意大利蜜蜂工蜂中腸發(fā)育過程中的差異基因表達(dá)譜及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

杜宇，周丁丁，萬潔琦，盧家軒，范小雪，范元嬋，陳恒，熊翠玲，鄭燕珍，付中民，徐國(guó)鈞，陳大福，郭睿

意大利蜜蜂工蜂中腸發(fā)育過程中的差異基因表達(dá)譜及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

杜宇，周丁丁，萬潔琦，盧家軒，范小雪，范元嬋，陳恒，熊翠玲，鄭燕珍，付中民，徐國(guó)鈞，陳大福，郭睿

（福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院（蜂學(xué)學(xué)院），福州 350002）

【】前期已對(duì)意大利蜜蜂（，簡(jiǎn)稱意蜂）7日齡工蜂中腸（Am7）、10日齡工蜂中腸（Am10）進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，本研究基于高質(zhì)量的組學(xué)數(shù)據(jù)探究中腸發(fā)育過程中的差異基因表達(dá)譜及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，以期解析意蜂工蜂中腸發(fā)育的分子機(jī)理。根據(jù)FPKM（fragments per kilobase of transcript per million mapped reads）算法計(jì)算基因表達(dá)量，并以|log2fold change|≥1且≤0.05作為標(biāo)準(zhǔn)篩選得到差異表達(dá)基因（differentially expressed gene，DEG）。利用TargetFinder軟件預(yù)測(cè)ame-miR-6001-3p的靶mRNA。利用相關(guān)生物信息學(xué)軟件，對(duì)全部DEG進(jìn)行GO和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋。篩選出與AMPK、P13K-Akt、Wnt、cAMP、FoxO、Hippo、mTOR、Jak-STAT、Toll-like受體、TGF-beta、Notch、MAPK和NF-κB 13條信號(hào)通路存在富集關(guān)系的DEG，以及與ame-miR-6001-3p存在靶向結(jié)合關(guān)系的DEG，通過Cytoscape軟件構(gòu)建調(diào)控網(wǎng)絡(luò)將其富集關(guān)系與調(diào)控關(guān)系可視化。利用莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄PCR（Stem loop RT-PCR）和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）驗(yàn)證ame-miR-6001-3p以及DEG在Am7和Am10中的差異表達(dá)情況。Am7 vs Am10比較組中共有1 038個(gè)DEG，包括515個(gè)上調(diào)基因和523個(gè)下調(diào)基因。這些DEG涉及細(xì)胞進(jìn)程、代謝進(jìn)程和催化活性等功能條目，并顯著富集在氧化磷酸化、氨基糖與核苷酸糖代謝、脂肪酸代謝和嘌呤代謝等能量和物質(zhì)代謝通路，表明工蜂中腸內(nèi)存在旺盛細(xì)胞生命與新陳代謝活動(dòng)。表達(dá)量聚類分析發(fā)現(xiàn)分別有20、18、15和14個(gè)DEG富集在AMPK信號(hào)通路、P13K-Akt信號(hào)通路、內(nèi)吞作用和Hippo信號(hào)通路。57個(gè)DEG與P13K-Akt、Wnt、Jak-STAT等上述13條與生長(zhǎng)發(fā)育和免疫防御相關(guān)的信號(hào)通路存在富集關(guān)系，且1個(gè)DEG可與多條信號(hào)通路存在富集關(guān)系。調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，分別有54個(gè)上調(diào)基因和44個(gè)下調(diào)基因可被ame-miR-6001-3p靶向結(jié)合；上調(diào)基因富集在磷酸肌醇代謝、胰島素信號(hào)通路、Hippo信號(hào)通路和谷胱甘肽代謝等43條代謝通路，而下調(diào)基因富集在Hippo信號(hào)通路、新陳代謝途徑、谷胱甘肽代謝和花生四烯酸代謝等20條代謝通路。RT-qPCR結(jié)果顯示隨機(jī)挑選的6個(gè)DEG的表達(dá)量變化趨勢(shì)與測(cè)序數(shù)據(jù)一致，證實(shí)了本研究中基因差異表達(dá)真實(shí)可靠。此外ame-miR-6001-3p在Am7和Am10內(nèi)均真實(shí)表達(dá)，并在Am10中的相對(duì)表達(dá)量顯著較低。對(duì)意蜂工蜂中腸發(fā)育過程的DEG表達(dá)譜和DEG與ame-miR-6001-3p之間的調(diào)控關(guān)系，以及DEG的潛在作用進(jìn)行深入分析和探討，發(fā)現(xiàn)DEG可參與TGF-beta、Wnt、Hippo、Notch、PI3K-Akt、mTOR、AMPK和NF-κB等各類信號(hào)通路進(jìn)而影響中腸的生長(zhǎng)發(fā)育和免疫防御，DEG可通過與顯著下調(diào)表達(dá)的ame-miR-6001-3p形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)參與意蜂工蜂中腸發(fā)育過程中胰島素信號(hào)通路等多條代謝途徑。

意大利蜜蜂；中腸；發(fā)育；差異表達(dá)基因；競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA；調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

0 引言

【研究意義】意大利蜜蜂（，簡(jiǎn)稱意蜂）是經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生態(tài)價(jià)值優(yōu)越的社會(huì)性模式昆蟲，廣泛用于國(guó)內(nèi)外的養(yǎng)蜂生產(chǎn)。蜜蜂中腸作為營(yíng)養(yǎng)消化吸收、能量物質(zhì)代謝以及免疫應(yīng)答防御的主要場(chǎng)所，其發(fā)育機(jī)理至今仍不明了。因此，通過分析差異表達(dá)基因（differentially expressed gene，DEG）在腸道發(fā)育過程中的表達(dá)譜、DEG的潛在作用及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，可為明確意蜂中腸發(fā)育的分子機(jī)理提供理論依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】昆蟲腸道的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)可影響個(gè)體的發(fā)育進(jìn)程。COON等研究發(fā)現(xiàn)，埃及伊蚊（）和岡比亞按蚊（）腸道內(nèi)的部分菌群是維持個(gè)體正常發(fā)育的關(guān)鍵因子[1]。抗生素處理可導(dǎo)致斯氏按蚊（）幼蟲發(fā)育緩慢[2]，而植物乳桿菌（）可以通過影響激素信號(hào)受體促進(jìn)黑腹果蠅（）的個(gè)體增長(zhǎng)[3]。目前有關(guān)蜜蜂腸道的研究主要涉及腸道菌群的結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測(cè)、外源營(yíng)養(yǎng)素與腸道發(fā)育的關(guān)系等方面。ZHENG等[4]通過比較無菌西方蜜蜂（）與正常西方蜜蜂的生長(zhǎng)速率和腸道質(zhì)量，發(fā)現(xiàn)腸道菌群會(huì)促進(jìn)西方蜜蜂腸道的發(fā)育并增加個(gè)體質(zhì)量；馮倩倩[5]利用添加維生素A的代用花粉飼喂意蜂，通過檢測(cè)中腸蛋白質(zhì)濃度、堿性磷酸酶活性和圍食膜厚度等指標(biāo)發(fā)現(xiàn)適量的維生素A有益于意蜂腸道的發(fā)育。近年來以RNA-seq為代表的第二代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)迅猛發(fā)展，為蜜蜂中腸發(fā)育機(jī)理的深入研究提供了有力工具。筆者團(tuán)隊(duì)前期利用二代測(cè)序技術(shù)和趨勢(shì)分析方法解析了意蜂幼蟲腸道發(fā)育過程中的差異基因表達(dá)譜[6]，并探究了微小RNA（microRNA，miRNA）在幼蟲腸道發(fā)育過程中的調(diào)控作用[7]。前人研究發(fā)現(xiàn)ame-miR-6001-3p作為關(guān)鍵的基因表達(dá)調(diào)控因子，可參與調(diào)控蜜蜂蛻皮激素的分泌[8]和級(jí)型分化過程[9]。結(jié)合鏈特異性建庫(kù)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）測(cè)序技術(shù)、small RNA-seq（sRNA-seq）技術(shù)，筆者團(tuán)隊(duì)前期已對(duì)意蜂7和10日齡工蜂中腸（Am7和Am10）進(jìn)行了深度測(cè)序，獲得了高質(zhì)量的全轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，并通過深入的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)意蜂工蜂中腸內(nèi)的lncRNA和環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）可作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA（ceRNA）吸附結(jié)合ame-miR-6001-3p，從而間接調(diào)控mRNA的表達(dá)，影響中腸的細(xì)胞分化、新陳代謝、信號(hào)傳導(dǎo)和免疫調(diào)控[10-11]。【本研究切入點(diǎn)】然而，前期研究均是在單一ncRNA組學(xué)層面探究意蜂工蜂中腸的發(fā)育機(jī)理，缺乏mRNA組學(xué)層面的分析和闡釋，也沒有綜合多個(gè)層面組學(xué)數(shù)據(jù)對(duì)編碼RNA與ncRNA的相互調(diào)控關(guān)系進(jìn)行深入探討?！緮M解決的關(guān)鍵問題】基于已獲得的高質(zhì)量全轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過生物信息學(xué)方法對(duì)意蜂工蜂中腸發(fā)育過程中的DEG及其潛在作用進(jìn)行深入分析，并結(jié)合前期在lncRNA組學(xué)和circRNA組學(xué)層面的分析篩選出的ame-miR-6001-3p，構(gòu)建和分析mRNA與miRNA之間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，以期更深入地解析意蜂工蜂中腸的發(fā)育機(jī)理。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2017—2019年在福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院（蜂學(xué)學(xué)院）蜜蜂保護(hù)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1 供試蜜蜂

選取福建農(nóng)林大學(xué)教學(xué)蜂場(chǎng)內(nèi)的意蜂蜂群3群，提取9張老熟封蓋子脾至實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)箱內(nèi)，箱內(nèi)溫度（34±0.5）℃，相對(duì)濕度70%，收集剛羽化出房工蜂100只。

1.2 意蜂工蜂中腸全轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來源

中腸樣品的制備步驟簡(jiǎn)述如下：每10只剛羽化（記為0日齡）的工蜂放入1個(gè)四周打孔通風(fēng)的干凈塑料盒內(nèi)，盒子上方裝有50%（w/v）無菌糖水的飼喂器，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（條件同1.1）。在超凈工作臺(tái)內(nèi)分別剖取飼養(yǎng)至7日齡工蜂中腸（Am7）和10日齡工蜂中腸（Am10），每3只中腸置于1個(gè)RNA-Free的EP管中，液氮速凍后迅速放入-80℃超低溫冰箱保存。Am7和Am10均設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。鑒于東方蜜蜂微孢子蟲（）完成一個(gè)生活史需要6 d[12]以及10 d仍處于孢子不斷增殖時(shí)期[13]，同時(shí)為滿足探究意蜂工蜂中腸發(fā)育機(jī)理及意蜂對(duì)主要真菌病原的脅迫應(yīng)答，本研究選擇上述兩個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)。

上述6個(gè)中腸樣品的cDNA文庫(kù)構(gòu)建、lncRNA- seq實(shí)驗(yàn)技術(shù)流程參數(shù)參照郭睿等[10]方法，委托廣州基迪奧生物技術(shù)有限公司進(jìn)行，測(cè)序平臺(tái)分別為Illumina HiseqTM4000。相關(guān)原始數(shù)據(jù)已上傳至NCBI SRA數(shù)據(jù)庫(kù)，BioProject號(hào)：PRJNA406998。

1.3 測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)控

利用Perl腳本剔除測(cè)序數(shù)據(jù)原始讀段中未知核苷酸含量＞5%以及含量＞50%的質(zhì)量低的讀段（reads），獲得有效讀段（clean reads）。過濾可比對(duì)上核糖體RNA數(shù)據(jù)庫(kù)的reads，進(jìn)而通過TopHat2將unmapped reads比對(duì)到西方蜜蜂參考基因組（Amel_4.5）（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCF_000002195.4）。校準(zhǔn)參數(shù)如下：（1）最大讀取不匹配為2；（2）配對(duì)讀取目標(biāo)區(qū)域?yàn)?0 bp；（3）配對(duì)讀取目標(biāo)區(qū)域誤差為±80 bp。利用Cufflinks將對(duì)比到轉(zhuǎn)錄本上的reads進(jìn)行組裝。根據(jù)FPKM（fragments per kilobase of transcript per million mapped reads）算法計(jì)算基因表達(dá)量，并利用R軟件計(jì)算Pearson相關(guān)性系數(shù)來評(píng)估同組樣品的生物學(xué)重復(fù)性。

1.4 DEG分析

將|log2fold change|≥1且值≤0.05的基因定義為DEG。利用Blast軟件將DEG注釋到GO數(shù)據(jù)庫(kù)和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，繪制生物學(xué)進(jìn)程、細(xì)胞組分和分子功能三大類的GO富集分類柱狀統(tǒng)計(jì)圖，并通過在線分析軟件OmicsShare（http://www.omicshare.com/ tools/Home/Index/index.html）繪制表達(dá)量聚類熱圖。ame-miR-6001-3p是基于意蜂工蜂中腸的全轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及前期分析結(jié)果篩選得到的候選靶標(biāo)，該靶標(biāo)可靶向結(jié)合多個(gè)意蜂lncRNA和circRNA，且位于調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的中心[10-11]。利用TargetFinder軟件對(duì)ame-miR- 6001-3p的靶mRNA進(jìn)行預(yù)測(cè)，并與本研究的DEG進(jìn)行比較。最后，根據(jù)DEG與ame-miR-6001-3p以及KEGG代謝通路（pathway）的關(guān)系構(gòu)建調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并利用Cytoscape軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化[14]。

1.5 DEG及ame-miR-6001-3p的驗(yàn)證

為驗(yàn)證測(cè)序數(shù)據(jù)的可靠性，隨機(jī)選取3個(gè)上調(diào)基因（XM_016912284.1、TCONS_00023605和XM_ 016912389.1）和3個(gè)下調(diào)基因（TCONS_00001615、XM_001123053.4和XM_016915022.1）進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證。首先利用RNA抽提試劑盒（TaKaRa公司，中國(guó)）提取Am7和Am10樣品的總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA作為模板進(jìn)行RT-qPCR。按照SYBR Green Dye試劑盒（Vazyme公司，中國(guó)）操作說明書進(jìn)行。反應(yīng)體系20 μL包含：SYBR Green Dye 10 μL，正、反向引物（10.0 μmol·L-1）各1 μL，cDNA模板1 μL，DEPC水7 μL。RT-qPCR反應(yīng)在ABI 7500熒光定量PCR儀（ABI公司，美國(guó)）上進(jìn)行，反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性1 min；95℃變性15 s，60℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸45 s。本試驗(yàn)進(jìn)行3次技術(shù)性重復(fù)。以作為內(nèi)參基因，所選基因的相對(duì)表達(dá)量采用2-??Ct法計(jì)算。

利用總RNA和ame-miR-6001-3p的特異性Stem-loop引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA模板，結(jié)合上下游引物，進(jìn)行常規(guī)PCR反應(yīng)，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。以snRNA U6為內(nèi)參，參照筆者團(tuán)隊(duì)前期已建立的RT-qPCR流程[7,15]對(duì)ame-miR- 6001-3p在Am7和Am10中的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。

通過GraphPad Prism軟件繪制上述DEG及ame- miR-6001-3p的相對(duì)變化量的柱狀圖，利用SPSS軟件計(jì)算組間顯著性。本研究所用相關(guān)引物信息詳見表1。

2 結(jié)果

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控及DEG分析

前期研究中已對(duì)Am7和Am10的lncRNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行了嚴(yán)格質(zhì)控，結(jié)果表明意蜂工蜂中腸樣品的生物學(xué)重復(fù)性且全轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)量良好[10]，可滿足本研究的分析需要。差異分析結(jié)果顯示Am7 vs Am10比較組包含1 038個(gè)DEG，其中上調(diào)和下調(diào)基因的數(shù)量分別為515和523個(gè)（圖1）。

表1 本研究所用引物

圖1 意蜂工蜂中腸發(fā)育過程中DEG的火山圖

2.2 DEG的GO分類

GO分類結(jié)果顯示，DEG共注釋到46個(gè)功能條目，其中上調(diào)和下調(diào)基因可分別注釋到36和44個(gè)功能條目。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞組分包含基因數(shù)比較多的分別是細(xì)胞組件（158個(gè)DEG）、細(xì)胞（158個(gè)DEG）、細(xì)胞膜（118個(gè)DEG）、細(xì)胞膜組件（114個(gè)DEG）和細(xì)胞器（111個(gè)DEG）；分子功能包含基因數(shù)比較多的分別是結(jié)合（350個(gè)DEG）、催化活性（258個(gè)DEG）、轉(zhuǎn)運(yùn)子活性（59個(gè)DEG）、分子傳感器活性（29個(gè)DEG）和分子功能調(diào)節(jié)器（28個(gè)DEG）；生物學(xué)進(jìn)程包含基因數(shù)比較多的分別是細(xì)胞進(jìn)程（285個(gè)DEG）、代謝進(jìn)程（273個(gè)DEG）、單組織進(jìn)程（240個(gè)DEG）、生物學(xué)調(diào)控（112個(gè)DEG）和定位（95個(gè)DEG）（圖2）。

圖2 意蜂工蜂中腸發(fā)育過程中DEG的GO分類

2.3 DEG的KEGG代謝通路富集分析

KEGG代謝通路富集分析結(jié)果顯示，DEG共富集在260條代謝通路。其中，AMPK信號(hào)通路（20個(gè)DEG）、PI3K-Akt信號(hào)通路（18個(gè)DEG）、內(nèi)吞作用（15個(gè)DEG）、Hippo信號(hào)通路（14個(gè)DEG）、泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)水解（14個(gè)DEG）、胰島素信號(hào)通路（12個(gè)DEG）、磷脂酰肌醇信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)（12個(gè)DEG）、Wnt信號(hào)通路（12個(gè)DEG）、磷脂酶D信號(hào)通路（11個(gè)DEG）、鞘脂信號(hào)通路（11個(gè)DEG）等通路富集的DEG數(shù)量較多；此外，部分DEG富集于生長(zhǎng)發(fā)育、新陳代謝、免疫防御等相關(guān)通路，包括溶酶體（11個(gè)DEG）、FoxO信號(hào)通路（9個(gè)DEG）、吞噬體（9個(gè)DEG）、cAMP信號(hào)通路（9個(gè)DEG）、磷酸肌醇代謝（8個(gè)DEG）、Hedgehog信號(hào)通路（8個(gè)DEG）、碳代謝（8個(gè)DEG）、mTOR信號(hào)通路（7個(gè)DEG）、氨基糖與核苷糖代謝（6個(gè)DEG）、脂肪酸代謝（6個(gè)DEG）、MAPK信號(hào)通路（6個(gè)DEG）、嘌呤代謝（5個(gè)DEG）、Toll-like受體信號(hào)通路（4個(gè)DEG）。

進(jìn)一步對(duì)富集在AMPK信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、Hippo信號(hào)通路和內(nèi)吞作用上的DEG進(jìn)行表達(dá)量聚類分析，結(jié)果顯示各通路富集的上調(diào)基因數(shù)分別為12、8、13和9個(gè)，均高于下調(diào)基因數(shù)，表明上述4條代謝通路被不同程度的激活（圖3）。

57個(gè)DEG在13條信號(hào)通路（AMPK、P13K-Akt、Wnt、cAMP、FoxO、Hippo、mTOR、Jak-STAT、Toll-like受體、TGF-beta、Notch、MAPK和NF-B）的富集網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，利用Cytoscape軟件進(jìn)行可視化，結(jié)果顯示一個(gè)基因可同時(shí)富集在多條信號(hào)通路（圖4），例如磷脂酰肌醇3-激酶調(diào)節(jié)亞基-類編碼基因（XM_016917733.1和XM_392119.6）富集在7條信號(hào)通路（AMPK、PI3-Akt、cAMP、FoxO、mTOR、Jak-STAT和Toll-like受體）；Ras相關(guān)蛋白rac1亞型編碼基因（TCONS_00021690和TCONS_00038549）富集在5條信號(hào)通路（P13K-Akt、cAMP（NF-B、AMPK）、Toll-like受體、Wnt、MAPK）（圖4）；Smad（mothers against decapentaplegic homolog）3亞型編碼基因（TCONS_00001946）與4條信號(hào)通路（Wnt、FoxO、Hippo和TGF-beta）存在富集關(guān)系；類胰島素樣受體編碼基因（XM_016918001.1）、mTOR的調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白編碼基因（TCONS_00038733）、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶編碼基因（XM_006560464.2）等8個(gè)DEG均與3條信號(hào)通路存在富集關(guān)系。

利用TargetFinder軟件對(duì)ame-miR-6001-3p與本研究中的DEG進(jìn)行靶向關(guān)系預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)ame-miR-6001-3p可靶向結(jié)合98個(gè)DEG，其中上調(diào)基因54個(gè)，下調(diào)基因44個(gè)（圖5）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，ame-miR-6001-3p靶向結(jié)合的上調(diào)基因富集在新陳代謝途徑（8個(gè)上調(diào)基因）、磷酸肌醇代謝（2個(gè)上調(diào)基因）、胰島素信號(hào)通路（2個(gè)上調(diào)基因）、Hippo信號(hào)通路（2個(gè)上調(diào)基因）、谷胱甘肽代謝（1個(gè)上調(diào)基因）、氧化磷酸化（1個(gè)上調(diào)基因）、鈣離子信號(hào)通路（1個(gè)上調(diào)基因）、cAMP信號(hào)通路（1個(gè)上調(diào)基因）、FoxO信號(hào)通路（1個(gè)上調(diào)基因）、AMPK信號(hào)通路（1個(gè)上調(diào)基因）和PI3K-Akt信號(hào)通路（1個(gè)上調(diào)基因）等43條代謝通路；靶向結(jié)合的下調(diào)基因富集在Hippo信號(hào)通路（3個(gè)下調(diào)基因）、新陳代謝途徑（3個(gè)下調(diào)基因）、谷胱甘肽代謝（1個(gè)下調(diào)基因）和花生四烯酸代謝（1個(gè)下調(diào)基因）等20條代謝通路。

2.4 DEG及ame-miR-6001-3p的驗(yàn)證

利用RT-qPCR對(duì)隨機(jī)選擇的3個(gè)上調(diào)基因和3個(gè)下調(diào)基因進(jìn)行表達(dá)量檢測(cè)，結(jié)果顯示上述6個(gè)DEG與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中相應(yīng)的基因表達(dá)量變化趨勢(shì)一致（圖6-A—F），證明了本研究中基因差異表達(dá)情況真實(shí)可靠。

此外，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示ame-miR-6001-3p在Am7和Am10內(nèi)均有表達(dá)（圖6-G）；RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示ame-miR-6001-3p在Am10中的相對(duì)表達(dá)量較其在Am7中的相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)（= 0.0003）（圖6-H）。

3 討論

腸道是蜜蜂吸收消化以及免疫防御的主要場(chǎng)所[16-17]，腸道的發(fā)育情況及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)共同影響著不同蟲態(tài)蜜蜂的正常生命活動(dòng)。前期研究中，筆者團(tuán)隊(duì)對(duì)意蜂幼蟲腸道發(fā)育及響應(yīng)蜜蜂球囊菌（）脅迫的mRNA和miRNA應(yīng)答進(jìn)行了全面細(xì)致的組學(xué)研究[7,15,18-19]；也分別在lncRNA和circRNA組學(xué)層面探究了意蜂工蜂中腸的發(fā)育機(jī)理[10-11]?；谇捌谝勋@得的意蜂工蜂中腸的全轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，本研究對(duì)意蜂工蜂中腸發(fā)育過程的DEG及其潛在作用，以及融合DEG與ame-miR-6001-3p的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行深入分析，發(fā)現(xiàn)Am7 vs Am10比較組的上調(diào)基因和下調(diào)基因數(shù)分別為515和523個(gè)，其中分別有285、273和258個(gè)DEG涉及細(xì)胞進(jìn)程、代謝進(jìn)程和催化活性等功能條目，分別有13、8、8、6、6和5個(gè)DEG富集在氧化磷酸化、磷酸肌醇代謝、碳代謝、氨基糖與核苷酸糖代謝、脂肪酸代謝和嘌呤代謝等能量和物質(zhì)代謝通路，說明意蜂工蜂中腸發(fā)育過程伴隨著較為旺盛細(xì)胞生命與新陳代謝活動(dòng)。

3.1 DEG通過參與復(fù)雜的信號(hào)通路cross-talk影響意蜂工蜂中腸的發(fā)育和免疫

昆蟲體內(nèi)具有高度復(fù)雜的信號(hào)通路，同一基因可能涉及多條信號(hào)通路（圖4）。有研究表明，TGF-beta信號(hào)通路主要參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、組織分化和免疫防御等生物學(xué)過程，并能與Wnt、FoxO、Hippo、MAPK、Notch等信號(hào)通路共同作用，影響昆蟲色素沉淀和附肢發(fā)育[20]，蜜蜂幼蟲的腸道發(fā)育[7]，以及調(diào)控蜂王的卵巢激活和產(chǎn)卵活動(dòng)[21]等。本研究中，分別有14、12、9、6、3、2個(gè)DEG富集在Hippo、Wnt、FoxO、MAPK、TGF-beta、Notch信號(hào)通路，其中SMAD3亞型編碼基因（TCONS_00001946）顯著下調(diào)表達(dá)（=0.0489，log2fold change=-7.1）并同時(shí)富集在TGF-beta、Wnt、Hippo和FoxO 4條信號(hào)通路。寧越等[22]研究發(fā)現(xiàn)，SMAD1可正向調(diào)控秦川牛（）原代成肌細(xì)胞的分化。SMAD轉(zhuǎn)導(dǎo)因子位于TGF-beta通路的下游，在果蠅幼蟲發(fā)育過程中Activin/TGF-beta通路可通過SMAD2促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)[23]。因此，推測(cè)SMAD3亞型編碼基因通過TGF-beta信號(hào)通路影響細(xì)胞的增殖和分化，進(jìn)而調(diào)控意蜂工蜂中腸的發(fā)育過程。AMPK信號(hào)通路作為一種高度保守的細(xì)胞能量調(diào)節(jié)器，在維持細(xì)胞內(nèi)能量平衡方面發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，并可通過介導(dǎo)NF-B信號(hào)通路進(jìn)而抑制具有調(diào)節(jié)昆蟲蛻皮激素分泌、海藻糖代謝及組織發(fā)育等功能的胰島素信號(hào)通路的活躍程度[24-25]。本研究中，絲裂原活化蛋白激酶亞型編碼基因（TCONS_00038549）顯著下調(diào)表達(dá)（=0.0002，log2fold change=-7.3）且同時(shí)富集在AMPK和NF-B信號(hào)通路；類胰島素受體樣編碼基因（XM_016918001.1和XM_016918002.1）顯著上調(diào)（=0.0004，log2fold change=9.2；=0.0031，log2fold change=4.2），并富集在胰島素耐受性信號(hào)通路；此外，還發(fā)現(xiàn)有3個(gè)與海藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)的編碼基因（XM_016916206.1、NM_001113739.1和XM_006565793.2）的表達(dá)水平顯著上調(diào)（=0.0292，log2fold change=10.0；=3.46E-39，log2fold change= 9.5；=0.0233，log2fold change=1.5）。推測(cè)絲裂原活化蛋白激酶亞型編碼基因通過下調(diào)其表達(dá)水平，減輕對(duì)胰島素信號(hào)通路的抑制作用間接增強(qiáng)類胰島素受體樣編碼基因的表達(dá)，從而影響促進(jìn)意蜂工蜂中腸對(duì)海藻糖等能量物質(zhì)的吸收和代謝作用，進(jìn)而影響中腸的發(fā)育過程。

A：AMPK信號(hào)通路AMPK signaling pathway；B：內(nèi)吞作用Endocytosis；C：P13K-Akt信號(hào)通路PI3K-Akt signaling pathway；D：Hippo信號(hào)通路Hippo signaling pathway

六邊形代表信號(hào)通路hexagons indicate signaling pathways；紅色圓形代表上調(diào)基因red circles indicate up-regulated genes；綠色圓形代表下調(diào)基因green circles indicate down-regulated genes；六邊形和圓形的大小代表連接DEG或信號(hào)通路的數(shù)量the size of hexagons and circles indicates the number of DEGs or signaling pathways connected

圖5 意蜂工蜂中腸的DEG與ame-miR-6001-3p的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

圖6 DEG與ame-miR-6001-3p的驗(yàn)證

PI3K-Akt信號(hào)通路作為細(xì)胞內(nèi)重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，通過影響下游多種效應(yīng)分子的活化狀態(tài)，調(diào)節(jié)昆蟲細(xì)胞增殖、組織分化以及個(gè)體發(fā)育等多個(gè)生物學(xué)進(jìn)程[26]。此外，PI3K-Akt和mTOR信號(hào)通路可共同作用，通過加強(qiáng)干擾素刺激基因的翻譯過程激活抗病原免疫應(yīng)激反應(yīng)[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，磷脂酰肌醇3-激酶調(diào)節(jié)亞基-類編碼基因（XM_016917733.1和XM_392119.6）、mTOR的調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白編碼基因（TCONS_00038733）和結(jié)核蛋白亞型編碼基因（XM_016917423.1）4個(gè)DEG同時(shí)富集在PI3K-Akt和mTOR信號(hào)通路，此外，干擾素相關(guān)發(fā)育調(diào)節(jié)因子編碼基因（TCONS_00019888）呈顯著上調(diào)表達(dá)（=0.0033，log2fold change=12.4）。推測(cè)在意蜂工蜂腸道發(fā)育過程中PI3K-Akt和mTOR通路共同作用刺激干擾素相關(guān)基因的表達(dá)，從而激活中腸的抗病原免疫應(yīng)激反應(yīng)，這仍有待于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

昆蟲腸道發(fā)育過程復(fù)雜，伴隨著非編碼RNA和編碼RNA的相互作用[28]。為探究意蜂幼蟲腸道的發(fā)育機(jī)理，筆者團(tuán)隊(duì)利用二代測(cè)序和趨勢(shì)分析初步解析了意蜂幼蟲腸道發(fā)育過程中差異基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)呈顯著上調(diào)趨勢(shì)的DEG廣泛富集在核苷酸代謝、脂代謝、氨基酸代謝等各類新陳代謝通路，以及FoxO、Hippo、mTOR、MAPK、Notch、Wnt、TGF-beta、Hedgehog、Jak-STAT等信號(hào)通路上，表明隨著幼蟲腸道發(fā)育時(shí)間的延長(zhǎng)，與發(fā)育和免疫相關(guān)通路上富集基因的表達(dá)水平逐漸增強(qiáng)[6]。此外，筆者團(tuán)隊(duì)還發(fā)現(xiàn)在意蜂幼蟲腸道發(fā)育過程中，共有560個(gè)miRNA與16 479個(gè)靶mRNA存在靶向結(jié)合關(guān)系，宿主miRNA通過調(diào)控相關(guān)通路及富集基因參與對(duì)腸道發(fā)育和免疫等生命活動(dòng)的調(diào)控[29]。本研究發(fā)現(xiàn)隨著意蜂工蜂中腸發(fā)育時(shí)間的延長(zhǎng)，富集在AMPK、PI3K-Akt、Hippo等免疫和發(fā)育相關(guān)信號(hào)通路上的上調(diào)基因數(shù)均高于下調(diào)基因數(shù)，表明上述通路存在不同程度的激活。綜上，推測(cè)意蜂幼蟲腸道和工蜂中腸隨著發(fā)育歷期的延長(zhǎng)，其內(nèi)部與發(fā)育和免疫相關(guān)的信號(hào)通路及富集基因激活表達(dá)，以適應(yīng)腸道生長(zhǎng)和發(fā)育所需的物質(zhì)能量代謝，并維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)以應(yīng)答外界復(fù)雜環(huán)境。

3.2 意蜂工蜂中腸發(fā)育過程中ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

LncRNA和circRNA可作為ceRNA，通過miRNA應(yīng)答元件競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA，以減輕miRNA對(duì)mRNA的負(fù)調(diào)控作用，間接影響基因的表達(dá)，最終調(diào)節(jié)各類生物進(jìn)程[30]。郭睿等[10-11]曾對(duì)意蜂7和10日齡工蜂中腸發(fā)育過程的lncRNA和circRNA的差異表達(dá)譜及ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行解析，研究結(jié)果顯示這兩種ncRNA均能通過靶向結(jié)合ame-miR-6001-3p、let-7-z和miR-136-x等對(duì)靶mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行間接調(diào)控，經(jīng)比較分析發(fā)現(xiàn)，本研究中的283個(gè)DEG能被112個(gè)DElncRNA靶向的111個(gè)miRNA所調(diào)控，120個(gè)DEG可被141個(gè)DEcircRNA靶向的107個(gè)miRNA所調(diào)控。功能注釋結(jié)果顯示上述DEG參與意蜂工蜂中腸發(fā)育過程中的各類信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞生命活動(dòng)。前期分析結(jié)果顯示lncRNA和circRNA也可分別通過調(diào)節(jié)上下游基因和來源基因的表達(dá)水平，參與意蜂工蜂中腸發(fā)育過程中的TGF-beta、Wnt、Hippo和Notch等信號(hào)通路，以及各類細(xì)胞生命和新陳代謝活動(dòng)。上述結(jié)果表明意蜂工蜂中腸發(fā)育過程伴隨著極其復(fù)雜的分子事件，mRNA、lncRNA和circRNA可通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA形成復(fù)雜的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。前人研究發(fā)現(xiàn)ame-miR-6001-3p在蜜蜂蛻皮激素分泌[8]和級(jí)型分化[9]過程中具有調(diào)控作用。意蜂工蜂中腸發(fā)育過程中分別有29個(gè)顯著性上調(diào)lncRNA，以及14個(gè)顯著性上調(diào)circRNA參與競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合ame-miR-6001- 3p[10-11]。本研究以顯著下調(diào)表達(dá)的ame-miR-6001-3p為介導(dǎo)，構(gòu)建DEG與ame-miR-6001-3p的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)ame-miR-6001-3p靶向結(jié)合54個(gè)上調(diào)基因和44個(gè)下調(diào)基因。根據(jù)ceRNA假說，推測(cè)lncRNA和circRNA通過改變表達(dá)水平影響對(duì)ame-miR-6001-3p的吸附結(jié)合，從而調(diào)節(jié)ame-miR-6001-3p的表達(dá)水平，進(jìn)而部分解除ame-miR-6001-3p對(duì)靶mRNA的調(diào)控。進(jìn)一步對(duì)ame-miR-6001-3p靶向結(jié)合的上調(diào)基因進(jìn)行功能及代謝通路注釋，發(fā)現(xiàn)它們主要涉及胰島素信號(hào)通路（2個(gè)上調(diào)基因）、Hippo信號(hào)通路（2個(gè)上調(diào)基因）、PI3K-Akt信號(hào)通路（1個(gè)上調(diào)基因）等多條信號(hào)通路，以及磷酸肌醇代謝（2個(gè)上調(diào)基因）和谷胱甘肽代謝（1個(gè)上調(diào)基因）等各類代謝途徑。綜上，推測(cè)ceRNA網(wǎng)絡(luò)在意蜂工蜂中腸發(fā)育過程中發(fā)揮廣泛的調(diào)控作用。下一步的工作重點(diǎn)是結(jié)合意蜂工蜂中腸的miRNA組學(xué)數(shù)據(jù)構(gòu)建mRNA-miRNA-lncRNA- circRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步篩選出關(guān)鍵代謝通路、關(guān)鍵基因和關(guān)鍵ncRNA作為候選靶標(biāo)，并通過過表達(dá)和敲減進(jìn)行功能研究。

4 結(jié)論

意蜂工蜂中腸發(fā)育過程中DEG通過參與TGF- beta、Wnt、Hippo、Notch、PI3K-Akt、mTOR、AMPK和NF-B等信號(hào)通路影響中腸的生長(zhǎng)發(fā)育和免疫防御；ceRNA網(wǎng)絡(luò)在中腸發(fā)育中發(fā)揮廣泛的調(diào)控作用；顯著下調(diào)表達(dá)的ame-miR-6001-3p靶向結(jié)合的54個(gè)上調(diào)基因可參與胰島素信號(hào)通路等多條代謝途徑。

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Profiling and Regulation Network of Differentially Expressed Genes During the Development Process ofWorker’s Midgut

DU Yu, ZHOU DingDing, WAN JieQi, LU JiaXuan, FAN XiaoXue, FAN YuanChan, CHEN Heng, XIONG CuiLing, ZHENG YanZhen, FU ZhongMin, XU GuoJun, CHEN DaFu, GUO Rui

(College of Animal Sciences (College of Bee Science), Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002)

【】The whole transcriptome sequencing of7- and 10-day-old workers’ midguts (Am7 and Am10) was previously conducted. In this study, the differential expression profile and regulation network of genes were investigated to reveal the molecular mechanism underlying the midgut development.【】Gene expressions were calculated based on FPKM (fragments per kilobase of transcript per million mapped reads) algorithm, and differentially expressed genes (DEGs) were gained following the standard |log2fold change|≥1 and≤0.05. Target mRNAs of ame-miR-6001-3p were predicted utilizing TargetFinder. Annotations of all DEGs in GO and KEGG databases were performed using related software. In addition, DEGs enriched in 13 signaling pathways including AMPK, P13K-Akt, Wnt, cAMP, FoxO, Hippo, mTOR, Jak-STAT, Toll-like receptor, TGF-beta, Notch, MAPK and NF-B, as well as DEGs targeted by ame-miR-6001-3p were screened out, followed by visualization of enrichment networks and regulation networks with Cytoscape. Finally, Stem loop RT-PCR and RT-qPCR were used to verify the expression and differential expression pattern of ame-miR-6001-3p and DEGs in Am7 and Am10.【】A total of 1 038 DEGs were identified in Am7 vs Am10 comparison group, including 515 up- and 523 down-regulated genes, respectively. These DEGs were associated with cellular process, metabolic process and catalytic activity, and significantly enriched in some material and energy metabolisms such as oxidative phosphorylation, amino sugar and nucleotide sugar metabolisms, fatty acid metabolism and purine metabolism, indicative of the active cellular and metabolic activities. Expression cluster analysis suggested that 20, 18, 15 and 14 DEGs were respectively enriched in AMPK signaling pathway, PI3K-Akt signaling pathway, endocytosis and Hippo signaling pathway. In addition, 57 DEGs were enriched in the aforementioned 13 signaling pathways associated with growth and development as well as immune defense, among them one DEG was enriched in several signaling pathways. Moreover, regulation network analysis showed that 54 up-regulated genes and 44 down-regulated genes were targets of ame-miR-6001-3p, respectively; these up-regulated genes were enriched in 43 pathways including inositol phosphate metabolism, Hippo signaling pathway, glutathione metabolism and insulin signaling pathway, while these down-regulated genes were enriched in 20 pathways including Hippo signaling pathway, metabolic pathways, glutathione metabolism and arachidonic acid metabolism. Moreover, RT-qPCR result showed that the variation trend of six randomly selected DEGs were consistent with that in sequencing data, confirming the reliability of DEGs. Finally, ame-miR-6001-3p was definitely expressed and significantly down-regulated in Am10.【】In this work, the expression pattern of DEGs and the regulation network between DEGs and ame-miR-6001-3p as well as the potential role of DEGs during the developmental process ofworker’s midgut were deeply analyzed. The results revealed that the DEGs may participate in various signaling pathways including TGF-beta, Wnt, Hippo, Notch, PI3K-Akt, mTOR, AMPK, NF-B signaling pathways, thus affecting the growth and development as well as immune defense of the midgut; DEGs were likely to regulate several signaling pathways such as insulin signaling pathway during the midgut development via formation regulation networks with significantly down-regulated ame-miR-6001-3p.

; midgut; development; differentially expressed gene (DEG); competitive endogenous RNA; regulation network

10.3864/j.issn.0578-1752.2020.01.019

2019-07-09；

2019-09-02

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金（CARS-44-KXJ7）、福建省自然科學(xué)基金（2018J05042）、福建省教育廳中青年教師教育科研項(xiàng)目（JAT170158）、福建農(nóng)林大學(xué)杰出青年科研人才計(jì)劃（xjq201814）、福建農(nóng)林大學(xué)科技創(chuàng)新專項(xiàng)基金（CXZX2017342，CXZX2017343）、福建省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃（3165602032，3155006018）

杜宇，E-mail：m18505700830@163.com。周丁丁，E-mail：ZDD03569981@163.com。杜宇和周丁丁為同等貢獻(xiàn)作者。通信作者郭睿，E-mail：ruiguo@fafu.edu.cn

（責(zé)任編輯 岳梅）