圖7B)[40,47]。

5 LMS的應(yīng)用

5.1 造紙領(lǐng)域

造紙行業(yè)具有產(chǎn)量大、用水多、污染嚴重的特點。生物酶技術(shù)在造紙行業(yè)改造升級中發(fā)揮著重要的作用。LMS最初的發(fā)現(xiàn)正是源于利用云芝漆酶和ABTS降解木質(zhì)素，此后被廣泛研究并應(yīng)用于造紙行業(yè)[18]。LMS可以降低制漿過程中木質(zhì)素含量，去除膠黏物，改善紙漿性能[52-54]；在漂白過程中，酶法漂白替代傳統(tǒng)化學(xué)漂白，能夠提高漂白亮度，降低環(huán)境污染[55-56]；LMS用于造紙廢水的處理，可以顯著降低廢水中的木質(zhì)素含量、色度與化學(xué)需氧量值(chemical oxygen demand, COD)[57]。

A: ABTS。B:氧化途徑 Medox—氧化型介體; Medred—還原型介體

A: 介體; B: 氧化途徑 Med—介體; Medox—氧化型介體; Medred—還原型介體

利用長絨毛栓菌(T.villosa)漆酶-VA系統(tǒng)，處理由60%歐洲云杉(Piceaabis)和40%樟子松(Pinussylvestri)制備的未漂白紙漿，能夠獲得62%纖維素、90%漂白度的高品質(zhì)紙漿，完全能夠達到商品化的需要，并且較之傳統(tǒng)化學(xué)脫色方法，節(jié)約了約2 h和70%的過氧化氫消耗[52]。長絨毛栓菌(T.villosa)漆酶與1-亞硝基-2-萘酚-3，6-二磺酸(NNDS)構(gòu)成的介體體系能夠?qū)λ{桉(Eucalyptusglobulus)紙漿實現(xiàn)高效脫木質(zhì)素[58]。另外，利用長絨毛栓菌(T.villosa)漆酶介體系統(tǒng)處理劍麻(Agavesisalana)紙漿的比較研究中，對羥基肉桂酸、阿魏酸、松柏醛、芥子醛4種天然介體在促進紙漿漂白方面不如合成HBT有效，但它們傾向于與紙漿纖維結(jié)合從而改善紙漿特性，可用于功能化纖維應(yīng)用[53]。張勇兵等[59]報道，利用漆酶-ABTS系統(tǒng)處理纖維后，黃麻纖維中木質(zhì)素分子量減小，酚羥基、醇羥基以及甲氧基含量降低，羰基含量增加。利用朱紅密孔菌(Pycnoporuscinnabarinus)與5種天然介體(AS、SA、對-香豆素酸、香蘭素和乙酰苯胺)處理中國紅麻(Hibiscuscannabinus)紙漿研究發(fā)現(xiàn)，所有天然介體均能夠提高紙漿的卡帕值(kappa number)、降低亮度、改善紙漿性質(zhì)，其中AS和SA的脫木素和漂白效果最好，而另3種天然介體可用于紅麻功能化，以獲得性能新穎的紙漿[55]。以AS、SA和對香豆素3種植物酚作為朱紅密孔菌(P.cinnabarinus)漆酶介體處理未漂白的藍桉(E.globulus)紙漿的研究表明，對香豆素酸只引起紙漿白度的輕微增加，卡帕值變化不顯著；而使用AS或SA作為介質(zhì)使最終白度和卡帕值均提高15%以上，且處理后殘留木質(zhì)素組分也得到優(yōu)化[56]。裂褶菌(Schizophyllumcommune)漆酶與HBT構(gòu)成的介體系統(tǒng)對造紙廢水的研究中，當酶用量40 U·mL-1、HBT用量6 mg·L-1、50 ℃、pH 5.5處理4 h后，廢水中木質(zhì)素、色度與COD值的降解率分別達到了77.5%、81.1% 與61.1%[57]。

A: TEMPO; B: IM型非酚底物氧化途徑。

5.2 紡織領(lǐng)域

紡織行業(yè)染料消費量已占全球染料市場總量的三分之二，并且以每年3.5%的速度增長。隨著現(xiàn)代工業(yè)的快速發(fā)展，用在紡織及印染行業(yè)的染料在多種工藝上得到改善，增加了染料的溶解性以及漂染后的穩(wěn)定性的同時，也增加了環(huán)境治理的難度[35]。由于印染廢水成分復(fù)雜、色度高、COD高、有毒物質(zhì)多，是國內(nèi)外公認較難處理的工業(yè)廢水之一[60]。漆酶能有效降解木質(zhì)素的原因在于它可以氧化木質(zhì)素的酚類結(jié)構(gòu)，使酚類結(jié)構(gòu)形成不穩(wěn)定的氧化態(tài)，然后進行重排、轉(zhuǎn)化等反應(yīng)最終達到降解的目的，而用于紡織業(yè)的多種染料的主要結(jié)構(gòu)也是酚類結(jié)構(gòu)，因此漆酶對于染料廢水的降解有著良好的應(yīng)用前景。但印染廢水中的染料組分十分復(fù)雜，多數(shù)是酚類的多重衍生物，在酚類結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上還有偶氮、雜環(huán)等結(jié)構(gòu)，這使得其氧化還原電勢遠遠高于漆酶而無法被降解，因而相應(yīng)介體的引入使得這些頑固污染物被降解成為可能[39]。

Salami等[61]利用嗜熱毀絲霉(M.thermophila)漆酶對紡織廢水中常見的酸橙156、酸性紅52、考馬斯亮藍、甲基紫、孔雀石綠等5種染料進行降解處理6 h，漆酶-HBT系統(tǒng)對于5種染料的降解率達到了82%～96%，是同條件下純漆酶組的2倍；漆酶-AS系統(tǒng)對酸橙156等4種染料的降解率為97%～100%，其中對于孔雀石綠降解率為100%，對甲基紫降解率為79%。栓菌Trametessp. F1635漆酶與AS、HBT等4種介體組成的LMS對鉻黑T、伊文思藍、甲基橙等8種染料的降解實驗顯示，VA是降解伊文思藍、堿性品紅、亮藍、甲基橙、甲基藍的最適介體，降解率為85.6%～95.2%，AS和TEMPO也有很好的促降解效果，而HBT則無顯著促進作用[62]。而另一方面，利用粗毛栓菌(T.trogii)漆酶介體系統(tǒng)對堿性紡織工業(yè)染料廢水脫色脫毒實驗則顯示，HBT是其最適介體，8 h脫色率能達到50%[63]。因此，利用LMS處理紡織廢水時，應(yīng)根據(jù)不同染料廢水、漆酶類型篩選適宜的介體類型和工作條件(濃度、溫度、pH等)。

5.3 環(huán)保領(lǐng)域

隨著工農(nóng)業(yè)的飛速發(fā)展，環(huán)境污染問題日益嚴重，化工廢棄物、農(nóng)藥殘留、抗生素殘留等嚴重威脅著人類健康和環(huán)境安全。這些環(huán)境污染物如多環(huán)芳烴、有機磷農(nóng)藥、磺胺類抗生素等，往往是含苯環(huán)或雜環(huán)化合物，LMS對這些污染物降解與脫毒具有良好的應(yīng)用價值[38]。

粗毛革孔菌(Coriolopsisgallica)介體系統(tǒng)對10種多環(huán)芳烴的降解研究表明，ABTS和HBT是蒽(anthracene)降解的最適介體，漆酶5U、ABTS和HBT均為1 mmol·L-1條件下，20 μmol·L-1的蒽在10 min內(nèi)被完全降解，只有ABTS單一介體時需要9 h才能完全降解，而只有HBT存在時9 h降解80%[64]。云芝(T.versicolor)漆酶介體系統(tǒng)對毒死蜱(chlorpyrifos)、百菌清(chlorothalonil)、嘧霉胺(pyrimethanil)、莠去津(atrazine)、異丙隆(isoproturon)等5種農(nóng)藥降解研究表明，VA是嘧霉胺和異丙隆降解的最適介體，香草醛是毒死蜱降解的最適介體，AS和HBT是百菌清和莠去津降解的最適介體。VA介導(dǎo)的嘧霉胺和異丙隆在24 h降解率接近100%，而其他3種農(nóng)藥需要8 d降解率達到90%[65]。粗毛革孔菌(C.gallica)漆酶與9種介體構(gòu)成的體系對12種有機鹵化農(nóng)藥的降解研究表明，AS和SA是最佳介體，對溴苯腈、氯硝柳胺、溴芬肟和二氯酚等鹵化農(nóng)藥降解效率分別達到48.8%、142.0%、166.2%和1 257.6 nmol·min-1·U-1[66]。多年臥孔菌Perenniporiastrain TFRI 707漆酶介體系統(tǒng)對2種磺胺類藥物磺胺二甲氧嘧啶(SDM)和磺胺單甲氧嘧啶(SMM)降解研究表明，其最適介體為ABTS和丁香醛。漆酶-ABTS系統(tǒng)最適條件為pH 4、50～60℃、介體濃度1 mmol·L-1；漆酶-丁香醛系統(tǒng)最適條件為pH 6、50℃、介體濃度2 mmol·L-1；而以HBT和VA為介體的降解產(chǎn)物較之ABTS和丁香醛更低[67]。另外，云芝(T.versicolor)漆酶與ABTS或HBT構(gòu)成的介體系統(tǒng)對避蚊胺(N,N-diethyl-m-toluamide, DEET)的去除作用達到50%以上[68]。

6 展望

漆酶是極具應(yīng)用前景的多功能酶，對木質(zhì)素及其衍生物、多種染料、有機磷化合物、磺胺類化合物都有良好的降解作用。漆酶與小分子介體構(gòu)成的LMS進一步提高了漆酶的作用底物范圍、酶的催化效率與穩(wěn)定性，為這一研究歷史悠久的催化酶賦予了更加重要的生態(tài)價值和應(yīng)用價值。與此同時，白腐真菌較之細菌生長速率慢，酶活水平偏低、重組酶催化效率低，漆酶大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)方面的報道較少?？梢灶A(yù)見，新型高效真菌漆酶的挖掘、基于分子生物學(xué)手段高產(chǎn)漆酶工程菌株的構(gòu)建、高效低毒天然介體的篩選、漆酶固定化、環(huán)境污染物降解等將是今后真菌漆酶研究與應(yīng)用的重要方向。