黃瓜ERF基因家族鑒定及其在雌花芽分化中的表達(dá)分析

潘健，溫海帆，何歡樂，連紅莉，王剛，潘俊松，蔡潤

黃瓜ERF基因家族鑒定及其在雌花芽分化中的表達(dá)分析

潘健，溫海帆，何歡樂，連紅莉，王剛，潘俊松，蔡潤

（上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海 200240）

【】通過以黃瓜9930_V2版本基因組為參照進(jìn)行生物信息學(xué)分析，對ERF基因家族在基因組中的數(shù)量、結(jié)構(gòu)以及表達(dá)特征進(jìn)行分析，為研究ERF轉(zhuǎn)錄因子在黃瓜雌花分化與發(fā)育中的作用提供數(shù)據(jù)支持。根據(jù)已報(bào)道的擬南芥，利用黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫中9930_V2版本基因組進(jìn)行BLAST比對，通過MEGA、MEME、TBtools、ExPASy等工具進(jìn)行生物信息學(xué)分析。采用qRT-PCR方法檢測不同性型黃瓜材料、雌花發(fā)育初期不同階段中ERF基因家族成員的表達(dá)水平。采用酵母單雜交方法驗(yàn)證家族成員與乙烯響應(yīng)元件GCC-box的互作。從黃瓜材料9930基因組中鑒定得到138個(gè)ERF基因家族成員，共分為10個(gè)亞族，編碼氨基酸長度介于126—745。按照基因家族成員在染色體上的位置分布，將其命名為-。多序列比對和motif分析結(jié)果表明，黃瓜ERF基因家族均具有AP2/ERF結(jié)構(gòu)域，其中4個(gè)成員具有B3結(jié)構(gòu)域。表達(dá)分析結(jié)果顯示，在不同性型材料中共有19個(gè)ERF家族成員差異表達(dá)，其中9個(gè)在基因型中高表達(dá)，10個(gè)在基因型中高表達(dá)。通過雌花芽發(fā)育初期ERF家族成員的表達(dá)趨勢分析，發(fā)現(xiàn)31個(gè)隨子房發(fā)育表達(dá)上調(diào)，30個(gè)表達(dá)下調(diào)。初步證明和具有結(jié)合GCC-box元件的功能。從黃瓜基因組中鑒定出138個(gè)ERF基因家族成員，均擁有1個(gè)或多個(gè)AP2/ERF結(jié)構(gòu)域；其中部分成員在不同性型材料中差異表達(dá)，并可能參與雌花分化初期的基因表達(dá)調(diào)控；部分成員具有結(jié)合保守元件GCC-box調(diào)控下游基因表達(dá)的功能。

黃瓜;乙烯信號;雌花發(fā)育;ERF基因；性別決定

0 引言

【研究意義】黃瓜（L.）是重要的園藝作物之一，其栽培面積僅次于番茄和洋蔥[1]，為世界第三大蔬菜。雌花子房是黃瓜經(jīng)濟(jì)價(jià)值的體現(xiàn)，其分化與發(fā)育決定了果實(shí)的產(chǎn)量和質(zhì)量。黃瓜果實(shí)的形成經(jīng)歷了花芽性別分化和子房發(fā)育兩個(gè)階段，植物激素乙烯在這一過程中起至關(guān)重要的作用[2]。乙烯響應(yīng)因子（ethylene response factor，ERF）家族是一類植物特異性轉(zhuǎn)錄因子家族，多個(gè)ERF家族成員在不同物種中參與到乙烯信號的響應(yīng)與調(diào)控[3-5]。乙烯是影響黃瓜雌花分化與子房發(fā)育的重要因素，系統(tǒng)地對黃瓜基因組中ERF基因家族進(jìn)行鑒定與分析，可以為深入探究黃瓜雌花分化與發(fā)育的分子機(jī)制提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】植物ERF基因家族成員數(shù)量眾多，且在各種生物和非生物脅迫下發(fā)揮重要功能[6]。在一些茄科植物中，/通過與GCC-box 結(jié)合，誘導(dǎo)乙烯的生物合成[3]。在香蕉（）中，通過結(jié)合的啟動(dòng)子激活其轉(zhuǎn)錄，而通過結(jié)合和的啟動(dòng)子，抑制其轉(zhuǎn)錄[4]。類似的，蘋果（）中和通過結(jié)合啟動(dòng)子，分別激活和抑制其轉(zhuǎn)錄[5]。這些研究結(jié)果說明在乙烯合成過程中起重要作用。是較早被克隆并進(jìn)行功能研究的之一[7]。后續(xù)研究中，被報(bào)道通過與茉莉酸、生長素等互作，參與植物防衛(wèi)反應(yīng)[8-9]，也有報(bào)道顯示通過調(diào)控下胚軸細(xì)胞壁增厚和伸長參與植物的光形態(tài)建成[10]。在黃瓜性別分化研究中，已報(bào)道和具有分別結(jié)合A基因（）[11]和M基因（）的啟動(dòng)子，激活其轉(zhuǎn)錄的功能[12]。【本研究切入點(diǎn)】在已有研究中，黃瓜ERF基因家族已基于9930_V1版本基因組進(jìn)行過鑒定分析[13]，但由于早期版本基因組拼接和注釋的質(zhì)量有限，且無法將基因定位于染色體，目前研究人員普遍使用的是9930_V2版本基因組[14]。所以，基于更通用版本基因組對ERF基因家族進(jìn)行鑒定，將會提供更全面和準(zhǔn)確的鑒定結(jié)果?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過基于9930_V2版本基因組對ERF基因家族進(jìn)行鑒定與表達(dá)分析，明確在雌花分化與發(fā)育階段的特異表達(dá)情況，為解釋這一生物學(xué)過程的分子機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2017年春季在上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院進(jìn)行。

1.1 黃瓜材料

本研究試驗(yàn)材料為華北類型黃瓜近等基因系：全雌株系419-19（基因型）和主莖強(qiáng)雄株系419-2（）。材料種植培養(yǎng)環(huán)境為28℃ 18 h晝，18℃ 6 h夜。頂芽選取四葉一心時(shí)期，不同時(shí)期雌花芽選取四葉一心時(shí)期頂芽內(nèi)不同大小的雌花芽。所取材料采用3個(gè)獨(dú)立生物學(xué)重復(fù)，液氮速凍后，置于-80℃超低溫冰箱備用。

1.2 黃瓜ERF基因家族成員鑒定

根據(jù)文獻(xiàn)和TAIR數(shù)據(jù)庫獲得擬南芥（）ERF基因家族的ID和氨基酸序列信息。黃瓜基因組數(shù)據(jù)信息均獲取自CuGenDB（http:// cucurbitgenomics.org）。采用雙向BLAST方法獲取黃瓜基因組中ERF基因ID。雙向BLAST方法簡述如下：采用Geneious軟件將擬南芥ERF基因家族成員比對至黃瓜9930_V2版本基因組，獲取基因ID，再將所獲取基因ID比對至Swiss-Port數(shù)據(jù)庫，確認(rèn)獲取ID為ERF家族成員。通過Geneious軟件進(jìn)行序列多重比對，鑒定保守結(jié)構(gòu)域。同時(shí)，通過NCBI網(wǎng)站的CDD工具預(yù)測ERF基因的AP2/ERF結(jié)構(gòu)域，確定每個(gè)基因均包含該結(jié)構(gòu)域。采用TBtools軟件[15]繪制黃瓜ERF基因家族成員在染色體上的物理位置。

1.3 黃瓜ERF基因家族進(jìn)化、基因結(jié)構(gòu)和GO富集分析

利用MEGA7軟件對黃瓜ERF基因家族成員進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，分析序列為氨基酸，采用Neighbor Joining（NJ）法進(jìn)行建樹，Bootstrap值設(shè)置為1 000。采用EMBOSS軟件進(jìn)行ERF基因家族成員的信號肽和跨膜域預(yù)測。通過MEME（http://meme-suite.org）網(wǎng)站工具進(jìn)行motif預(yù)測分析。將Motif預(yù)測、CDD結(jié)構(gòu)域鑒定以及進(jìn)化樹分析結(jié)果，通過TBtools軟件整合并制圖。VENN交集分析采用VENNY2.1[16]，GO富集分析在葫蘆科基因組網(wǎng)站（http:// cucurbitgenomics. org）進(jìn)行。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）表達(dá)檢測

將植物材料研磨，采用康為世紀(jì)公司試劑盒RNA抽提、反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA。qRT-PCR試驗(yàn)采用羅氏公司FastStart Essential DNA Green Maste試劑，程序參見試劑盒說明書。以（）作為內(nèi)參，所用引物均查詢自qPrimerDB數(shù)據(jù)庫（https://biodb.swu.edu.cn/qprimerdb/）。采用3個(gè)生物學(xué)重復(fù)與3個(gè)技術(shù)重復(fù)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel軟件進(jìn)行處理，采用2-ΔΔCT方法進(jìn)行相對定量分析，顯著性分析采用-test公式計(jì)算。在表達(dá)趨勢分析中，將不同時(shí)期花芽中表達(dá)的CsERF基因家族成員的qRT-PCR相對定量結(jié)果導(dǎo)入Omicshare趨勢分析工具（www.omicshare.com/tools），采用-test 檢驗(yàn)兩個(gè)時(shí)期之間表達(dá)差異大于2倍（value＜0.05）的基因，定義為表達(dá)存在顯著差異的基因。

1.5 酵母單雜交分析

在生工生物公司合成包含3個(gè)串聯(lián)重復(fù)GCC-box的啟動(dòng)子DNA序列“TCCAAGGGGG”（來源于的啟動(dòng)子區(qū)，下劃線為酶切位點(diǎn)），將合成序列通過諾唯贊ClonExpress II重組試劑盒與pLacZ載體融合，構(gòu)建為pLacZ-3xGCC-box載體。采用TaKaRa的PrimerStar GXL DNA聚合酶克隆和的開放和閱讀框，將其與pB42AD載體融合，構(gòu)建為pB42AD-和pB42AD-載體。酵母單雜交分析中，采用EGY48a菌株，以空載體為負(fù)對照，在SD/-Trp/-Ura缺陷型培養(yǎng)基進(jìn)行篩選培養(yǎng)，并在加有X-gal的SD/-Trp/-Ura缺陷型定性培養(yǎng)基上進(jìn)行互作鑒定[17]。

2 結(jié)果

2.1 黃瓜ERF基因家族成員的鑒定與相關(guān)序列信息

通過雙向BLAST分析，以擬南芥AP2/EREBP基因家族為參考，對黃瓜基因組中ERF基因家族進(jìn)行鑒定，共鑒定出138個(gè)具有AP2/ERF結(jié)構(gòu)域的基因（圖1），根據(jù)其在9930_V2基因組中的ID，分別命名為—。長度介于126—745個(gè)氨基酸。通過BLAST比對，將9930_V2基因組ERF家族成員比對到擬南芥TAIR10基因組中，獲取對應(yīng)基因名稱（表1）。相比根據(jù)9930_V1版本所鑒定的103個(gè)ERF基因[13]，本研究新鑒定出25個(gè)ERF家族成員，并將全部138個(gè)定位于染色體。

圖1 黃瓜ERF家族成員AP2/ERF保守結(jié)構(gòu)域序列

通過EMSS軟件對138個(gè)CsERF家族成員進(jìn)行信號肽和跨膜域預(yù)測分析，結(jié)果顯示有40個(gè)CsERF蛋白預(yù)測含有信號肽（表1中標(biāo)注*），其中CsERF55和CsERF116預(yù)測含有跨膜結(jié)構(gòu)域（表1中標(biāo)注#）。

將138個(gè)成員根據(jù)物理位置定位到7條染色體上，結(jié)果如圖2所示。其中，和未定位于7條染色體中，通過兩基因比對至9930_V3版本基因組，發(fā)現(xiàn)其定位于5號染色體。同時(shí)，通過將138個(gè)家族成員的CDS序列與轉(zhuǎn)錄組拼接結(jié)果比較，發(fā)現(xiàn)和兩個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄本存在注釋錯(cuò)誤，依照轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)修正后的兩基因用于后期生物信息學(xué)分析。

2.2 黃瓜ERF基因家族進(jìn)化分析

為了解CsERF家族成員的進(jìn)化特性，對138個(gè)基因構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3）。CsERF家族成員共分為10個(gè)亞家族（Class I—X），其中成員最多的為Class IX，包含37個(gè)基因。成員最少的是Class V，包含4個(gè)具有B3結(jié)構(gòu)域的基因。

2.3 黃瓜ERF基因家族基因結(jié)構(gòu)分析

CsERF基因家族的結(jié)構(gòu)分析結(jié)果如圖4所示，共鑒定出7個(gè)motif，其中motif 1在所有家族中均出現(xiàn)，而在除了Class VI外的其他家族中，大部分成員均包含按順序排列的motif 2-3-1-4。在Class VI中，大部分成員具有按相同順序排列的motif 2-3/6-1-4-5-2-7- 1-4，說明這一結(jié)構(gòu)域在該亞家族中較為保守。在Class IX中，具有一個(gè)特殊的motif 8與motif 4相鄰。綜合motif分析結(jié)果，雖然不同亞族中包含motif的種類以及排列順序不盡相同，但在同一亞族中，均包含相同或相似的motif排序，這可能與該亞家族的分子功能相關(guān)。

表1 CsERF基因家族相關(guān)信息

*：有信號肽；#：有跨膜結(jié)構(gòu)域 *: Signal peptide; #: Transmembrane domain

圖2 黃瓜ERF基因家族在染色體上的位置

圖3 黃瓜ERF家族進(jìn)化樹（羅馬數(shù)字I-X代表10個(gè)亞家族）

結(jié)構(gòu)域分析表明，所有CsERF家族成員均具有保守的AP2/ERF結(jié)構(gòu)域，其中4個(gè)基因具有B3結(jié)構(gòu)域。在CsERF家族成員中，多數(shù)亞家族成員無內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，但Class II、Class VI和Class VII亞家族中的大部分成員，基因內(nèi)具有多個(gè)內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。其中Class VI亞家族較為特殊，其成員均包含2個(gè)AP2/ERF結(jié)構(gòu)域，且多數(shù)內(nèi)含子分布在AP2/ERF結(jié)構(gòu)域中，推測該亞家族在進(jìn)化過程中AP2/ERF結(jié)構(gòu)域發(fā)生了復(fù)制，造成這一結(jié)構(gòu)域被內(nèi)含子間隔的特殊現(xiàn)象。

2.4 黃瓜ERF在不同性型材料中的特異表達(dá)分析

ERF基因家族在多種植物中被報(bào)道參與乙烯信號傳導(dǎo)過程，在黃瓜花芽性別分化過程中，乙烯信號是決定雌花分化的關(guān)鍵。為鑒定黃瓜ERF家族成員與性別決定與雌花分化過程的關(guān)系，通過RT-qPCR方法對全雌株系419-19（）和419-2主莖強(qiáng)雄株系M12（）植株頂芽轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行檢測。表達(dá)存在顯著差異（value＜0.05）的基因如圖5所示，、、、、、、和這9個(gè)基因在全雌株系中高表達(dá)（圖5-A），、、、、、、、、和這10個(gè)基因在強(qiáng)雄株系中高表達(dá)（圖5-B）。在ERF基因家族中，上述差異表達(dá)基因主要集中于Class I和Class II亞家族，且具有成簇分布的趨勢，如和相鄰并在全雌株系中高表達(dá)，、和也在全雌株系中高表達(dá)。

紅色字體代表在基因型材料頂芽中高表達(dá)，藍(lán)色字體代表在基因型材料頂芽中高表達(dá)，紅色三角號代表雌花芽發(fā)育初期表達(dá)呈上調(diào)趨勢，藍(lán)色三角號代表雌花芽發(fā)育初期表達(dá)呈下調(diào)趨勢

Genes in red indicate highly express ingenotype line, genes in blue indicate highly express ingenotype line, red and blue triangles indicate genes show an up- and down-regulated trend in female bud development, respectively

圖4 黃瓜ERF基因家族的基因結(jié)構(gòu)分析

Fig. 4 Gene structure analysis of ERF family members in cucumber

2.5 黃瓜ERF基因家族成員在雌花發(fā)育初期的表達(dá)模式分析

有研究表明，乙烯信號在促進(jìn)雌花分化的同時(shí)，對果實(shí)發(fā)育也存在調(diào)控作用，如通過結(jié)合M基因（）介導(dǎo)其泛素化，進(jìn)而精細(xì)調(diào)控M基因的表達(dá)，控制果實(shí)的發(fā)育[18]。M基因的特異表達(dá)時(shí)期是雌花分化的1—10 mm時(shí)期[19]，所以本研究分別選取這一時(shí)期2、5和10 mm的雌花芽，對ERF基因家族成員和部分和的表達(dá)變化趨勢進(jìn)行檢測，其中5個(gè)命名與前人一致[20]。將不同時(shí)期間存在顯著表達(dá)變化（＜0.05）且差異大于2倍以上的基因，定義為表達(dá)存在顯著差異的基因。結(jié)果如圖6所示，共有61個(gè)在雌花芽發(fā)育初期表達(dá)趨勢發(fā)生變化，其中29個(gè)在2—5 mm階段表達(dá)上調(diào)，而5—10 mm階段表達(dá)無顯著變化，2個(gè)在2—10 mm階段均呈上升趨勢。同時(shí)，25個(gè)在2—5 mm階段表達(dá)下調(diào)，而5—10 mm階段表達(dá)無顯著變化，5個(gè)在2—10 mm階段均呈下降趨勢。此外，和在5—10 mm時(shí)期特異高表達(dá)，而和在2—5 mm階段特異高表達(dá)。

值得注意的是，ERF基因家族在雌花芽發(fā)育初期的表達(dá)趨勢具有明顯的結(jié)構(gòu)特異性。Class I和Class II亞家族中，表達(dá)變化的均呈現(xiàn)下降趨勢。同時(shí)，Class VI和Class VII中，表達(dá)變化的多數(shù)呈上升趨勢。此外，一些在系統(tǒng)進(jìn)化樹中相鄰的基因，也表現(xiàn)出相似的變化趨勢，如Class VI中的、、、、和，以及Class IX中的、、和。這說明一些進(jìn)化上趨于保守的基因家族成員具有相似的表達(dá)模式，在雌花芽發(fā)育初期所發(fā)揮的功能可能相似。

圖5 在FFMMAA（A）和ffMMAA（B）基因型材料頂芽中顯著高表達(dá)的CsERF家族成員

圖6 CsERF家族成員在雌花芽發(fā)育初期表達(dá)存在顯著變化的成員

2.6 ERF基因家族成員對GCC-box元件具有結(jié)合作用

很多ERF轉(zhuǎn)錄因子通過與其下游應(yīng)答元件GCC-box的相互作用來調(diào)控基因表達(dá)。通過對黃瓜基因組注釋基因啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行序列分析，共檢測到882個(gè)基因啟動(dòng)子具有GCC-box（AGCCGCC）。為驗(yàn)證黃瓜是否具有保守的結(jié)合GCC-box功能，選取擬南芥同源基因和，通過酵母單雜交系統(tǒng)驗(yàn)證其與GCC-box的結(jié)合作用，發(fā)現(xiàn)兩基因均可以直接結(jié)合GCC-box（圖7）。這說明部分黃瓜ERF家族成員具有保守結(jié)合GCC-box元件的功能，同時(shí)也為從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中高效篩選下游直接調(diào)控靶基因提供了分子依據(jù)。

為進(jìn)一步研究雌花芽發(fā)育初期受ERF轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的基因表達(dá)變化，從國家基因庫生物大數(shù)據(jù)平臺（CNGBdb）的CNP0000657項(xiàng)目中提取2、5和10 mm雌花芽轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（CNS0110220、CNS0110221、CNS0110222、CNS0110223、CNS0110224、CNS0110225）進(jìn)行表達(dá)趨勢分析。共篩選出2 969個(gè)基因與和表達(dá)趨勢相似，隨著雌花芽分化表達(dá)呈下降趨勢，同時(shí)篩選出7 051個(gè)基因的表達(dá)隨雌花芽分化呈上升趨勢。通過將這些基因與882個(gè)啟動(dòng)子具有GCC-box的基因進(jìn)行VENN交集分析，發(fā)現(xiàn)有148個(gè)基因的表達(dá)隨著雌花芽分化下調(diào)，而232個(gè)基因上調(diào)，且這些基因啟動(dòng)子均具有GCC-box（圖7-B）。將上調(diào)和下調(diào)基因進(jìn)行分子功能（molecular function）GO富集分析，發(fā)現(xiàn)上調(diào)基因中富集最顯著的是GO: 0005667途徑，共有10個(gè)基因富集其中，注釋與轉(zhuǎn)錄復(fù)合體（transcription factor complex）相關(guān)。在下調(diào)基因中富集最顯著的是GO:0003723途徑，共有14個(gè)基因富集其中，注釋與RNA結(jié)合（RNA binding）相關(guān)。

圖7 酵母單雜交系統(tǒng)驗(yàn)證CsERF31和CsERF9對GCC-box的互作（A），雌花芽發(fā)育初期表達(dá)成下降趨勢的基因與啟動(dòng)子具有GCC-box的基因VENN分析（B），交集中表達(dá)下調(diào)（左）和上調(diào)（右）基因的GO富集分析（C）

3 討論

3.1 雌花芽分化2 mm階段是器官發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期

自1994年在擬南芥中分離出第一個(gè)與花發(fā)育相關(guān)基因[21]以來，已報(bào)道大量對AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子的基因家族分析，包括玉米[22]、粟[23]、葡萄[24]和橙[25]等。本研究主要關(guān)注黃瓜ERF基因家族在黃瓜雌花芽的分化與發(fā)育過程中的表達(dá)趨勢變化，進(jìn)而為深入研究這一重要生物學(xué)過程的分子機(jī)制提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。根據(jù)前人對黃瓜花芽性別分化時(shí)期的劃分，6—7時(shí)期（Stage 6—7）是花芽性別分化時(shí)期[26]。在6—7時(shí)期，花芽長度小于1 mm，而在2 mm階段，是花芽由性別分化向雌器官起始發(fā)育的轉(zhuǎn)變期。2 mm階段的雌花芽，子房已經(jīng)起始發(fā)育，而在5—10 mm階段，已發(fā)育出具有明顯形態(tài)特征的子房，各雌器官均已分化完成。在ERF基因家族中，大部分基因的表達(dá)變化集中于雌花芽2—5 mm階段，說明這一階段可能發(fā)生了復(fù)雜的基因表達(dá)調(diào)控，使雌性器官得以正確的分化。

3.2 Class I和Class II類基因可能在雌花的分化與發(fā)育過程中發(fā)揮功能

在黃瓜ERF基因家族的10個(gè)亞家族中，Class I和Class II成員的表達(dá)模式較為特殊。值得注意的是在雌花芽分化初期，Class I和Class II中所有表達(dá)發(fā)生變化的基因，均呈現(xiàn)下降趨勢（圖4中藍(lán)色箭頭標(biāo)注基因）。表達(dá)量呈下降趨勢暗示這些基因可能在花芽發(fā)育最初階段發(fā)揮功能，隨著子房發(fā)育，其表達(dá)被抑制而趨于穩(wěn)定。

此外，選取不同性別類型植株和不同雌花芽發(fā)育階段進(jìn)行表達(dá)檢測，是將雌花的性別分化與雌性器官發(fā)育假定為兩個(gè)生物學(xué)過程。因此，圖4中“紅色字體，藍(lán)色三角號”基因（即在全雌株頂芽高表達(dá)，并隨雌花芽發(fā)育表達(dá)下降）推測與性別分化更相關(guān)，“藍(lán)色字體，紅色三角號”基因（即在強(qiáng)雄株頂芽高表達(dá)，并隨雌花芽發(fā)育表達(dá)上升）則可能與雌花芽發(fā)育更相關(guān)，“藍(lán)色字體，藍(lán)色三角號”基因（即在強(qiáng)雄株頂芽高表達(dá)，并隨雌花芽發(fā)育表達(dá)下降）更有可能與雄花分化相關(guān)。值得注意的是，在所有具有表達(dá)變化的中，未發(fā)現(xiàn)在全雌株系中高表達(dá)，且隨著雌花芽分化表達(dá)上調(diào)的基因（即圖4中“紅色字體，紅色三角號”）。據(jù)此推測參與性別分化與雌花芽發(fā)育的過程受到嚴(yán)格調(diào)控，在不同性別花芽、不同花芽分化階段發(fā)揮不同的功能。

3.3 部分黃瓜ERF的調(diào)控機(jī)制與模式植物相似

在黃瓜ERF基因家族中，、、以及在擬南芥中的直系同源基因均為。擬南芥在乙烯信號傳導(dǎo)通路中，受上游/等基因調(diào)控，通過激活下游基因參與多種生物學(xué)過程[27]。在上述4個(gè)基因中，已被報(bào)道具有正調(diào)控M基因（）的功能，這說明其很可能通過乙烯信號傳導(dǎo)途徑參與花芽的性別分化過程。此外，和在擬南芥中的同源基因均為，且兩基因具有與和相似的表達(dá)趨勢，其中已被報(bào)道具有正調(diào)控A基因（）的功能[10]，而被報(bào)道可能參與M基因自反饋調(diào)控[28-30]。有報(bào)道顯示，（）、（）和（）的不同基因型材料，其乙烯釋放速率存在顯著差異[31]，上述結(jié)果暗示，這類基因很可能通過乙烯信號傳導(dǎo)途徑介導(dǎo)黃瓜雌花的分化。

在Class VI中，、和在擬南芥中的同源基因均為。在擬南芥中調(diào)控花芽等側(cè)生器官發(fā)育，其突變體在育性、子房發(fā)育和側(cè)生器官分化方面均存在缺陷[32]。本研究中，、和隨雌花芽發(fā)育表達(dá)上調(diào)，這暗示其可能具有調(diào)控雌性器官發(fā)育的功能。和在擬南芥中的同源基因?yàn)?。在擬南芥中受細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核調(diào)控下游基因[33]。和的表達(dá)隨雌花芽分化上調(diào)，推測其同樣受到細(xì)胞分裂素等激素的調(diào)控，在子房發(fā)育過程中行使功能。

此外，擬南芥ERF1同源蛋白CsERF9和CsERF31具有結(jié)合乙烯響應(yīng)元件GCC-box的功能，說明黃瓜ERF家族基因可能存在與模式植物相似的分子調(diào)控方式影響下游基因的表達(dá)。通過進(jìn)一步的生物信息學(xué)分析，鑒定出大量在雌花芽發(fā)育初期表達(dá)變化的基因，對啟動(dòng)子具有GCC-box的基因進(jìn)行GO聚類分析，發(fā)現(xiàn)富集最顯著的是轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體和RNA結(jié)合兩個(gè)途徑。轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體和RNA結(jié)合蛋白均為調(diào)控RNA轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后翻譯的影響因子，其在雌花芽發(fā)育初期表達(dá)的集中變化，說明這一過程可能涉及轉(zhuǎn)錄激活調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控以及翻譯后修飾等一系列調(diào)控過程，近期報(bào)道的介導(dǎo)M（CsACS2）蛋白泛素化調(diào)控子房發(fā)育也為這一過程提供了新的分子證據(jù)[18]。綜上所述，推測在雌花芽發(fā)育初期的表達(dá)變化，直接或間接影響了下游基因的表達(dá)，使雌花芽中各器官得以正確分化，進(jìn)而完成果實(shí)的發(fā)育。

4 結(jié)論

本研究從黃瓜9930_V2基因組中鑒定出138個(gè)具有AP2/ERF結(jié)構(gòu)域的ERF基因家族成員，可分為10個(gè)亞族。在花芽性別分化和雌花芽發(fā)育不同階段中，具有明顯的表達(dá)變化，并且其表達(dá)變化與基因結(jié)構(gòu)存在相關(guān)性。一些可以結(jié)合保守元件GCC-box，推測其通過結(jié)合GCC-box來調(diào)控下游靶基因的表達(dá)。

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Genome-Wide Identification of Cucumber ERF Gene Family and Expression Analysis in Female Bud Differentiation

PAN Jian, WEN HaiFan, HE HuanLe, LIAN HongLi, WANG Gang, PAN JunSong, CAI Run

(School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240)

【】The objectives of this research were to identify the Ethylene Response Factor (ERF) family genes from cucumber (L.) genome and to know the profile offamily such as gene number, gene structure and expression characters in cucumber, so as to provide a theoretical basis for exploring what roles the ERF transcription factors played in female flowers development. 【】Thegenes in cucumber genome were identified by BLAST software in the 9930_V2 genome database based ongenes. EMBOSS, MEME, TBtools, ExPASy and MEGA 7.0 software were used for carrying out various bioinformatics analysis of ERF. The qRT-PCR was used to detect the expression of cucumbergene family in female buds’ differentiation. 【】Total of 138genes were identified from cucumber genome, which could be divided into 10 classes. These 138genes were named fromto, and the number of amino acids of thesegenes was between 126 and 745. Multiple sequence alignments and Motif analysis showed that thegene family had two conserved domains, namely AP2/ERF domain and B3 domain. There were 19genes showed different expression betweenandgenotype, 9 of them up-regulated ingenotype and the other 10 up-regulated ingenotype. The expression trend analysis showed 31genes up-regulated and 30 genes down-regulated in the initial-phase of female buds’ differentiation. Furthermore, it was demonstrated thatandcould bind the GCC-box. 【】138gene family members were identified from the cucumber 9930_V2 genome. These entiregene shared AP2/ERF domain. Some of thefamily members were related to sex determination and female flower development and could bind GCC-box to regulate downstream genes expression.

cucumber; ethylene signal; female flower development; ERF, sex determination

10.3864/j.issn.0578-1752.2020.01.013

2019-05-28；

2019-10-29

國家自然科學(xué)基金（31772308，31272185，31471879）

潘健，E-mail：nillice@sina.com。通信作者蔡潤，E-mail：cairun@sjtu.edu.cn

（責(zé)任編輯 趙伶俐）