Gac系統(tǒng)中g(shù)acS基因的缺失對東湖假單胞菌HYS毒性的影響

游佳, 桂哲, 謝志雄

武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 武漢 430072

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)是一種普遍生活在各種環(huán)境中、可引起人類疾病的條件致病菌[1]。P.aeruginosaPAO1是北美醫(yī)院中常見的致病菌之一，因其具有生成生物膜和轉(zhuǎn)運(yùn)抗生素的能力，因此對多種抗生素具有高抗性，可引起肺部感染，還可引起燒傷病人敗血癥，甚至死亡[2]。

在動植物及人體病源性假單胞菌中，Gac系統(tǒng)是一個保守的雙組分(GacS/GacA)調(diào)控系統(tǒng)，陸續(xù)在多種細(xì)菌中被鑒定出來[3-4]。GacS/GacA系統(tǒng)主要通過調(diào)控所在細(xì)菌的運(yùn)動能力、蛋白酶的分泌、細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)的產(chǎn)生、氫氰酸的合成等來影響毒力因子的產(chǎn)生，從而改變細(xì)菌的致病性[5-6]。其中，GacS是該系統(tǒng)的跨膜感應(yīng)蛋白，最初在丁香假單胞菌(Pseudomonassyingaepv.)中被鑒定出來，其受到外界信號激活后可自磷酸化。而GacA蛋白是該系統(tǒng)的調(diào)控蛋白，當(dāng)GacS自磷酸化后可激活GacA，假單胞菌中GacA蛋白通過結(jié)合到RsmY/Z等小RNA(small RNA，sRNA)的啟動子上起始表達(dá)。在P.aeruginosaPAO1中，這些sRNA與翻譯抑制蛋白RsmA結(jié)合，從而解除RsmA對下游目的基因的抑制作用。因此，GacS蛋白的缺失最終會導(dǎo)致目的基因的低表達(dá)[7]。

東湖假單胞菌(Pseudomonasdonghuensis)HYS菌株是本實驗室在前期工作中首次從武漢東湖水域分離的一株具備高產(chǎn)鐵載體能力的革蘭氏陰性菌，通過生理生化測試和基于全基因組測序的16S rRNA基因的進(jìn)化分析，這株高產(chǎn)鐵載體的菌株應(yīng)歸屬于Pseudomonasdonghuensissp.，并作為模式菌株被命名為PseudomonasdonghuensisHYS[8]。該HYS菌株可產(chǎn)生熒光鐵載體和非熒光鐵載體，且在同等培養(yǎng)條件下，其產(chǎn)鐵載體總量的能力是其他假單胞菌的5倍。HYS菌株還被發(fā)現(xiàn)對秀麗隱桿線蟲胚胎具有極強(qiáng)的致死效應(yīng)，秀麗隱桿線蟲胚胎在HYS菌苔上的孵化比例為0(大腸桿菌OP50陰性對照的孵化比例為100%)，且HYS喂食的秀麗隱桿線蟲半數(shù)致死時間約為3.6 d，由此也可推測出HYS具備成為致病菌的可能性[9]。然而，目前HYS的毒性調(diào)控機(jī)制尚不清楚。為了探究Gac系統(tǒng)對于潛在致病菌HYS毒性的影響，確定HYS中毒性因子的調(diào)控途徑，本研究先通過氨基酸序列BlastP比對以確定HYS中Gac系統(tǒng)的存在，再將不同來源的gacS片段通過基因克隆回補(bǔ)至HYS的gacS基因敲除株ΔgacS中，通過細(xì)菌-線蟲的致病模型驗證Gac系統(tǒng)對于HYS毒性的影響。隨后通過比較野生型HYS菌株、敲除株ΔgacS以及不同來源的gacS片段回補(bǔ)株在脫脂牛奶平板、運(yùn)動能力平板以及脂多糖和氫氰酸的檢測中的表型，進(jìn)一步明確gacS基因的缺失對于多種毒性因子的影響，以期完善HYS菌株的致病途徑，為后期HYS的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、線蟲和菌株

pBBR1-MCS2質(zhì)粒由本實驗室保存；秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)N2購自美國線蟲遺傳學(xué)中心(Caenorhabditis Genetics Center，CGC)；大腸桿菌S17-1、OP50以及銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)PAO1均由本實驗室保存；東湖假單胞菌(P.donghuensis)HYS分離自東湖水域，HYS的gacS基因敲除株ΔgacS由本實驗室構(gòu)建并保存[10]。

1.2 主要試劑與培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基、NGM培養(yǎng)基的配置方法參照高經(jīng)緯[9]的配方；脫脂牛奶培養(yǎng)基的配置方法參照Reinmman等[11]的配方。

泳動運(yùn)動檢測培養(yǎng)基：蛋白胨9 g，NaCl 4.5 g，瓊脂糖2.7 g，用自來水完全溶解后定容至900 mL，分裝至三角瓶中，每瓶150 mL，121 ℃、20 min高溫高壓滅菌。

群集運(yùn)動檢測培養(yǎng)基：蛋白胨9 g，酵母提取物4.5 g，葡萄糖4.5 g，瓊脂4.5 g，用自來水完全溶解后定容至900 mL，分裝至三角瓶中，每瓶150 mL，121 ℃、20 min高溫高壓滅菌。

蹭行運(yùn)動檢測培養(yǎng)基：蛋白胨9 g，酵母提取物4.5 g，NaCl 4.5 g，瓊脂9 g，用自來水完全溶解后定容至900 mL，分裝至三角瓶中，每瓶150 mL，121 ℃、20 min高溫高壓滅菌。

KMB培養(yǎng)基：蛋白胨20 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，K2HPO41.5 g，甘油10 mL，混合后加水定容至1 L，121 ℃、20 min高溫高壓滅菌。

1.3 儀器與試劑盒

HV-50型高壓滅菌鍋(日本Hirayama公司)；BS110S型分析電子天平(德國Sartorius公司)；GHP-9080隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；PCR儀(德國Eppendorf股份公司)。

苦味酸試紙購自北京華科盛精細(xì)化工產(chǎn)品貿(mào)易有限公司；細(xì)菌脂多糖提取試劑盒購自上海貝博生物科技有限公司；細(xì)菌脂多糖酶聯(lián)免疫分析試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.4 生物信息學(xué)分析

HYS全基因組測序工作已由本實驗室高經(jīng)緯完成并上傳至NCBI Whole Genome Shotgun數(shù)據(jù)庫，當(dāng)前版本接入號為AJJP01000000[9]。為了確定HYS中是否存在Gac系統(tǒng)，利用生物信息學(xué)方法預(yù)測并定位HYS基因組中g(shù)acS基因的位置。

將P.aeruginosaPAO1的Gac系統(tǒng)關(guān)鍵蛋白GacS作為參照，在數(shù)據(jù)庫中設(shè)置Pseudomonasdonghuensis種屬為背景。P.aeruginosaPAO1的PA0925、PA0926、PA0927(被注釋為idhA)、PA0928(被注釋為gacS)、PA0929以及PA0930序列均調(diào)取自NCBI；P.donghuensisHYS的UW3_RS0101475、UW3_RS0101480、UW3_RS0101485、UW3_RS0101490、UW3_RS0101500基因序列均調(diào)取自NCBI核酸數(shù)據(jù)庫，HYS的核酸數(shù)據(jù)庫接入號為NZ_AJJP01000185.1。將2組基因?qū)?yīng)的氨基酸序列進(jìn)行BlastP比對，并對結(jié)果進(jìn)行分析，保留HYS來源的高同源性比對結(jié)果并排序。

1.5 gacS基因回補(bǔ)菌株的構(gòu)建

分別從NCBI網(wǎng)站上調(diào)取P.donghuensisHYS和P.aeruginosaPAO1的gacS基因序列，以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至pBBR1-MCS2質(zhì)粒上，再利用細(xì)菌結(jié)合的方法將二者的gacS基因回補(bǔ)到HYS的gacS基因敲除株ΔgacS中，并分別標(biāo)記為ΔgacS/pBBR2-gacSHYS和ΔgacS/pBBR2-gacSPAO1。具體操作參照高經(jīng)緯[9]的方法。將構(gòu)建成功的ΔgacS/pBBR2-gacSHYS和ΔgacS/pBBR2-gacSPAO1菌株平板劃線至含50 μg·mL-1卡那霉素抗性的LB平板上，于4 ℃保存。

1.6 線蟲培養(yǎng)

將大腸桿菌OP50、P.aeruginosaPAO1、P.donghuensisHYS和ΔgacS菌株在LB平板上劃線，HYS/pBBR2、ΔgacS/pBBR2、ΔgacS/pBBR2-gacSHYS、ΔgacS/pBBR2-gacSpao1在含50 μg·mL-1的卡那霉素抗性平板上劃線。挑單菌落于5 mL液體LB培養(yǎng)基中，置于30 ℃、200 r·min-1搖床培養(yǎng)12 h，其中帶有pBBR1-MCS2質(zhì)粒的菌株均用50 μg·mL-1的卡那霉素抗性平板培養(yǎng)。取200 μL菌液滴加到NGM平板上，每個菌株滴5個NGM平板，待菌液晾干后，將滴有菌液的NGM平板放置于22 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h。將同步培養(yǎng)到L4期的秀麗隱桿線蟲轉(zhuǎn)移到NGM-實驗菌株平板上，每個平板20只。轉(zhuǎn)移線蟲的當(dāng)天記為第1天，之后每5天記錄1次線蟲狀態(tài)，同時將存活的線蟲轉(zhuǎn)移到新的NGM-實驗菌株平板上，直至線蟲全部死亡。通過統(tǒng)計線蟲存活的個數(shù)和天數(shù)可指示菌株對線蟲的毒性大小。本實驗室培養(yǎng)秀麗隱桿線蟲用大腸桿菌OP50作為食物維持，因此將僅含大腸桿菌OP50的處理組作為陰性對照。

表1 實驗所用引物

1.7 胞外蛋白酶的檢測

利用分光光度計測定各菌株活化所得菌液的OD600，并將其OD600調(diào)至0.2。用無菌的槍頭取2 μL待測菌液滴到脫脂牛奶平板的表面，待菌液晾干后，倒置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，測量其產(chǎn)生的透明圈大小。

1.8 運(yùn)動能力的檢測

利用分光光度計測定各菌株活化所得菌液的OD600，并將其OD600調(diào)至0.1。泳動運(yùn)動和群集運(yùn)動的檢測用無菌的槍頭取2 μL待測菌液滴到泳動運(yùn)動平板、群集運(yùn)動平板的表面，待菌液晾干后，正置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中12 h后，測量2種運(yùn)動圈直徑大小。蹭行運(yùn)動的檢測用無菌的槍頭垂直刺穿直至蹭行運(yùn)動培養(yǎng)基底部，然后將菌液沿著刺穿的孔點加至培養(yǎng)基的底部，待菌液完全吸入培養(yǎng)基后，將其倒置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中24 h后，測量蹭行運(yùn)動產(chǎn)生的運(yùn)動痕跡的大小。記錄數(shù)據(jù)并拍照保存，每個菌株獨立實驗3次。

1.9 脂多糖的提取與檢測

將各菌株活化所得的菌液按1%接種到50 mL LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r·min-1振蕩培養(yǎng)12 h，將菌液的OD600調(diào)至3.0，利用細(xì)菌脂多糖提取試劑盒提取各菌株的脂多糖樣品，具體操作參見試劑盒說明書。然后利用細(xì)菌脂多糖酶聯(lián)免疫分析試劑盒進(jìn)行脂多糖濃度檢測，具體操作參見試劑盒說明書。

1.10 氫氰酸檢測

在KMB平板上(添加了4.5 g·L-1的甘氨酸)上活化實驗菌株，然后將苦味酸試紙浸泡在2%碳酸鈉溶液中，將試紙滅菌后烘干，再將試紙放置于培養(yǎng)皿上蓋內(nèi)側(cè)，封口膜密封培養(yǎng)皿，正置于30 ℃下培養(yǎng)48 h，拍照記錄。

1.11 數(shù)據(jù)與分析

P.donghuensisHYS和P.aeruginosaPAO1中同源性基因的排列繪制自SnapGene 2.3.2。柱狀圖繪制自O(shè)rigin 9.0和Photoshop CS2軟件。顯著性分析采用Duncan多重比較法。

2 結(jié)果與分析

2.1 HYS的生物信息學(xué)分析

將P.aeruginosaPAO1的Gac系統(tǒng)關(guān)鍵蛋白GacS作為參照，以Pseudomonasdonghuensis種屬為數(shù)據(jù)庫，在NCBI中進(jìn)行氨基酸序列BlastP比對，結(jié)果如表2所示。

為了更精準(zhǔn)定位HYS中GacS蛋白的位置，需將PAO1基因組中的gacS核酸序列與表2中蛋白同源性最高的WP_026001148.1的核酸序列以及相鄰基因核酸序列進(jìn)行比對分析。PAO1中GacS蛋白對應(yīng)的gacS編碼基因的編號為PA0928，HYS基因組中WP_026001148.1蛋白編碼基因的編號為UW3_RS0101480。結(jié)果如圖1所示，2個基因組中相同的顏色代表2個同源基因，而不同顏色代表基因組內(nèi)不同的基因?？芍狿.donghuensisHYS中編號為UW3_RS0101485的基因與P.aeruginosaPAO1中g(shù)acS基因所在位置的相鄰基因排布一致(圖1)，且具有高度同源性(表3)。該結(jié)果說明UW3_RS0101485基因即是PAO1中Gac系統(tǒng)關(guān)鍵的gacS基因的同源基因，由此可推測HYS中存在Gac系統(tǒng)。

表2 東湖假單胞菌HYS中GacS蛋白的同源性比對

圖1 P. aeruginosa PAO1與P. donghuensis HYS中g(shù)acS基因的定位

PAO1基因編號HYS基因編號HYS蛋白編號蛋白同源性E值PA0930UW3_RS0101475WP_036995139.156.18%5E-165PA0929UW3_RS0101480WP_010220372.157.50%3E-99PA0927UW3_RS0101490WP_010220374.177.98%0.0PA0926UW3-RS0101495WP_010220375.176.60%2E-84PA0925UW3_RS0101500WP_010220376.154.96%3E-58

2.2 Gac系統(tǒng)對HYS毒性的影響

為了檢測HYS的Gac系統(tǒng)是否發(fā)揮毒性調(diào)控作用，分別將P.aeruginosaPAO1和P.donghuensisHYS的gacS基因回補(bǔ)到HYS的gacS基因敲除株ΔgacS中，將所得菌株喂食秀麗隱桿線蟲，通過比較線蟲的生存天數(shù)和生存數(shù)量來判斷菌株毒性的強(qiáng)弱，從而驗證HYS菌株中Gac系統(tǒng)的功能保守性。

由表4可知，野生型HYS菌株和PAO1菌株均對線蟲有較為強(qiáng)烈的毒性，且HYS對線蟲的毒性更強(qiáng)。而ΔgacS菌株毒性明顯減弱，其喂食的線蟲甚至與OP50喂食的線蟲生存率相當(dāng)(在第15天還有26條存活)。喂食ΔgacS的空載體菌株ΔgacS/pBBR2的線蟲在培養(yǎng)19 d后仍有1條存活；而喂食HYS的空載體菌株HYS/pBBR2的線蟲在第5天只有9條存活，培養(yǎng)到第10天沒有線蟲存活?；匮a(bǔ)菌株ΔgacS/pBBR2-gacSHYS對線蟲的毒性恢復(fù)明顯，在第10天后沒有線蟲存活；同時，回補(bǔ)PAO1的gacS基因的ΔgacS/pBBR2-gacSPAO1菌株對線蟲的毒性也有一定程度的恢復(fù)，但與回補(bǔ)菌株ΔgacS/pBBR2-gacSHYS存在一定差距。上述結(jié)果說明，HYS中的Gac系統(tǒng)參與了毒性調(diào)控途徑，且PAO1的gacS基因在HYS菌株中同樣能夠發(fā)揮一定的毒性調(diào)控作用。

2.3 HYS的Gac系統(tǒng)對毒性因子表型的影響

2.3.1HYS的Gac系統(tǒng)對蛋白酶分泌的影響

由圖2可知，將gacS基因敲除后，ΔgacS菌株不能產(chǎn)生蛋白酶水解圈，說明沒有蛋白酶的產(chǎn)生或蛋白酶活性完全喪失；而回補(bǔ)菌株ΔgacS/pBBR2-gacSHYS的蛋白酶活性幾乎恢復(fù)到野生型HYS的水平，由此推測gacS基因的缺失抑制了HYS菌株胞外蛋白酶的表達(dá)或分泌。此外，回補(bǔ)菌株ΔgacS/pBBR2-gacSPAO1和敲除株ΔgacS相比，蛋白酶活性有一定的恢復(fù)，但其蛋白酶水解圈顯著小于回補(bǔ)菌株ΔgacS/pBBR2-gacSHYS(P<0.05)，說明PAO1的gacS基因只能夠恢復(fù)部分蛋白酶活性。

表4 各菌株毒性對線蟲生存天數(shù)和生存數(shù)量的影響

A：各菌株在脫脂牛奶平板上的胞外蛋白酶產(chǎn)生情況；B：A中數(shù)據(jù)對應(yīng)的柱狀圖，不同小寫字母表示不同菌株間蛋白酶產(chǎn)量的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.3.2HYS的Gac系統(tǒng)對運(yùn)動能力的影響 為了探究HYS菌株Gac系統(tǒng)對其運(yùn)動能力的影響，本研究檢測了所得菌株的運(yùn)動能力。由表5可知，敲除株ΔgacS與野生型HYS間的3種運(yùn)動能力的差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；且ΔgacS/pBBR2與野生型HYS/pBBR2間3種運(yùn)動能力的差異也均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。向敲除株ΔgacS回補(bǔ)HYS的gacS基因后，回補(bǔ)菌株ΔgacS/pBBR2-gacSHYS的3種運(yùn)動能力均能恢復(fù)到甚至超過野生型HYS菌株的水平。而回補(bǔ)菌株ΔgacS/pBBR2-gacSHYS和ΔgacS/pBBR2-gacSPAO1間泳動運(yùn)動和群集運(yùn)動能力的差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，即HYS自身的gacS基因和PAO1的gacS基因均能恢復(fù)HYS菌株因gacS基因缺失所產(chǎn)生的2種運(yùn)動表型變化。與野生型菌株相比，攜帶pBBR2質(zhì)粒的菌株的3種運(yùn)動能力均顯著下降(P<0.05)，表明質(zhì)粒也會對菌株的運(yùn)動能力造成一定的影響。

表5 菌株運(yùn)動能力的比較

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示不同菌株間運(yùn)動能力的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.3.3HYS的Gac系統(tǒng)對脂多糖產(chǎn)量的影響

為了探究HYS菌株Gac系統(tǒng)對毒性因子脂多糖的影響，對所得菌株進(jìn)行了脂多糖濃度的檢測。利用細(xì)菌脂多糖提取試劑盒對菌株的脂多糖進(jìn)行提取，提取后的脂多糖用脂多糖檢測試劑盒進(jìn)行濃度檢測。標(biāo)準(zhǔn)物所做標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3A所示，其線性回歸方程為：Y=0.002 4X+0.212 7(R2=0.983 2)。

由圖3B可知，將gacS基因敲除后，與野生型HYS相比，敲除株ΔgacS的脂多糖濃度顯著下降(P<0.05)；回補(bǔ)HYS的gacS基因后，回補(bǔ)菌株的脂多糖濃度有所上升，差值小于敲除株ΔgacS與野生型HYS之間的差距，說明回補(bǔ)的基因發(fā)揮了作用(圖3B)。此外，回補(bǔ)了PAO1的gacS基因的ΔgacS/pBBR2-gacSPAO1菌株的LPS產(chǎn)量恢復(fù)至野生型PAO1的水平(P>0.05)，但仍顯著低于ΔgacS/pBBR2-gacSHYS菌株(P<0.05)。上述結(jié)果說明HYS的Gac系統(tǒng)可正調(diào)控其脂多糖的生成。

A：標(biāo)準(zhǔn)曲線；B：各菌株生產(chǎn)的脂多糖濃度，不同小寫字母表示不同菌株間脂多糖產(chǎn)量的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.3.4HYS的Gac系統(tǒng)對氫氰酸生成的影響

為了探究HYS菌株Gac系統(tǒng)對其生成有毒代謝物氫氰酸的影響，本研究進(jìn)行了氫氰酸生成的檢測。根據(jù)試紙的變色程度來判斷氫氰酸的產(chǎn)生情況。

從圖4可以看出，野生型HYS在KMB培養(yǎng)基能產(chǎn)生氫氰酸，試紙變黃褐色；而敲除株ΔgacS試紙不變色，說明沒有氫氰酸產(chǎn)生。回補(bǔ)HYS的gacS基因后，試紙變色，說明回補(bǔ)菌株ΔgacS/pBBR2-gacSHYS重新產(chǎn)生氫氰酸，回補(bǔ)基因發(fā)揮了功能。但其變色程度不如HYS/pBBR2野生型明顯，由此推測其產(chǎn)生的氫氰酸含量少于HYS/pBBR2野生型菌株。此外，回補(bǔ)了PAO1gacS基因的ΔgacS/pBBR2-gacSPAO1的變色程度雖然有恢復(fù)，但不及ΔgacS/pBBR2-gacSHYS明顯。

圖4 不同菌株的氫氰酸含量檢測

上述結(jié)果表明，HYS的Gac系統(tǒng)與PAO1中Gac系統(tǒng)高度保守，可形成一定程度上的功能互補(bǔ)，且HYS中g(shù)acS的缺失影響了HYS對線蟲的慢性毒性。PAO1中的gacS基因控制著線蟲的致病因子的產(chǎn)生，如胞外蛋白酶、脂多糖、氫氰酸等[12-13]，而在HYS中，gacS基因也發(fā)揮著同樣的作用，進(jìn)而可能引發(fā)潛在的動植物致病性。

3 討論

P.aeruginosaPAO1是一種人類機(jī)會致病菌，因其可造成人類疾病而被廣泛研究。秀麗隱桿線蟲因具有個體小、形態(tài)簡單、易于培養(yǎng)保存與復(fù)蘇、滿足高通量篩選以及與人類疾病相關(guān)基因高度同源等特點，而被廣泛應(yīng)用于各類微生物致病機(jī)制的研究[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)，相對于大腸桿菌OP50，P.donghuensisHYS菌株與機(jī)會致病菌PAO1均具備強(qiáng)烈的毒殺線蟲的能力。此外，HYS喂食的線蟲在第5天只有9條存活，而PAO1喂食線蟲在第9天依然有13條存活，表明HYS相比人類機(jī)會致病菌PAO1對線蟲具備更強(qiáng)的致死效應(yīng)。

本研究通過生物信息學(xué)比對分析確定了HYS菌株中存在與PAO1高度同源的Gac系統(tǒng)。對于P.aeruginosa菌種，已有研究報道Gac系統(tǒng)與其致病性緊密相關(guān)[11]。 在本研究中，HYS的gacS基因敲除株ΔgacS所喂食的線蟲在第15天還存活26條，相比于野生型HYS，其毒性幾乎完全喪失。由于HYS和PAO1的GacS蛋白具有同源性，將PAO1的gacS片段回補(bǔ)到HYS的ΔgacS菌株中在一定程度上恢復(fù)了ΔgacS菌株的毒性表型，提示著PAO1的Gac系統(tǒng)與HYS的Gac系統(tǒng)對毒性控制具有同樣的功能。但值得注意的是，HYS對線蟲的毒性明顯強(qiáng)于PAO1，且回補(bǔ)PAO1的gacS基因無法完全恢復(fù)HYS的毒性表型。在第5天時，喂食ΔgacS/pBBR2-gacSPAO1的線蟲與喂食ΔgacS/pBBR2-gacSHYS相比，存活數(shù)量幾乎多了一倍；在第10天時，喂食ΔgacS/pBBR2-gacSPAO1的線蟲仍存活35條，而喂食ΔgacS/pBBR2-gacSHYS的線蟲則全部死亡，暗示著HYS中除了存在PAO1中被GacS蛋白調(diào)控的毒力因子外，可能還存在著HYS中特有的、更強(qiáng)烈的毒力因子。

脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，也稱為脂質(zhì)聚糖和內(nèi)毒素，是革蘭氏陰性菌外膜的主要組成成分。LPS的功能包括細(xì)菌的粘附、外膜滲透屏障、抗血清以及抗吞噬，另外還可作為某些噬菌體的吸附受體[16]。LPS還介導(dǎo)著細(xì)菌和周圍環(huán)境間的相互作用，有利于細(xì)菌應(yīng)對極端生存環(huán)境[17]。有研究表明，綠針假單胞菌(Pseudomonaschlororaphis) G5的Gac系統(tǒng)顯示出與HYS不同的調(diào)控方向，G5菌株的gacA缺失株負(fù)調(diào)控LPS的產(chǎn)量，粗糙型脂多糖的產(chǎn)量明顯增多，這與HYS的ΔgacS菌株中LPS的總量下降的現(xiàn)象相反[18]，也就意味著在HYS中Gac系統(tǒng)正調(diào)控LPS的產(chǎn)量。氫氰酸(hydrogen cyanide, HCN)作為假單胞菌產(chǎn)生的一種毒性物質(zhì)，在多種假單胞菌的分泌物中均有發(fā)現(xiàn)，如熒光假單胞菌(P.fluorescent)CHA0、P.aeruginosaPAO1等[19-20]。氫氰酸可以通過抑制呼吸酶造成細(xì)胞內(nèi)窒息，曾作為一種生物殺菌劑用于煙草的黑根腐病的防治研究[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，HYS的gacS基因敲除株ΔgacS中HCN產(chǎn)量幾乎喪失，這一結(jié)果與閆小雪等[21]在熒光假單胞菌中Gac系統(tǒng)對HCN產(chǎn)量的調(diào)控趨勢相同。P.aeruginosaPAO1中的堿性蛋白酶AprA和彈性蛋白酶LasA、LasB所組成的胞外蛋白酶也是其毒力因子的一種，蛋白酶通過降解免疫球蛋白或抗菌肽等幫助病原體入侵[22]。HYS的gacS基因缺失株胞外蛋白酶活性喪失，脫脂牛奶平板上的蛋白酶水解圈完全消失。這和Duffy等[23]發(fā)現(xiàn)Gac系統(tǒng)對一些胞外酶基因的表達(dá)起正調(diào)控作用現(xiàn)象一致。此外，細(xì)菌的運(yùn)動性也參與幫助病原體附著到宿主表面，以及促進(jìn)生物膜的產(chǎn)生幫助發(fā)揮細(xì)菌毒性等作用[24]。細(xì)菌常見的運(yùn)動方式有3種：泳動運(yùn)動、群集運(yùn)動和蹭行運(yùn)動[25]。本研究發(fā)現(xiàn)敲除gacS基因后，細(xì)菌在3種運(yùn)動平板上的運(yùn)動直徑均明顯增大，這一現(xiàn)象與魏雪[26]在P.aeruginosaM18中觀察到的gacA缺失菌株的運(yùn)動性表型極為相近。

然而，本研究并未深入到基因或蛋白質(zhì)表達(dá)層次的調(diào)控研究。許多研究表明Gac系統(tǒng)是通過下游sRNA進(jìn)行調(diào)控作用的[27]。HYS中確實存在RsmY/Z/A sRNA[10]，但如何對細(xì)菌的運(yùn)動能力以及LPS、氫氰酸和蛋白酶的生成進(jìn)行調(diào)控還有待深入研究，尤其是HYS中Gac系統(tǒng)調(diào)控LPS的模式與其他菌株不同，提示HYS中RsmY/Z/A sRNA對LPS可能存在特殊的調(diào)控模式。綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)相比人類機(jī)會致病菌PAO1，HYS具備更強(qiáng)的線蟲致死能力，敲除株ΔgacS通過下調(diào)多種毒力因子來影響其毒性的產(chǎn)生。本研究的結(jié)果為未來深入探討HYS中毒力因子調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，同時也為HYS可能引起的動物毒害作用提供了抗毒研究的新思路。