禾生指葡孢霉的遺傳多樣性及對苗期青稞的致病性

陳琳藺瑞明王鳳濤龐云星李雪趙愛平張艷霞張金玲李文興何蘇琴馮晶李赟文才藝徐世昌

禾生指葡孢霉的遺傳多樣性及對苗期青稞的致病性

陳琳1，藺瑞明1，王鳳濤1，龐云星1，李雪1，趙愛平1，張艷霞2，張金玲1，3，李文興4，何蘇琴5，馮晶1，李赟1，6，文才藝6，徐世昌1

（1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病蟲害生物學(xué)國家重點實驗室，北京 100193；2青海海北藏族自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，青海海北 810299；3西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川綿陽 621010；4西藏日喀則市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，西藏日喀則 857000；5甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，蘭州 730070；6河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，鄭州 450001）

在青藏高原及周邊高海拔地區(qū)，青稞是當(dāng)?shù)匚ㄒ坏男『坦阮惣Z食作物，也是主要飼草來源。穗腐病是近年來僅在青藏高原青稞種植區(qū)發(fā)現(xiàn)的一種新真菌病害，病原菌為禾生指葡孢霉（），它能侵染多種麥類作物及禾本科雜草，給青稞安全生產(chǎn)帶來嚴(yán)重的挑戰(zhàn)。【】研究禾生指葡孢霉遺傳多樣性、系統(tǒng)進(jìn)化以及對寄主種子萌發(fā)的影響，揭示該病原菌的流行傳播、與寄主植物互作關(guān)系以及初侵染菌源，為病害防治提供參考。從病害流行區(qū)采集病株標(biāo)本，并從典型病穗組織分離禾生指葡孢霉菌株27個，依據(jù)無性世代形態(tài)特征加以鑒定，分離獲得菌株的單孢培養(yǎng)物，提取基因組DNA。利用SRAP分子標(biāo)記分析禾生指葡孢霉的全基因組多態(tài)性，獲得菌株特異性分子標(biāo)記；利用LSU和保守遺傳位點比較禾生指葡孢霉與其近緣種屬的進(jìn)化關(guān)系；將禾生指葡孢霉分生孢子懸浮液與未萌發(fā)或發(fā)芽后的青稞種子共培養(yǎng)，分析其對青稞種子萌發(fā)及幼苗的影響。選用14對SRAP引物組合進(jìn)行穗腐菌遺傳多樣性分析，平均一對引物擴(kuò)增產(chǎn)生90個多態(tài)性條帶；平均每個穗腐病菌株1.4個特異分子性標(biāo)記，分離自小麥的菌株Z 13008特異性標(biāo)記最多（7個），而對照菌株禾谷鐮孢（）具有20個特異性標(biāo)記。禾生指葡孢霉的地域分布與其遺傳多樣性缺乏明顯相關(guān)性。在鑒定的菌株中，僅有分離自小麥（Z 13008）、黑麥（Z 13024）和2個分離自青稞的菌株（Z 13013和Z 13006）的遺傳多樣性與其他菌株差異較大，說明病原菌群體的遺傳變異水平較低。利用20個分子標(biāo)記編制DNA指紋二叉式分類檢索表，可鑒定21個禾指葡孢霉菌株。系統(tǒng)進(jìn)化分析揭示禾生指葡孢霉與叢赤殼屬真菌遺傳距離較近。青稞種子萌發(fā)前接種處理對種子萌發(fā)、幼苗生長均無明顯的抑制作用，在萌發(fā)后共培養(yǎng)處理能明顯抑制幼苗根系生長，導(dǎo)致根系變?yōu)闇\褐色，但對幼苗植株生長無明顯影響。與近緣種禾谷鐮孢相比，禾生指葡孢霉群體內(nèi)基因組DNA多態(tài)性較低，而且其遺傳變異與寄主種類密切相關(guān)。禾生指葡孢霉致病性較弱，對青稞種子萌發(fā)和幼苗生長無明顯的抑制作用。

大麥；青稞；禾生指葡孢霉；穗腐??；SRAP；遺傳多樣性；指紋檢索表

0 引言

【研究意義】大麥（）種植分布區(qū)域非常廣泛，是世界上第四大禾谷類作物（http:// faostat.fao.org）。根據(jù)播種面積和產(chǎn)量，大麥也是我國第四大禾谷類作物。大麥?zhǔn)怯酗篼湥ㄓ址Q皮大麥）和裸大麥的總稱，在我國青藏高原地區(qū)裸大麥被稱作青稞（var.）。青稞是青藏高原及周邊高海拔地區(qū)的唯一的小禾谷類糧食作物，也是主要飼草來源。青稞在我國各生態(tài)區(qū)域均有不同規(guī)模種植，但集中分布于青海全省、西藏自治區(qū)、四川西北部、甘肅甘南州和云南西北部如迪慶等青藏高原及其周邊高海拔冷涼地帶。穗腐病是近年來在青藏高原及其周邊麥區(qū)發(fā)現(xiàn)的一種嚴(yán)重危害青稞穗部的真菌新病害，給該地區(qū)青稞安全生產(chǎn)帶來嚴(yán)重的挑戰(zhàn)。研究穗腐病病原菌群體的遺傳多樣性、系統(tǒng)進(jìn)化以及對寄主種子萌發(fā)及幼苗生長的影響，可以揭示病原菌的流行傳播、與寄主植物互作關(guān)系以及初侵染菌源，為病害防治提供依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】2009年在甘肅省甘南藏族自治州局部青稞地塊發(fā)現(xiàn)了穗腐病[1]，也稱鞘腐病，其病原菌無性世代鑒定為禾生指葡孢霉（）[2]。2012年筆者在青海省主要青稞種植區(qū)域也發(fā)現(xiàn)了這種病害。根據(jù)筆者2011—2018年系統(tǒng)跟蹤調(diào)查結(jié)果，目前已在西藏日喀則、青海全省、甘肅甘南州、四川甘孜州青稞種植區(qū)域發(fā)現(xiàn)了穗腐病，危害程度和流行區(qū)域總體呈不斷加重和擴(kuò)散蔓延態(tài)勢。在病害流行區(qū)，一般青稞田塊病穗率為1%—5%，局部病穗率高達(dá)10%—15%。同時發(fā)現(xiàn)，青藏高原青稞田主要禾本科雜草之一野燕麥（）是該病原菌另一個重要自然寄主植物。此外，已發(fā)現(xiàn)禾谷類作物如普通小麥（）、栽培燕麥（.）、黑麥（）以及其他禾本科雜草如冰草（）也是其自然寄主。復(fù)雜的寄主范圍給研究病害傳播途徑和制定防治技術(shù)帶來挑戰(zhàn)?！颈狙芯壳腥朦c】禾生指葡孢霉引起的穗腐病對青稞等小禾谷類作物造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，但對該病原菌的遺傳變異以及對寄主植物種子萌發(fā)、幼苗生長的影響等情況了解甚少。【擬解決的關(guān)鍵問題】對禾生指葡孢霉菌株進(jìn)行分離純化培養(yǎng)，采用SRAP技術(shù)分析其遺傳多樣性，揭示禾生指葡孢霉遺傳變異和不同病害流行區(qū)域病原菌群體間的關(guān)系，進(jìn)一步分析病原菌群體遺傳特征和不同地區(qū)間病害傳播及流行規(guī)律；利用共培養(yǎng)接種試驗分析禾生指葡孢霉對青稞種子萌發(fā)及幼苗生長的影響，為明確穗腐病初侵染菌源及制定防治策略提供依據(jù)。

1 材料與方法

試驗于2017—2019年在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所完成。

1.1 病原菌材料

采集新鮮典型標(biāo)本共27份，包括3份黑麥、8份野燕麥、14份青稞、1份小麥病穗和1份青稞麥粒（表1），將病穗標(biāo)本快速脫水干燥后室溫保存，用于病原菌分離；以遺傳距離較近的小麥赤霉病菌——禾谷鐮孢（）作為遺傳多樣性分析的對照菌株。

1.2 病原菌分離純化與鑒定

采用常規(guī)組織分離法對所采集的典型病穗標(biāo)本進(jìn)行病原菌分離與純化[3]。剝開未抽穗病株葉鞘，選取病變穗部麥芒、小穗穗梗或穗軸，切取小塊病樣組織（0.5—1.0 cm），經(jīng)75%乙醇（v/v）消毒3—5 s，在稀釋4倍次氯酸鈉溶液（活性氯含量7.5%）消毒0.5—1 min后，用無菌水漂洗3遍，每次漂洗10 min，然后移至PDA（馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉15 g，蒸餾水定容至1 L）培養(yǎng)基平板上，置于23—25℃恒溫箱中培養(yǎng)3—5 d，在菌落邊緣挑取小塊培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移至另一個PDA培養(yǎng)基平板中進(jìn)行純化培養(yǎng)，培養(yǎng)基內(nèi)放置8—10個無菌濾紙片（1.0 cm×1.0 cm），培養(yǎng)7 d后收菌濾紙片，真空干燥后于-20℃長期保存。為抑制細(xì)菌污染，可以在PDA培養(yǎng)基中添加乳酸（3—5滴/100 ml）。收集純化后的病原菌菌株的分生孢子，采用稀釋法獲得單孢培養(yǎng)物。

1.3 病原菌形態(tài)鑒定

將分離所得單孢菌株置于23—25℃下培養(yǎng)6—7 d，待產(chǎn)孢后于光學(xué)顯微鏡下觀察鑒定病原菌分生孢子和分生孢子梗的形態(tài)特征，同時觀察記錄菌落形態(tài)特征，確定分離獲得菌株為禾生指葡孢霉。

1.4 禾生指葡孢霉對種子萌發(fā)和幼苗根系的影響

分離自青海門源縣青稞禾生指葡孢霉Z 15403-3-1單孢菌株培養(yǎng)6—7 d后收集分生孢子，用無菌水配制1×103、1×105孢子/ml的孢子懸浮液。將青稞品種‘柴青1號’種子先用70%乙醇消毒5 min，然后在稀釋1倍次氯酸鈉溶液（活性氯含量7.5%）消毒30 min，無菌水漂洗3次，每次10 min。將消毒后的種子在23—25℃條件下無菌水中浸泡24 h，去除剩余的水繼續(xù)培養(yǎng)約1 d，待種子萌發(fā)后（即胚根突破種皮）用不同濃度的孢子懸浮液浸泡24 h，然后轉(zhuǎn)移至水瓊脂（0.5%，w/v）平板上，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；或?qū)⑾竞蟮姆N子用滅菌的濾紙吸干多余水分，浸泡在不同濃度的孢子懸浮液24 h，然后轉(zhuǎn)移至水瓊脂（0.5%，w/v）平板上在同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng)。接種共培養(yǎng)溫度為25℃晝/23℃夜，光照時間為16 h·d-1，光照強(qiáng)度為5 000—6 000 lx。每個處理培養(yǎng)3皿，3.0 ml孢子懸浮液浸泡90粒種子，每皿培養(yǎng)30粒種子。發(fā)芽率=（發(fā)芽種子數(shù)/供檢測種子總數(shù)）×100%，出苗率=（長出幼苗種子數(shù)/供檢測種子總數(shù)）×100%。以滅菌水浸泡已消毒的種子作為空白對照處理（Mock）。培養(yǎng)5 d后調(diào)查，采用SPSS Statistics v20（IBM，美國）進(jìn)行方差齊性檢驗和單因素方差分析，采用Duncan’s multiple range test（＜0.05）分析處理間差異顯著性。試驗獨立重復(fù)2次。

1.5 SRAP遺傳多樣性分析

每個菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3皿（直徑9 cm），收集培養(yǎng)7 d的菌絲，CTAB（cetyltrimethylammonium bromide）法提取基因組DNA。檢測DNA濃度及純度，并稀釋至標(biāo)準(zhǔn)工作液50 ng·μL-1備用。選取16條已公布的SRAP標(biāo)準(zhǔn)引物（表2）[4]，由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。以禾生指葡孢霉菌株和禾谷鐮孢對照菌株DNA為模板，進(jìn)行特異PCR引物篩選及遺傳多樣性分析。PCR反應(yīng)體系包括Taq酶（5 U·μl-1）0.2 μl，10×PCR緩沖液2.0 μl，dNTPs 0.8 μl，上游引物和下游引物各1.0 μl，DNA模板2.0 μl，加ddH2O至20.0 μl。SRAP-PCR反應(yīng)體系采用復(fù)性變溫法，反應(yīng)程序設(shè)定為兩個階段：第一階段為94℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，35℃退火1 min，72℃延伸2 min，5次循環(huán)；第二階段為94℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸2 min，35次循環(huán)，72℃延伸5 min，擴(kuò)增產(chǎn)物置于4℃下保存。制備6%聚丙烯酰胺凝膠，電泳分離檢測擴(kuò)增產(chǎn)物[5]。

表1 禾生指葡孢霉菌株來源、寄主種類及分離的病變組織

1.6 進(jìn)化樹分析和DNA指紋檢索表構(gòu)建

以禾生指葡孢霉Z 13005菌株DNA為模板，選用LSU（LRORf：GTACCCGCTGAACTTAAGC，LR5r：ATCCTGAGGGAAACTTC）[6]和（RPB2-f5F：GAYGAYMGWGATCAYTTYGG，Rpb2-7cR：CCCAT RGCTTGYTTRCCCAT）[7]保守基因位點引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別獲得DNA片段克隆到T載體（Takara，大連）中測序。分別以LSU、部分序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中BLAST分析，獲得與禾生指葡孢霉的保守基因具有較高相似性的真菌DNA序列，構(gòu)建進(jìn)化樹。采用MEGA5.05軟件進(jìn)行序列比對處理，NJ（neighbor-joining）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行1 000次Bootstrap檢驗?；赟RAP分析方法獲得的多態(tài)性DNA條帶結(jié)果構(gòu)建禾生指葡孢霉菌株的二叉式分子檢索表，具體方法參考Shan等[8]。

表2 SRAP分析的引物序列

1.7 SRAP數(shù)據(jù)處理

以Marker ?X174Ⅲ酶切產(chǎn)物和DL500 DNAmarker條帶為標(biāo)準(zhǔn)，確定PCR產(chǎn)物片段大?。╞p），同時采用二進(jìn)位制記錄電泳后DNA條帶數(shù)據(jù)，在擴(kuò)增產(chǎn)物相同位點處依據(jù)條帶有和無分別記錄為‘1’和‘0’，用于SRAP遺傳多樣性分析，并利用NTSYS軟件的非加權(quán)組平均法（UPGMA，Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean）進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果

2.1 禾生指葡孢霉分離純化

對27份穗腐病標(biāo)本（表1）進(jìn)行病原菌常規(guī)組織分離，經(jīng)培養(yǎng)菌落形態(tài)和分生孢子及孢子梗形態(tài)特征鑒定，均為目的病原菌的純培養(yǎng)物，同時獲得27個菌株的單孢培養(yǎng)物65份，選用其中21個菌株的單孢培養(yǎng)物進(jìn)行遺傳多樣性分析。

2.2 禾生指葡孢霉對青稞種子萌發(fā)及幼苗生長的影響

將初萌發(fā)的青稞種子與禾生指葡孢霉分生孢子懸浮液共培養(yǎng)24 h，然后在水瓊脂平板上繼續(xù)培養(yǎng)5 d，共培養(yǎng)處理能明顯抑制幼苗根系生長（圖1-A、1-C）。處理后幼苗根系長度與對照（Mock）相比差異顯著（=0.009＜0.05），能造成幼苗根系變?yōu)闇\褐色（圖1-A），而不同濃度孢子懸浮液處理間差異均不顯著；孢子懸浮液處理后出苗率（=0.822＞0.05）和幼苗平均株高（=0.206＞0.05）與對照相比差異不顯著（圖1-C）。另外，將表面消毒的未萌發(fā)種子與禾生指葡孢霉分生孢子懸浮液共培養(yǎng)24 h，在水瓊脂培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)5 d后與對照相比較，共培養(yǎng)處理后種子發(fā)芽率（=0.675＞0.05）和出苗率（=0.992＞0.05）均差異不顯著，青稞幼苗株高（=0.369＞0.05）和幼苗根系長度（=0.203＞0.05）與對照相比也無顯著差異（圖1-D），幼苗生長沒有受到明顯的抑制，無明顯的褪綠或萎蔫癥狀（圖1-B）。

2.3 SRAP引物PCR擴(kuò)增

利用優(yōu)化PCR體系擴(kuò)增反應(yīng)程序進(jìn)行引物篩選，選用14對較高多態(tài)性的特異性引物組合（表3），共獲得具有多態(tài)性DNA條帶1 255條，平均一對SRAP引物能對21個禾生指葡孢霉菌株和1個禾谷鐮孢對照菌株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)生90個條帶，其中Me6-Em5引物組合擴(kuò)增產(chǎn)生的多態(tài)性條帶最多，其次是為Me6-Em10 引物組合。PCR擴(kuò)增DNA片段大小分布于100—700 bp。統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，其中11個禾生指葡孢霉菌株具有1—7個菌株特異性分子標(biāo)記，分離自小麥菌株Z 13008的特異性標(biāo)記最多（7個），其次是分離自黑麥（Z 13024）和野燕麥（Z 13002）菌株具有5個特異性標(biāo)記，而分離自青稞的菌株特異性標(biāo)記較少（1—4個）；未發(fā)現(xiàn)其余10個菌株的特異性標(biāo)記。平均每個禾生指葡孢霉菌株僅有1.4個特異性標(biāo)記，而對照禾谷鐮孢菌株特異性標(biāo)記多達(dá)20個（表4）。

表3 利用14對SRAP引物組合擴(kuò)增禾生指葡孢霉菌株獲得的多態(tài)性DNA條帶

標(biāo)尺Scale bar =1.0 cm

2.4 禾生指葡孢霉的遺傳聚類分析

根據(jù)對不同SRAP引物組合產(chǎn)生的PCR條帶的統(tǒng)計結(jié)果，利用軟件NTSYS pc 2.10對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行非加權(quán)組平均法（UPGMA）聚類分析，根據(jù)遺傳相似系數(shù)（GS）法對禾生指葡孢霉21個菌株及對照禾谷鐮孢菌株遺傳多樣性進(jìn)行聚類（圖2）。對照禾谷鐮孢菌株與禾生指葡孢霉菌株間菌遺傳距離較大，說明SRAP方法可以用于分析禾生指葡孢霉群體中不同菌株間的遺傳多樣性。分析21份禾生指葡孢霉菌株的遺傳距離系數(shù)范圍0.70—0.99，具有一定的多態(tài)性，而與禾谷鐮孢遺傳距離系數(shù)＜0.70。在遺傳距離0.82水平上，可將21個禾生指葡孢霉菌株劃分為4個類群，類群Ⅰ包含17個菌株，來源于甘肅甘南州以及青海省多個地區(qū)，分離自寄主植物青稞和野燕麥，類群Ⅱ包括Z 13008和Z 13013，分別從甘肅甘南州臨潭縣小麥和青?；ブh青稞病穗，類群Ⅲ僅包括分離自甘肅甘南州臨潭縣寄主青稞的菌株Z 13006，而類群Ⅳ僅包括菌株Z 13024，來自青海湟源縣寄主黑麥病穗。類群Ⅰ中17個成員與類群Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ中的4個菌株遺傳背景差異較大。類群Ⅰ中菌株來源地較多樣化，病原菌地域分布與其遺傳多樣性缺乏明顯相關(guān)性，青海與甘肅流行區(qū)間穗腐病原菌交流頻繁。根據(jù)類群Ⅰ菌株的寄主種類，可以確定青稞和野燕麥對病原菌遺傳多樣性的選擇作用較??；但類群Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ中的4個菌株分別分離自小麥（Z 13008）、黑麥（Z 13024）和青稞（Z 13013，Z 13006），其遺傳多樣性與其他菌株差異較大，說明病原菌群體中存在一定程度的遺傳變異，寄主小麥和黑麥可能比青稞和野燕麥對禾生指葡孢霉遺傳變異具有更大的選擇作用。

表4 禾生指葡孢霉菌株特異性SRAP分子標(biāo)記

a分子標(biāo)記以SRAP引物組合及DNA片段大小（bp）表示Markers are indicated by SRAP primer combinations, and the marker size shown as base pairs；b禾谷鐮孢菌株作為對照，其他菌株均為禾生指葡孢霉的單孢培養(yǎng)物The strain of.is used as control, the others are.strains propagated from a single conidium

圖2 基于SRAP遺傳多樣性鑒定及UPGMA方法分析21個禾生指葡孢霉菌株及對照禾谷鐮孢菌株的遺傳變異

2.5 DNA指紋檢索表的制定

從14對多態(tài)性SRAP引物組合中選擇9對引物組合（Me1-Em2、Me3-Em2、Me3-Em5、Me4-Em2、Me6-Em5、Me6-Em10、Me7-Em4、Me7-Em6和Me7-Em9）擴(kuò)增所得的20個分子標(biāo)記，編制21個禾生指葡孢霉菌株的DNA指紋二叉式分類檢索表，根據(jù)檢索表可鑒定21個禾生指葡孢霉菌株（表5）。

2.6 禾生指葡孢霉的進(jìn)化關(guān)系

以核糖體大亞基（LSU）和RNA聚合酶Ⅱ第2大亞基（）基因的兩個保守位點序列（LSU+）構(gòu)建進(jìn)化樹，作為外群對照菌株。禾生指葡孢霉與肉座菌目（Hypocreales）叢赤殼科（Nectriaceae）的叢赤殼屬（sp.）真菌遺傳距離最近，其次是鐮孢菌屬（sp.）真菌，而與肉座菌科（Hypocreaceae）真菌（如sp.、sp.和sp.）遺傳距離較遠(yuǎn)（圖3）。此外，利用其他保守位點序列組合（LSU+TUB和RPB2+TUB）構(gòu)建進(jìn)化樹，也驗證了禾生指葡孢霉與叢赤殼屬真菌遺傳距離較近。

3 討論

3.1 禾生指葡孢霉群體的遺傳多樣性及其系統(tǒng)發(fā)育

依據(jù)ITS1-5.8S-ITS2序列分析結(jié)果，禾生指葡孢霉與肉座菌目叢赤殼科一些屬種（如sp.、和.）的遺傳距離比與其他屬種真菌的遺傳距離近[2]。在此基礎(chǔ)上，利用兩個保守基因位點（LSU+）序列組合進(jìn)一步構(gòu)建精簡進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)禾生指葡孢霉與叢赤殼屬真菌遺傳距離最近，其次是鐮孢菌屬真菌（圖3）。因此，可以初步確定穗腐病原菌屬于叢赤殼科，該結(jié)果還需要從有性世代的形態(tài)特征以及多個保守基因位點的系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建分析加以驗證。SRAP標(biāo)記技術(shù)非常適合用于生物遺傳多樣性的分析和基因標(biāo)記定位研究[9-10]，如用于金針菇[11]、西葫蘆[12]種質(zhì)資源鑒定以及遺傳圖譜構(gòu)建[4,13-14]。本研究中采用SRAP技術(shù)分析得出21個禾生指葡孢霉菌株的遺傳距離相關(guān)系數(shù)范圍為0.70—0.99，群體內(nèi)具有一定水平的遺傳變異，但與禾谷鐮孢遺傳背景差異較大（圖2），進(jìn)一步驗證了利用保守基因位點構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹的分析結(jié)果。僅獲得11個禾生指葡孢霉菌株的特異性分子標(biāo)記，平均每個菌株僅有1.4個特異性標(biāo)記，而對照禾谷鐮孢菌株特異性標(biāo)記多達(dá)20個（表4），說明禾生指葡孢霉群體中遺傳多樣性水平明顯低于作為多種禾谷類作物重要病原真菌的禾谷鐮孢。

菌株LSU和Rpb2序列GenBank序列號GenBank accession numbers of LSU and Rpb2 sequences of fungal species：Cladobotryum sp.（MH871991，F(xiàn)N868654）；Hypomyces rosellus（FN859443，EU710774）；Trichoderma sp.（MH333256，F(xiàn)J860531）；Fusarium solani（AY097317，AB986567）；Nectria sp.（JN939838，HM534886）；Cladosporium sphaerospermum（KY873376，KJ443161）；D. graminicola（菌株Z 13005，本研究測序結(jié)果strain Z 13005, sequences in this study）

3.2 禾生指葡孢霉的分子標(biāo)記

類似于植物分類檢索表，基于基因組DNA分子標(biāo)記編制的二分式檢索表首先用于區(qū)別蘿卜品種[15]，該方法已用于構(gòu)建花椰菜品種、野生鷹嘴豆及窄葉羽扇扁豆的指紋圖譜[8,16-17]，利用MFLP分子標(biāo)記編制了遺傳多樣性較低的栽培鷹嘴豆品種分子檢索表[18]。在本研究中利用20個SRAP分子標(biāo)記編制了21個禾生指葡孢霉菌株的分子檢索表（表5），便于禾生指葡孢霉菌株的分子鑒定。

表5 利用SRAP分子標(biāo)記構(gòu)建禾生指葡孢霉及對照禾谷鐮孢菌株二叉式分類檢索表

a分子標(biāo)記以SRAP引物組合及DNA片段大?。╞p）表示Markers are expressed as SRAP primer combinations and marker size in base pairs；bP：有分子標(biāo)記presence；A：無分子標(biāo)記Absence；c菌株號1代表對照禾谷鐮孢菌株，其他菌株號分別代表表1中列出的菌株The strain number 1 represents.and other strain numbers represent the strains listed in Table 1, respectively. 2: Z 13003-1; 3: Z 13003; 4: Z 13002; 5: Z 13008; 6: Z 13006; 7: Z 13004; 8: Z 13009; 9: Z 13027; 10: Z 13010; 11: Z 13011; 12: Z 13012; 13: Z 13013; 14: Z 13019; 15: Z 13020; 16: Z 13020-1; 17: Z 13021; 18: Z 13023; 19: Z 13022; 20: Z 13024; 21: Z 13015; 22: Z 13017

3.3 寄主植物對病原菌遺傳變異的選擇

在青藏高原及周邊麥區(qū)發(fā)生的禾谷類作物穗腐病的地域分布具有一定的局限性，目前僅在青海各州、甘肅甘南高海拔地區(qū)以及西藏日喀則青稞、燕麥以及野燕麥、冰草等禾本科雜草上發(fā)現(xiàn)了該病害（表1）。在自然條件下禾生指葡孢霉僅侵染寄主幼穗引起穗腐病，同時侵染包裹幼穗的旗葉葉鞘或倒二葉葉鞘形成梭形褐色病斑，而不能侵染葉片組織或從葉鞘外表面直接侵入幼穗。因此該病原菌的致病性較弱，僅適合在氣候冷涼的青藏高原獨特生態(tài)環(huán)境中進(jìn)化成為青稞和燕麥等麥類作物及多種禾本科雜草的病原菌。病原菌在寄主-病原菌互作識別、相互適應(yīng)過程中建立寄生關(guān)系，二者協(xié)同進(jìn)化能導(dǎo)致寄主抗病等位基因及病原菌毒性等位基因和遺傳結(jié)構(gòu)的高度多樣化[19-21]。因此，寄主對病原菌基因型具有關(guān)鍵的選擇作用，也是維持病原菌遺傳多樣性及致病性變異的一種機(jī)制，如小眼夜蛾核多角體病毒（nucleopolyhedrovirus，PaflNPV）能侵染多種昆蟲寄主，從而改變了田間病毒遺傳多樣性[22]；膠孢炭疽菌（）遺傳多樣性及其致病性變異才能適應(yīng)寄主毛薯（）數(shù)量抗病性[23]。在本研究中，禾生指葡孢霉的最初主要寄主可能是青藏高原普遍分布的野燕麥及本地唯一的麥類糧食作物青稞，二者對病原菌的遺傳變異具有相似的選擇作用，而在自然界中野燕麥可能是穗腐病流行與病原菌傳播途徑中的重要‘橋梁’寄主。與青稞不同，小麥和黑麥僅在低海拔或溫度較高的局部區(qū)域內(nèi)種植，要克服小麥和黑麥寄主作物抗病性及逆境脅迫，禾生指葡孢霉發(fā)生了更明顯的遺傳變異（圖2）。另外，依據(jù)穗腐病自然發(fā)生危害情況調(diào)查結(jié)果，常見的主要危害對象是青稞、栽培燕麥和野燕麥，而采集到的小麥、黑麥及冰草病害標(biāo)本較少。因此，青稞和野燕麥?zhǔn)呛躺钙湘呙垢m宜的寄主植物，然后寄主范圍逐漸擴(kuò)大。因標(biāo)本來源不均勻，還需要更多菌株驗證不同寄主對禾生指葡孢霉遺傳變異的選擇效應(yīng)的差異。同時，在分離自青稞和野燕麥的菌株中，個別菌株與其他菌株的遺傳相似性存在較大的變異，如Z 13013和Z 13006。甘肅甘南州和青海省是相對獨立的穗腐病流行區(qū)域，但在遺傳多樣性聚類分析中菌株地域分布與其遺傳多樣性缺乏明顯相關(guān)性（圖2）。因此，青藏高原地區(qū)禾生指葡孢霉受到相似的環(huán)境選擇壓力，病原菌可能隨帶菌種子等病原載體在不同區(qū)域傳播擴(kuò)散，導(dǎo)致來自地理距離較近的甘肅和青海禾生指葡孢霉菌株的遺傳變異不具有明顯的地域分布特征。

3.4 禾生指葡孢霉與近緣屬種病原真菌的致病性比較

叢赤殼科包括150個屬（http://www.mycobank. org/），多數(shù)是腐生菌，其中一些屬種是重要的農(nóng)作物病原真菌。叢赤殼屬真菌能侵染多種作物或樹木，如（異名）的無性世代是爪哇鐮孢（），侵染番茄引起莖腐病[24]；.（異名，.）的無性世代為，能侵染蘋果等多種果樹引起潰瘍病[25]；赤霉屬（sp.）的無性世代大多屬于鐮孢屬，如.（無性世代）能侵染多種禾本科植物，引起麥類作物赤霉病[26]及玉米苗枯、根腐、莖基腐和穗腐等病害[27]；麥類雪腐菌（，異名，.）的無性世代為雪腐鐮孢（），能造成麥類作物雪腐病和赤霉病[28]。禾生指葡孢霉作為叢赤殼科中新成員，目前發(fā)現(xiàn)該病原菌僅危害麥類作物及禾本科雜草，引起穗腐病，寄生能力較弱，與叢赤殼科其他植物病原菌的營養(yǎng)方式和侵染特點高度相似。

3.5 禾生指葡孢霉對青稞種子萌發(fā)和幼苗生長的影響

被病原菌侵染的種子是重要的初侵染菌源，降低了種子發(fā)芽率和種子活力，引起苗期病害。例如麥根腐平臍蠕孢（）或spp.侵染大麥或小麥灌漿期種子引起黑胚病[29]，能嚴(yán)重降低種子發(fā)芽率[30]。麥根腐平臍蠕孢、黃色鐮孢（）和禾谷鐮孢侵染大麥根系和幼苗引起普通根腐病和立枯病[29]。大麥條紋病菌（）引起的大麥條紋病是典型的種傳病害，種子帶菌幾乎不影響種子萌發(fā)及出苗[29]。然而禾生指葡孢霉僅侵染麥類作物及野燕麥等禾本科雜草植物穗部，因此攜帶病原菌的種子是重要的初侵染源之一，也是該病害跨區(qū)域傳播的主要途徑。利用禾生指葡孢霉分生孢子懸浮液與已發(fā)芽或未發(fā)芽的青稞種子進(jìn)行共培養(yǎng)試驗（圖1），結(jié)果表明其對青稞種子萌發(fā)及對幼苗植株生長無明顯影響，僅高濃度的孢子懸浮液與已發(fā)芽的青稞種子共培養(yǎng)24 h能明顯抑制幼苗根系生長，根系顏色變?yōu)闇\褐色，對幼嫩根系能產(chǎn)生致病作用。因此禾生指葡孢霉對青稞種子萌發(fā)以及幼苗生長期間的致病作用微弱，它是一種弱致病性植物病原真菌，種子攜帶的病原菌不能對青稞種子萌發(fā)和幼苗正常生長產(chǎn)生明顯的致病作用。而該病原菌可能在青稞或其他禾本科雜草寄主根部或表層土壤中植物枯殘組織上生長擴(kuò)繁，為在青稞生育后期侵染穗部提供初始菌源。另外，在青稞收獲時節(jié)，青稞或其他禾本科雜草的病穗組織極易破碎而遺落在田間地表或表層土壤中，這些病殘體也能在青稞生育中后期產(chǎn)生和積累大量的分生孢子，是穗腐病的主要初侵染菌源。

4 結(jié)論

由禾生指葡孢霉侵染麥類作物以及多種禾本科雜草的幼穗引起穗腐病，它是僅在我國青藏高原及其周邊的部分青稞種植區(qū)域發(fā)生的一種真菌新病害。禾生指葡孢霉是弱致病性病原菌，對青稞種子萌發(fā)及幼苗生長無明顯的抑制作用，其與叢赤殼屬真菌遺傳距離較近，是叢赤殼科新成員。禾生指葡孢霉基因組多態(tài)性較低，其遺傳變異與寄主種類及其所處的環(huán)境條件密切相關(guān)。

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Genetic Diversity ofand its Pathogenicity tovar.Seedlings

CHEN Lin1, LIN RuiMing1, WANG FengTao1, PANG YunXing1, Li Xue1, ZHAO AiPing1, ZHANG YanXia2, ZHANG JinLing1,3, LI WenXing4, HE SuQin5, FENG Jing1, LI Yun1, 6, WEN CaiYi6, XU ShiChang1

(1State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193;2Institute of Agricultural Sciences, Haibei Tibetan Autonomous Prefecture of Qinghai, Haibei 810299, Qinghai;3School of Life Science and Engineering, Southwest University of Science and Technology, Mianyang 621010, Sichuan;4Shigatse Institute of Agricultural Sciences of Tibet, Shigatse 857000, Tibet;5Institute of Plant Protection, Gansu Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou 730070;6College of Plant Protection, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450001)

【】In the high-latitude agricultural areas of Qinghai-Tibet Plateau and its peripheral regions, hulless or naked barley (var.) is the only small grain cereal crop in the local area, and it is also the major forage. Dactylobotrys spike blight, caused by, is a new fungal disease only found in the hulless barley growing areas in Qinghai-Tibet Plateau in recent years, which can attack several triticeae crops and cereal grasses and make a great challenge to security of hulless barley production.【】The objective of this study is to research the genetic diversity, systemic evolution ofthe fungal pathogen of.and its effects on the host seed germination, reveal the pathogen epidemics and spread ways, host-pathogen interrelationship and the primary inoculum, and to provide valuable information for disease control.【】The diseased plant samples were collected from the disease epidemic areas, and 27 strains were isolated from the typical infected host spike tissues. After identification based on its biological traits of anamorph, the single-conidium strains were cultivated and used for genomic DNA extraction. The whole genomic diversity was evaluated with SRAP markers and strain-specific markers were developed. The evolution relationship between.and its related genera or species was analyzed using the two conserved loci of LSUand. The conidium suspension was co-cultivated with the germinated or ungerminated hulless barely seeds, and its effect on barley seed germination and seedling growth of hulless barely was analyzed.【】Fourteen SRAP primer combinations were selected to detect genetic diversity of.strains, and on average, 90 polymorphic DNA bands were produced per primer combination. For.strains, only 1.4 strain-specific markers were developed averagely. The strain of Z 13008 derived from common wheat possessed the most 7 SRAP markers. Forused as a control strain, 20 specific markers were identified. It was confirmed that there is no close relationship between strain origins of.and their genetic diversity. Among the identified strains, only those like Z 13008 from common wheat, Z 13024 from rye and another two (Z 13013 and Z 13006) from hulless barley showed higher differences in genetic diversity compared with the others, indicating that the genetic variation level of.population is low. Besides, it is feasible to characterize the 21.strains with a DNA dichotomous fingerprinting key constructed with 20 SRAP markers.is genetically closely related to the fungal species of genusthrough phylogenetic analysis. When inoculating seeds with conidial suspensions before germination, the pathogen had no significant suppression on seed germination and growth of seedlings and their roots. While it could infect and restrain seedling root growth when co-cultivating the germinated seeds with conidial suspensions, and resulted in the infected young roots changing into light brown color, but had no significant effect on seeding growth.【】.showed lower genetic diversity compared with its relative species of., and its genetic variation is closely related to its host plant species.the pathogenicity of the pathogen is weak, and it has no obvious inhibiting effect on the germination and seedling growth of hulless barley.

;var.;; Dactylobotrysspike blight; SRAP; genetic diversity; fingerprinting key

10.3864/j.issn.0578-1752.2020.01.020

2019-06-18；

2019-08-16

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項（CARS-05）

陳琳，E-mail：lin170521@163.com。通信作者藺瑞明，E-mail：linruiming@caas.cn

（責(zé)任編輯 岳梅）