黃瓜幼苗下胚軸長(zhǎng)度GWAS分析及候選基因挖掘

蔡和序，薄凱亮，周琪，苗晗，董邵云，顧興芳，張圣平

黃瓜幼苗下胚軸長(zhǎng)度GWAS分析及候選基因挖掘

蔡和序，薄凱亮，周琪，苗晗，董邵云，顧興芳，張圣平

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所/農(nóng)業(yè)部園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081）

【】挖掘與黃瓜幼苗下胚軸長(zhǎng)度顯著相關(guān)的SNP位點(diǎn)及候選基因，為揭示下胚軸長(zhǎng)度的遺傳基礎(chǔ)和分子機(jī)制提供理論依據(jù)，為短下胚軸分子標(biāo)記輔助選擇育種奠定基礎(chǔ)。以95份黃瓜核心種質(zhì)為試驗(yàn)材料，分別于2016年春季、2017年春季、2017年秋季和2018年春季在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院南口試驗(yàn)基地塑料大棚進(jìn)行種植，在兩葉一心期調(diào)查黃瓜幼苗的下胚軸長(zhǎng)度；利用Structure 2.3.4軟件分析群體結(jié)構(gòu)，Haploview 軟件分析連鎖不平衡的衰減；基于最優(yōu)模型對(duì)下胚軸長(zhǎng)度進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS），依據(jù)關(guān)聯(lián)SNP位點(diǎn)的LD區(qū)間序列，預(yù)測(cè)與下胚軸長(zhǎng)度相關(guān)的重要關(guān)聯(lián)候選基因，并利用熒光定量PCR對(duì)預(yù)測(cè)基因進(jìn)行表達(dá)模式分析。共檢測(cè)到8個(gè)顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)（），分別位于1、2、3、4、5、6號(hào)染色體，其中，等5個(gè)位點(diǎn)被重復(fù)檢測(cè)到兩次以上。通過(guò)分析關(guān)聯(lián)SNP位點(diǎn)的LD區(qū)間序列，獲得8個(gè)與黃瓜下胚軸長(zhǎng)度有關(guān)的候選基因，其中既有光形態(tài)建成、泛素化、激素信號(hào)通路等調(diào)控基因，也有調(diào)控網(wǎng)絡(luò)下游參與細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育，調(diào)節(jié)細(xì)胞大小，直接調(diào)控黃瓜下胚軸長(zhǎng)度的基因。多基因在不同黃瓜材料中的有機(jī)分布，形成了具有不同下胚軸長(zhǎng)度的黃瓜種質(zhì)。基因表達(dá)分析顯示在短下胚軸材料中高表達(dá)。在長(zhǎng)下胚軸材料中高表達(dá)。檢測(cè)到等8個(gè)與黃瓜下胚軸長(zhǎng)度密切關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)，挖掘到等8個(gè)調(diào)控下胚軸長(zhǎng)度的候選基因。

黃瓜；下胚軸長(zhǎng)度；全基因組關(guān)聯(lián)分析；候選基因

0 引言

【研究意義】黃瓜作為一種重要的蔬菜作物，在全球范圍內(nèi)廣泛栽培。目前黃瓜種植中大量采用工廠化穴盤(pán)育苗，單位面積幼苗數(shù)量越多即密度越大收益越高，帶來(lái)的問(wèn)題是容易造成幼苗下胚軸徒長(zhǎng)。另外，育苗過(guò)程中如果遭遇高溫、高濕、弱光等不良環(huán)境，也會(huì)導(dǎo)致幼苗下胚軸徒長(zhǎng)，影響后期豐產(chǎn)性。因此，挖掘黃瓜下胚軸長(zhǎng)度的調(diào)控位點(diǎn)和基因，開(kāi)發(fā)準(zhǔn)確實(shí)用的分子標(biāo)記用于輔助培育短下胚軸品種，對(duì)于緩解下胚軸徒長(zhǎng)和保證豐產(chǎn)具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】雙子葉植物的下胚軸是連接兩個(gè)胚胎葉（子葉）和初生根（胚根）的胚胎干[1]。下胚軸具有相對(duì)簡(jiǎn)單的結(jié)構(gòu)，是一種非?？伤艿钠鞴?，受到已知調(diào)節(jié)細(xì)胞伸長(zhǎng)的外部和內(nèi)部因素的強(qiáng)烈影響，例如光照[2-7]、溫度[8]和激素[9-11]，在高溫高濕條件下，下胚軸徒長(zhǎng)尤為嚴(yán)重。Bo等[12]從半野生西雙版納黃瓜中克隆了短下胚軸的基因SHORT HYPOCOTYL1（），該基因編碼SMARCA3染色質(zhì)重塑因子，它通過(guò)與CsHY5進(jìn)行互作間接調(diào)控細(xì)胞伸長(zhǎng)相關(guān)基因的表達(dá)，最終影響黃瓜下胚軸的伸長(zhǎng)。苗晗等[13]通過(guò)下胚軸長(zhǎng)度QTL定位檢測(cè)到5個(gè)下胚軸長(zhǎng)度相關(guān)QTL，在Chr.5上標(biāo)記SSR15818和SSR06003之間檢測(cè)到3個(gè)QTL，總貢獻(xiàn)率高達(dá)61%；Chr.6上重復(fù)檢出兩個(gè)相鄰位點(diǎn)和。全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）是利用自然群體探測(cè)物種的遺傳變異，進(jìn)而挖掘與復(fù)雜農(nóng)藝性狀相關(guān)遺傳位點(diǎn)的研究方法，具有不需要構(gòu)建作圖群體和一次性可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)等位基因位點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)，近年來(lái)在擬南芥[14-15]、玉米[16]、水稻[17]等作物中均有廣泛研究。【本研究切入點(diǎn)】隨著黃瓜基因組測(cè)序的完成，利用高通量數(shù)據(jù)對(duì)黃瓜復(fù)雜性狀開(kāi)展GWAS研究越來(lái)越便利。QTL定位的方法僅能對(duì)在分離群體的親本材料間存在差異的基因效應(yīng)進(jìn)行分析，無(wú)法在全基因組范圍廣泛挖掘參與下胚軸調(diào)控的基因。目前關(guān)于黃瓜下胚軸的GWAS研究尚未見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】采用GWAS分析鑒定與黃瓜下胚軸長(zhǎng)度顯著關(guān)聯(lián)的SNP，確定控制性狀變異的候選基因。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為95份黃瓜核心種質(zhì)資源，來(lái)源于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所。本核心種質(zhì)是利用在染色體上均勻分布的23對(duì)高多態(tài)性的SSR標(biāo)記，從 3 342份來(lái)源于世界各地的黃瓜資源中篩選出來(lái)的，具有廣泛的代表性[18]。所有材料均為自然群體，材料編號(hào)及來(lái)源見(jiàn)電子附表1。

1.2 種植處理

分別于2016年春季、2017年春季、2017年秋季、2018年春季4個(gè)時(shí)期，將試驗(yàn)材料在28℃下催芽，出芽后播種于32孔穴盤(pán)，于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京南口試驗(yàn)基地的溫室育苗。每份材料設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5株，隨機(jī)區(qū)組排列。

1.3 下胚軸長(zhǎng)度調(diào)查

黃瓜幼苗長(zhǎng)至兩葉一心時(shí)，用直尺測(cè)量下胚軸長(zhǎng)度，記錄原始數(shù)據(jù)后取平均值。表型數(shù)據(jù)分析采用SPSS20.0。

1.4 重測(cè)序分析與基因分型

整個(gè)核心種質(zhì)群體均完成了全基因組的重測(cè)序[18]，測(cè)序數(shù)據(jù)見(jiàn)黃瓜基因組網(wǎng)站（http://cucurbitgenomics. org）。過(guò)濾掉最小等位基因頻率（MAF）＜0.05的變異位點(diǎn)；只保留二態(tài)的變異位點(diǎn)。再根據(jù)次等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）＞0.05 和完整度（即非N的SNP位點(diǎn)數(shù)占總SNP位點(diǎn)的比例）＞0.8對(duì)SNP進(jìn)行篩選，最終得到均勻分布于黃瓜7條染色體上的53 921個(gè)高質(zhì)量且位置唯一的SNP 矩陣用于后續(xù)分析。

1.5 群體結(jié)構(gòu)分析與連鎖不平衡分析

群體結(jié)構(gòu)由Structure 2.3.4軟件基于貝葉斯數(shù)學(xué)模型進(jìn)行分析，并參照QI等[18]確定最終亞群數(shù)目。本試驗(yàn)為了簡(jiǎn)化群體結(jié)構(gòu)復(fù)雜性對(duì)GWAS結(jié)果的影響，K值取為3。用過(guò)濾后SNP矩陣進(jìn)行全基因組連鎖不平衡（linkage disequilibrium，LD）分析[19]，分析采用軟件Haploview進(jìn)行[20]。

1.6 全基因組關(guān)聯(lián)分析

將苗期調(diào)查的表型數(shù)據(jù)和過(guò)濾后構(gòu)建的高質(zhì)量SNP矩陣，利用基于R的GAPITR軟件包[21]，通過(guò)混合線性模型（mixed linear model，MLM）進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。利用ggplot2軟件繪制Quantile-Quantile散點(diǎn)圖（QQ plot）[22]，并在此基礎(chǔ)上利用QQman繪制曼哈頓圖[23]，顯示關(guān)聯(lián)分析檢測(cè)到的與目標(biāo)性狀顯著相關(guān)的標(biāo)記位點(diǎn)。對(duì)95份黃瓜的苗期下胚軸性狀進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析。

1.7 候選基因預(yù)測(cè)

根據(jù)GWAS結(jié)果獲得的SNP位點(diǎn)，根據(jù)序列位置將其定位到黃瓜基因組參考物理圖譜上?；谌后w連鎖不平衡分析的LD區(qū)間，結(jié)合黃瓜基因組網(wǎng)站（http://cucurbitgenomics.org/）基因的功能注釋信息，根據(jù)注釋信息找出與性狀相關(guān)的候選基因。

1.8 候選基因的表達(dá)分析

為了驗(yàn)證候選基因的準(zhǔn)確性，在黃瓜核心種質(zhì)中選取4個(gè)長(zhǎng)下胚軸材料（CG9、CG11、CG106、CG112）和4個(gè)短下胚軸材料（CG19、CG44、CG54、CG98），在播種后子葉展平、第一片真葉展平、一葉一心、第二片真葉展平、兩葉一心5個(gè)時(shí)期采集下胚軸。使用日本TaKaRa公司的RNA提取試劑盒（9767）提取總DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取得到的RNA質(zhì)量。用TaKaRa公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取到的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。用Nanodrop儀器檢測(cè)cDNA的濃度及純度，用ddH2O將cDNA稀釋到50 ng?μL-1，用于熒光定量分析。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果選擇黃瓜作為內(nèi)參基因；使用2-ΔΔCt計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。反應(yīng)體系混合物的配置如表1，PCR反應(yīng)程序如表2。

表1 熒光定量反應(yīng)體系

表2 PCR反應(yīng)程序

2 結(jié)果

2.1 表型統(tǒng)計(jì)分析

在2016年春季（16S）、2017年春季（17S）、2017年秋季（17A）和2018年春季（18S）4次不同環(huán)境下分別對(duì)95份黃瓜種質(zhì)的下胚軸長(zhǎng)度進(jìn)行調(diào)查，下胚軸長(zhǎng)度差異明顯，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見(jiàn)表3。4個(gè)批次中材料重復(fù)性較好，表現(xiàn)比較一致。長(zhǎng)下胚軸材料如CG9、CG11、CG106、CG112等在不同批次中均下胚軸過(guò)長(zhǎng)，表現(xiàn)為徒長(zhǎng)的特性；而短下胚軸材料如CG19、CG44、CG54、CG98等在不同批次中下胚軸長(zhǎng)度均較短。4個(gè)批次變異系數(shù)分別為32.32%、33.27%、26.28%和30.17%，下胚軸長(zhǎng)度頻次分布圖具有顯著的正態(tài)分布特征（圖1），并且4個(gè)批次之間黃瓜下胚軸長(zhǎng)度均顯著相關(guān)（表4），表明下胚軸長(zhǎng)度性狀為典型的數(shù)量性狀，采用GWAS分析方法可有效進(jìn)行該性狀的基因定位。

表3 黃瓜下胚軸長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì)分析

16S：2016年春季；17S：2017年春季；17A：2017年秋季；18S：2018年春季。下同

16S: spring of 2016; 17S: spring of 2017; 17A: autumn of 2017; 18S: spring of 2018. The same as below

2.2 群體結(jié)構(gòu)與連鎖不平衡分析

用過(guò)濾后的SNP矩陣進(jìn)行全基因組連鎖不平衡（linkage disequilibrium，LD）分析，當(dāng)2從0.736衰減到0.368時(shí)，所對(duì)應(yīng)的物理距離為17.3 kb（圖2）。因此，黃瓜的全基因組平均 LD為17.3 kb（當(dāng)2值衰減到其最大值一半時(shí)對(duì)應(yīng)的物理長(zhǎng)度，即為全基因組平均LD）。

表4 4個(gè)批次黃瓜下胚軸長(zhǎng)度的相關(guān)性分析

** 在0.01 水平（雙側(cè)）上顯著相關(guān)

** Significantly correlated at 0.01 level (bilateral)

圖1 黃瓜下胚軸長(zhǎng)度的頻次分布

2.3 全基因組關(guān)聯(lián)分析

對(duì)黃瓜核心種質(zhì)苗期下胚軸長(zhǎng)度進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析（圖3），根據(jù)全基因組連鎖不平衡結(jié)果，劃分4個(gè)批次檢測(cè)出的位點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的LD區(qū)間，對(duì)重疊區(qū)間進(jìn)行合并，合并后共8個(gè)區(qū)間，檢測(cè)到8個(gè)關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，分別位于第1、2、3、4、5、6號(hào)染色體，這些位點(diǎn)可解釋的表型變異率為13.67%— 31.87%。被檢測(cè)到3次被檢測(cè)到兩次（電子附表2）。說(shuō)明是在不同季節(jié)穩(wěn)定存在的關(guān)聯(lián)位點(diǎn)。

2.4 候選基因挖掘

利用已公布的黃瓜基因組測(cè)序結(jié)果（9930v2），將與下胚軸長(zhǎng)度顯著關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記定位到黃瓜基因組上，進(jìn)而在顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)側(cè)翼序列40 kb范圍內(nèi)提取基因。根據(jù)黃瓜基因組的注釋信息，篩選出候選區(qū)段內(nèi)與下胚軸長(zhǎng)度相關(guān)的同源基因。本研究共篩選出、、、等8個(gè)與下胚軸長(zhǎng)度相關(guān)的候選基因（表5）。其中，、參與植物細(xì)胞形態(tài)形成，可能直接參與下胚軸的伸長(zhǎng)，、可能通過(guò)影響光形態(tài)發(fā)生來(lái)調(diào)控下胚軸伸長(zhǎng)，可能通過(guò)蛋白質(zhì)泛素化來(lái)調(diào)控下胚軸伸長(zhǎng)，、則參與了RNA的加工，可能通過(guò)轉(zhuǎn)錄翻譯的調(diào)控來(lái)控制下胚軸伸長(zhǎng)，則可能通過(guò)參與生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)，影響細(xì)胞的生長(zhǎng)，最終調(diào)控下胚軸的伸長(zhǎng)。在這些候選基因中，、、、和對(duì)應(yīng)的位點(diǎn)被重復(fù)檢測(cè)到。

圖2 95份黃瓜全基因組連鎖不平衡衰減

表5 候選基因及注釋信息

圖3 95份黃瓜核心種質(zhì)幼苗下胚軸長(zhǎng)度的全基因組關(guān)聯(lián)分析曼哈頓圖

2.5 候選基因的表達(dá)模式分析

為了驗(yàn)證候選基因的準(zhǔn)確性，在黃瓜核心種質(zhì)中選取在4個(gè)批次中表現(xiàn)一致的4個(gè)長(zhǎng)下胚軸材料（CG9、CG11、CG106、CG112）和4個(gè)短下胚軸材料（CG19、CG44、CG54、CG98），在播種后子葉展平、第一片真葉展平、一葉一心、第二片真葉展平、兩葉一心5個(gè)時(shí)期采集下胚軸進(jìn)行RNA提取，反轉(zhuǎn)錄后發(fā)現(xiàn)其比值均在1.8—2.0，表明提取的RNA質(zhì)量合格。在瓊脂糖凝膠電泳的膠圖上有兩條清晰可見(jiàn)的條帶，說(shuō)明RNA有較好的完整性（圖4）。用候選基因和內(nèi)參的特異性引物分別對(duì)其進(jìn)行熒光定量PCR，其溶解曲線為單峰，說(shuō)明引物只擴(kuò)增出單一條帶，具有特異性。

圖4 總RNA電泳檢測(cè)

表型調(diào)查的數(shù)據(jù)分析表明，不同材料間下胚軸長(zhǎng)度有顯著差異（表6，圖5）。CG9和CG112下胚軸長(zhǎng)度最長(zhǎng)，過(guò)度徒長(zhǎng)；CG11和CG106下胚軸長(zhǎng)度次之，徒長(zhǎng)較重；CG19和CG44輕微徒長(zhǎng)；CG54和CG98沒(méi)有徒長(zhǎng)，幼苗健壯。

熒光定量結(jié)果（圖6）顯示，（）在CG54和CG98中表達(dá)量顯著提高；（）在CG19、CG44、CG54和CG98表達(dá)量顯著提高；（）在CG19和CG98表達(dá)量顯著提高；（）在CG9和CG11表達(dá)量顯著提高；（）在CG9、CG11、CG106和CG112中表達(dá)量顯著提高；（）在CG19和CG54中表達(dá)量顯著提高；（）僅在CG11和CG106中表達(dá)量顯著降低；（）在CG9、CG11和CG106表達(dá)量顯著降低。總體來(lái)看，（）、（）、（）、（）、（）在短下胚軸材料中高表達(dá)。（）、（）在長(zhǎng)下胚軸材料中高表達(dá)。

兩葉一心期CG54（左）與CG112（右）

表6 qPCR材料苗期下胚軸長(zhǎng)度

時(shí)期1：子葉展平；時(shí)期2：第一片真葉展平；時(shí)期3：一葉一心；時(shí)期4：第二片真葉展平；時(shí)期5：兩葉一心；表中數(shù)據(jù)單位均為（cm）；不同小寫(xiě)字母表示不同品種間差異達(dá)0.05顯著水平（Duncan’s 法）

Stage 1: the cotyledon stage; Stage 2: the one true leaf stage; Stage 3: the one leaf and one bud stage; Stage 4: the two true leaves stage; Stage 5:the two true leaves and one bud stage; All data units in the table are (cm); Different lowercase letters indicate significant difference between different breeds at 0.05 level (Duncan's method)

CG9、CG11、CG106、CG112均為長(zhǎng)下胚軸材料；CG19、CG44、CG54、CG98均為短下胚軸材料；每個(gè)候選基因中選取表達(dá)量最低的材料，其相對(duì)表達(dá)量設(shè)為1

3 討論

3.1 黃瓜下胚軸長(zhǎng)度的變異分析

下胚軸長(zhǎng)度是影響黃瓜種苗的重要因素之一，長(zhǎng)度過(guò)長(zhǎng)會(huì)影響種苗的運(yùn)輸、定植后的成活率以及后期單株產(chǎn)量。因此，利用GWAS分析挖掘黃瓜下胚軸長(zhǎng)度基因?qū)τ邳S瓜短下胚軸育種具有重要的價(jià)值。本研究選取了來(lái)自于東亞、歐洲、美國(guó)、西雙版納、印度的黃瓜材料，是從世界各地3 000多份種質(zhì)中篩選出來(lái)的，代表黃瓜75%以上的遺傳變異[18]，構(gòu)建了一個(gè)具有豐富下胚軸長(zhǎng)度變異的自然群體材料作為試驗(yàn)樣本，保證了表型數(shù)據(jù)的多樣性。另外，根據(jù)黃瓜實(shí)際生產(chǎn)中的條件，在溫室中對(duì)核心種質(zhì)進(jìn)行4次下胚軸長(zhǎng)度鑒定，幼苗長(zhǎng)勢(shì)和下胚軸長(zhǎng)度均表現(xiàn)出明顯差異。篩選出長(zhǎng)下胚軸材料CG9、CG11、CG106及CG112，短下胚軸材料CG19、CG44、CG54、CG98等。同時(shí)，也有少部分下胚軸長(zhǎng)度處于中間的材料在不同季節(jié)處理中表現(xiàn)不穩(wěn)定，可能與處理?xiàng)l件、天氣狀況及溫室內(nèi)幼苗生物排布方式等有關(guān)。

3.2 黃瓜下胚軸長(zhǎng)度的QTL定位

本研究通過(guò)對(duì)95份黃瓜核心種質(zhì)苗期下胚軸長(zhǎng)度的全基因組關(guān)聯(lián)分析，共檢測(cè)出8個(gè)顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)，這表明黃瓜的胚軸長(zhǎng)度為微效多基因控制。在我國(guó)當(dāng)前的黃瓜保護(hù)地生產(chǎn)中，大量采用南瓜作砧木，通過(guò)嫁接一定程度上避免了下胚軸徒長(zhǎng)的影響。已有研究大部分探究外部環(huán)境的生理生化指標(biāo)對(duì)黃瓜下胚軸徒長(zhǎng)的影響，例如光強(qiáng)、光質(zhì)、溫度和激素等[24-26]，下胚軸遺傳相關(guān)的內(nèi)容較少，鮮有與之相關(guān)的位點(diǎn)和基因。

苗晗等[13]通過(guò)QTL定位檢測(cè)到5個(gè)下胚軸長(zhǎng)度相關(guān)QTL，在Chr.5上標(biāo)記SSR15818和SSR06003之間檢測(cè)到3個(gè)QTL，總貢獻(xiàn)率高達(dá)61%；Chr.6上重復(fù)檢出兩個(gè)相鄰位點(diǎn)和。本研究在5號(hào)和6號(hào)染色體各兩次重復(fù)檢測(cè)到1個(gè)位點(diǎn)和，但是物理位置相差較大，不是同一個(gè)位點(diǎn)。（）是生長(zhǎng)素信號(hào)通路因子，參與生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)，可能通過(guò)生長(zhǎng)素途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育，進(jìn)而調(diào)控下胚軸的長(zhǎng)度。

3.3 黃瓜下胚軸長(zhǎng)度候選基因挖掘

光形態(tài)發(fā)生是一個(gè)關(guān)鍵的植物發(fā)育過(guò)程。Bo等[12]從半野生西雙版納黃瓜中克隆了短下胚軸的基因SHORT HYPOCOTYL1（），該基因編碼SMARCA3染色質(zhì)重塑因子，它通過(guò)與CsHY5進(jìn)行互作間接調(diào)控細(xì)胞伸長(zhǎng)相關(guān)基因的表達(dá)，最終影響黃瓜下胚軸的伸長(zhǎng)。位于3號(hào)染色體，本研究在16年春季和17年春季兩次均檢測(cè)到與該基因緊密連鎖的SNP（），相距僅50 kb，基本可以確定位點(diǎn)為。熒光定量結(jié)果顯示該基因在以西雙版納為代表的短下胚軸材料中表達(dá)量顯著下調(diào)。在擬南芥中，已證實(shí)轉(zhuǎn)錄因子ELONGATED HYPOCOTYL 5（）與組蛋白脫乙酰酶HDA15直接互作，降低組蛋白H4乙?；?，參與光形態(tài)發(fā)生以抑制下胚軸細(xì)胞伸長(zhǎng)[27-28]。本研究候選基因之一（）是HY5在黃瓜中的同源基因，在16年春季和17年秋季被兩次重復(fù)檢測(cè)到，且在短下胚軸材料中高表達(dá)，該基因極有可能通過(guò)參與光形態(tài)發(fā)生調(diào)控黃瓜下胚軸的長(zhǎng)度。

在17年春季、17年秋季和18年春季3次檢測(cè)到了.2，候選基因作為催化亞基和輔助性蛋白質(zhì)參與組蛋白等多種RNA的加工和降解[29]?；虻谋磉_(dá)模式分析顯示該基因在長(zhǎng)下胚軸材料中顯著高表達(dá)，很有可能作為各種信號(hào)通路的下游功能蛋白，影響細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育，進(jìn)而控制下胚軸長(zhǎng)度。SCAR 3（，）在擬南芥中則通過(guò)調(diào)控肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的方向來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞的大小[30]，主要表現(xiàn)在表皮毛和葉片的細(xì)胞中。在黃瓜中極有可能通過(guò)影響下胚軸細(xì)胞的大小來(lái)調(diào)控下胚軸的長(zhǎng)度。

秋季溫室通常是高溫高濕的育苗環(huán)境，下胚軸徒長(zhǎng)情況尤為嚴(yán)重，因此大量學(xué)者研究了高溫下黃瓜幼苗下胚軸長(zhǎng)度遺傳情況[6]。高溫情況下黃瓜幼苗下胚軸長(zhǎng)度均呈連續(xù)變異和正態(tài)分布，符合多基因控制的數(shù)量性狀遺傳規(guī)律；黃瓜幼苗在高溫下的下胚軸長(zhǎng)度符合2對(duì)加性-顯性-上位性主基因+加性-顯性多基因遺傳模型[8]。本研究在17年秋恰好遇到了高溫高濕環(huán)境，絕大部分核心種質(zhì)下胚軸略有徒長(zhǎng)。僅17年秋檢測(cè)到的（在擬南芥中的同源基因參與蛋白質(zhì)泛素化的途徑，與逆境下的反應(yīng)有關(guān)。因此，該位點(diǎn)可能主要與高溫條件下黃瓜下胚軸的伸長(zhǎng)有關(guān)。

對(duì)候選基因的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，多次重復(fù)檢測(cè)到且表達(dá)量與表型一致的基因大多數(shù)是直接調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育，進(jìn)而可能直接調(diào)控下胚軸長(zhǎng)度的基因。而其他基因多是光形態(tài)建成、泛素化、生長(zhǎng)素信號(hào)通路等轉(zhuǎn)錄因子，推測(cè)應(yīng)該是感知環(huán)境因素的調(diào)控基因，只在特定的環(huán)境誘導(dǎo)下表達(dá)，調(diào)控下游細(xì)胞發(fā)育相關(guān)基因，進(jìn)而調(diào)控下胚軸長(zhǎng)度。長(zhǎng)下胚軸組與短下胚軸組相比，基因表達(dá)量趨勢(shì)與表型大致相同，但也有一兩個(gè)材料不相符，鑒于下胚軸長(zhǎng)度是數(shù)量性狀，可能是缺失該位點(diǎn)導(dǎo)致，說(shuō)明這些基因不同程度地參與了下胚軸長(zhǎng)度的調(diào)控。多基因在不同黃瓜材料中的有機(jī)分布，決定了不同的下胚軸長(zhǎng)度，形成了具有不同下胚軸長(zhǎng)度的黃瓜種質(zhì)。

4 結(jié)論

采用MLM模型分析在4個(gè)季節(jié)中共檢測(cè)到8個(gè)與黃瓜下胚軸長(zhǎng)度顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)，分別位于1、2、3、4、5、6號(hào)染色體。其中兩次以上重復(fù)檢測(cè)到的位點(diǎn)共5個(gè)。通過(guò)分析關(guān)聯(lián)SNP位點(diǎn)的LD區(qū)間序列，找到8個(gè)與黃瓜下胚軸長(zhǎng)度有關(guān)的候選基因。調(diào)控黃瓜下胚軸長(zhǎng)度的候選基因功能多樣，既有光形態(tài)建成、泛素化、激素信號(hào)通路等調(diào)控基因，也有調(diào)控網(wǎng)絡(luò)下游的功能基因，參與細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育，調(diào)節(jié)細(xì)胞大小，直接調(diào)控黃瓜下胚軸的長(zhǎng)度。

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GWAS Analysis of Hypocotyl Length and Candidate Gene Mining in Cucumber Seedlings

CAI HeXu, BO KaiLiang, ZHOU Qi, MIAO Han, DONG ShaoYun, GU XingFang, ZHANG ShengPing

(Institute of Vegetables and Flowers, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081)

【】The aim of this study was to identify SNP loci and candidate genes significantly correlated with cucumber hypocotyl length trait, which could provide a theoretical basis for revealing the genetic basis and molecular mechanism of cucumber hypocotyl length trait, and lay a foundation for marker-assisted selection breeding of cucumber hypocotyl length trait.【】The natural population including 95 cucumber germplasm was employed in this study, and seedlings were grown in the plastic house in Nankou Experimental Field of Chinese Academy of Agricultural Sciences in spring 2016, spring 2017, autumn 2017 and spring 2018, respectively. The hypocotyl length was measured at the two true leaves stage. Structure 2.3.4 software was used to analyze the population structure, and Haploview software was used to analyze the attenuation of linkage imbalance. Then, the whole genome association analysis of hypocotyl length was carried out based on the optimal model. The important candidate genes related to hypocotyl length were predicted according to the LD interval sequence of the associated SNP loci, and the expression pattern of candidate genes were performed by fluorescence quantitative PCR. 【】A total of 8 loci, includingandwere detected on Chr. 1, 2, 3, 4 and 5, respectively. Five of them,and, were detected repeatedly in two or more different environments. By analyzing the LD interval sequences of the associated SNP loci, eight candidate genes,and, were predicted, which were related to cucumber hypocotyl length. Some of the candidate genes involved in regulating plant photomorphogenesis, ubiquitination, and hormone signaling pathway. And some of them were downstream genes regulating cell growth, development and cell size, thus they directly regulated hypocotyl length. Thus, the varied distribution of above genes in different cucumber materials resulted in the different hypocotyl length cucumber germplasm. The organic distribution of polygenes in different cucumber materials formed cucumber germline with different Hypocotyl length. Gene expression analysis showed that,,,andwere highly expressed in short hypocotyl materials andandwere highly expressed in long hypocotyl materials.【】Eight SNP loci linked with hypocotyl length,and, were detected in this study. Eight candidate genes regulating hypocotyl length were predicted, including,,,,,,and.

cucumber; hypocotyl length; genome-wide association study; candidate gene

10.3864/j.issn.0578-1752.2020.01.012

2019-07-24；

2019-09-16

國(guó)家自然科學(xué)基金（31701929）、中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（Y2017PT52）

蔡和序，E-mail：82101172229@caas.cn。薄凱亮，E-mail：bokailiang@caas.cn。蔡和序和薄凱亮為同等貢獻(xiàn)作者。通信作者張圣平，E-mail：zhangshengping@caas.cn。通信作者顧興芳，E-mail：guxingfang@caas.cn

（責(zé)任編輯 趙伶俐）