Tribbles同源蛋白3抑制人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成脂向分化

白向松，呂瓏薇，周永勝

(北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院 ·口腔醫(yī)院，修復(fù)科 國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 口腔數(shù)字化醫(yī)療技術(shù)和材料國家工程實(shí)驗(yàn)室 口腔數(shù)字醫(yī)學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081)

近年來，因腫瘤、外傷、先天畸形等原因?qū)е碌能浗M織缺損是臨床常見的疾病類型，并逐漸引起人們的重視。脂肪組織工程是目前治療軟組織缺損的前沿治療方法[1]。1999年，Patrick等[2]以復(fù)合聚乙醇酸為支架，運(yùn)用前脂肪細(xì)胞成功實(shí)現(xiàn)脂肪再生，為脂肪組織工程臨床轉(zhuǎn)化奠定了前期研究基礎(chǔ)。種子細(xì)胞、成脂誘導(dǎo)因子和支架材料是脂肪組織工程的三大要素[3-4]。運(yùn)用脂肪組織工程可以有效避免假體植入帶來的受體免疫排斥反應(yīng)，并且相比于傳統(tǒng)自體軟組織皮瓣移植，具有無需損傷自身供區(qū)組織的明顯優(yōu)勢。2001年，Zuk等[5-6]報(bào)道了脂肪提取(processed lipoaspirate, PLA)細(xì)胞中存在一種來源于間充質(zhì)、具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞，即人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(human adipose-derived mesenchymal stem cells, hASCs)。hASCs具有多系分化潛能，可以通過抽吸脂肪技術(shù)大量獲得， 在脂肪組織工程中具有重要應(yīng)用前景[6-8]。明確hASCs成脂向分化過程中的重要調(diào)控因子，并探索促進(jìn)hASCs的成脂向分化的新途徑，將為實(shí)現(xiàn)以hASCs為基礎(chǔ)的脂肪組織工程的臨床轉(zhuǎn)化提供重要理論基礎(chǔ)。

Tribbles同源蛋白3(Tribbles pseudokinase 3, TRIB3)是假性蛋白激酶Tribbles同源蛋白家族成員，其編碼基因位于人類染色體20p13-p12.2。TRIB3之所以被歸為假性激酶，是因其中心激酶樣結(jié)構(gòu)域雖與絲/蘇氨酸蛋白激酶結(jié)構(gòu)域相似，但卻在重要催化位點(diǎn)存在氨基酸替代，導(dǎo)致TRIB3缺少經(jīng)典激酶結(jié)合Mg2+的天冬氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸氨基酸殘基(Asp168-Phe169-Gly170, DFG)結(jié)構(gòu)域,并缺少與三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)結(jié)合的富甘氨酸環(huán)[9]。與此同時(shí)，TRIB3中心激酶樣結(jié)構(gòu)域內(nèi)仍存在賴氨酸殘基ATP結(jié)合域以及天冬氨酸殘基催化域，作為假性激酶雖然其激酶活性較低，但卻能與蛋白激酶Akt、活化轉(zhuǎn)錄因子4、CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合同源蛋白、核因子κB等結(jié)合，在多個(gè)重要分子生物學(xué)通路中起到重要調(diào)控作用，將體內(nèi)平衡與代謝性疾病聯(lián)系起來，因此被認(rèn)為是體內(nèi)重要的“應(yīng)激調(diào)控開關(guān)”[9-10]。目前研究證實(shí)，TRIB3在糖尿病、高脂血癥、動(dòng)脈粥樣硬化、阿爾茲海默病以及腫瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用[11-14]。TRIB3參與脂代謝調(diào)節(jié)，抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞成脂分化和成熟脂肪細(xì)胞中的脂肪堆積，是研究肥胖、高脂血癥等多種脂代謝異常疾病發(fā)病機(jī)制和治療的重要方向[15-17]，但TRIB3在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的潛在應(yīng)用價(jià)值目前仍缺乏報(bào)道。

TRIB3參與糖代謝、脂代謝等重要生物學(xué)過程，作為調(diào)節(jié)體內(nèi)平衡的重要調(diào)控因子，其對間充質(zhì)干細(xì)胞分化的影響，尤其是TRIB3對hASCs分化的影響尚未見報(bào)道，因此，本研究旨在明確TRIB3在hASCs成脂向分化中的調(diào)控作用，通過敲低和過表達(dá)TRIB3，研究TRIB3對hASCs成脂向分化能力的影響，明確TRIB3在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的潛在應(yīng)用價(jià)值，為軟組織缺損的治療提供了新靶點(diǎn)與新思路。

1 資料與方法

1.1 hASCs

原代hASCs購自美國ScienCell公司，貨號7510，本研究采用三株來源于不同供體的hASCs，批號分別為8278、11537、19882，傳代培養(yǎng)至第2代用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 試劑與材料

改良Eagle培養(yǎng)基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium, DMEM)、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、青-鏈霉素雙抗、胰蛋白酶購自美國Gibco公司。細(xì)胞培養(yǎng)皿等耗材來自蘇州海貍生物醫(yī)學(xué)工程有限公司。油紅O染色粉劑(O8010)購自北京索萊寶科技有限公司。TRIzolTM試劑購自Invitrogen公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本Takara Bio公司。放射免疫沉淀測定(radioimmune precipitation assay, RIPA)裂解液購自北京華興博創(chuàng)公司，蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(phennylmethanesulfonyl fluoride, PMSF，101594297)購自美國Sigma公司。鼠源抗人TRIB3抗體(sc-271572)購自美國Santa Cruz公司，兔源抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)抗體(HX1832)購自北京華興博創(chuàng)公司，山羊抗兔免疫球蛋白G(immunoglobulin G, IgG，ZB-2301)、抗鼠IgG(ZB-2305)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)蛋白定量試劑盒(23228)購自美國Thermo Scientific公司。

1.3 hASCs體外培養(yǎng)和成脂誘導(dǎo)

hASCs 培養(yǎng)于含5%(體積分?jǐn)?shù))CO2+ 95%(體積分?jǐn)?shù))空氣的37 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中。增殖培養(yǎng)基(proliferation medium, PM)成分為：DMEM培養(yǎng)基+10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)+ 1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))青-鏈霉素， 2 d更換一次培養(yǎng)基，7 d左右細(xì)胞生長至70%～80%匯合狀態(tài)，隨后進(jìn)行細(xì)胞傳代。每個(gè)培養(yǎng)皿(直徑10 cm)中的細(xì)胞經(jīng)胰酶消化、培養(yǎng)基中和、離心、重懸后，接種至3個(gè)培養(yǎng)皿(直徑10 cm)， 6～7 d匯合度達(dá)到80%～90%，再次進(jìn)行傳代。hASCs生長至70%～80%匯合度后加入成脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)基(adipogenic medium, AM)， 成分為：DMEM + 10%(體積分?jǐn)?shù))FBS + 0.5 mmol/L 異丁基黃嘌呤+1 μmol/L 地塞米松+10 μmol/L 胰島素 + 200 μmol/L 吲哚美辛 + 1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))青-鏈霉素。根據(jù)是否進(jìn)行成脂誘導(dǎo)，hASCs分為成脂誘導(dǎo)組(AM組)和增殖培養(yǎng)組(PM組)。

1.4 慢病毒轉(zhuǎn)染hASCs

設(shè)計(jì)四組慢病毒序列，分別為TRIB3敲低(shTRIB3)及其對照(sh-NC)、TRIB3過表達(dá)(TRIB3 overexpression，TRIB3-over)及其對照(NC over-expression，NC-over)， 慢病毒訂購于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，轉(zhuǎn)染hASCs P2細(xì)胞。轉(zhuǎn)染條件為：慢病毒滴度為5×108TU/mL，慢病毒用量0.1 mL，轉(zhuǎn)染細(xì)胞量為1×106個(gè)，轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)(multiple of infection, MOI)= 50，加入終濃度是5 mg/L的嘌呤霉素(polybrene)增強(qiáng)轉(zhuǎn)染效率。24 h后將慢病毒液更換為新鮮的增殖培養(yǎng)基。慢病毒包裝堿基序列信息見表1。

由于慢病毒攜帶的質(zhì)粒載體中含有綠色熒光蛋白和抗嘌呤霉素基因，故轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)基中均加入1 mg/L的嘌呤霉素進(jìn)行篩選，轉(zhuǎn)染后3 d于倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光，評估轉(zhuǎn)染效率。慢病毒轉(zhuǎn)染效果評價(jià)包括shTRIB3、TRIB3-over轉(zhuǎn)染hASCs 后，各自mRNA 和蛋白水平的表達(dá)情況，分別采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)和Western blot實(shí)驗(yàn)檢測。所有細(xì)胞實(shí)驗(yàn)均重復(fù)至少三次。

1.5 油紅O染色及定量

hASCs培養(yǎng)于六孔板中，成脂誘導(dǎo)14 d、21 d，10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))甲醛固定1 h；棄甲醛，PBS沖洗3遍，60%(體積分?jǐn)?shù))異丙醇潤洗、晾干。用100%(體積分?jǐn)?shù))異丙醇配制0.35%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的油紅O儲存液，以3 ∶2(油紅O儲存液 ∶雙蒸水)的比例稀釋儲存液，配制成油紅O工作液?？装鍍?nèi)加入油紅O染色工作液，室溫避光放置10～15 min，棄染液，在顯微鏡下觀察、拍照。以胞漿中出現(xiàn)紅染脂滴判斷染色為陽性。向染色后的各孔板中加入等量100%異丙醇將油紅O染色溶解，室溫放置1 h，于500 nm波長下測量光密度值，進(jìn)行油紅O染色定量分析。

1.6 qRT-PCR

TRIzolTM提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以SYBR GREEN進(jìn)行qRT-PCR，檢測成脂相關(guān)基因和TRIB3的mRNA表達(dá)，引物序列見表2。采用ΔΔCt 法分析數(shù)據(jù)，以GAPDH作為內(nèi)參照。

1.7 Western blot

用含蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(phennylmethanesulfonyl fluoride, PMSF)的放射免疫沉淀測定(radioimmune precipitation assay, RIPA)裂解液提取細(xì)胞總蛋白，總蛋白定量按照美國Thermo公司二辛可寧酸(bicinchonininc acid, BCA)定量檢測試劑盒說明書進(jìn)行。蛋白樣品中加入上樣緩沖液，煮沸，電泳。濃縮膠80 V，進(jìn)入分離膠后改為120 V。100 V恒壓轉(zhuǎn)膜 2.5 h。5%牛奶(質(zhì)量分?jǐn)?shù))室溫封閉1 h。將一抗按照體積比1 ∶1 000稀釋，4 ℃孵育過夜。TBST洗3次后，加入對應(yīng)的二抗，室溫孵育1 h。TBST洗3次后，顯色、曝光。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

運(yùn)用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。比較兩組間結(jié)果采用t檢驗(yàn)，P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以3次重復(fù)結(jié)果的均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來表示。

表1 慢病毒堿基序列Table 1 Packaging base sequences of lentiviruses

表2 qRT-PCR引物序列Table 2 Primer sequences used for quantitative real-time PCR

GAPDH，glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase；TRIB3，Tribbles pseudokinase 3；PPARγ，peroxisome proliferator-activated receptor γ；C/EBPα，CCAAT/enhancer binding protein α；LPL，lipoprotein lipase；CD36，cluster of differentiation 36.

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建TRIB3敲低的hASCs細(xì)胞系

構(gòu)建TRIB3敲低(shTRIB3)及對照(sh-NC)hASCs細(xì)胞系，慢病毒轉(zhuǎn)染后3 d在倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白強(qiáng)度及分布，轉(zhuǎn)染效率約為80%(圖1A)。shTRIB3細(xì)胞TRIB3mRNA表達(dá)量較sh-NC細(xì)胞下降84.3%(P<0.01，圖1B)，TRIB3蛋白表達(dá)也顯著下降(圖1C)，表明成功構(gòu)建了TRIB3敲低的hASCs細(xì)胞系。

2.2 敲低TRIB3促進(jìn)hASCs成脂向分化

油紅O染色可見，成脂誘導(dǎo)14 d和21 d，shTRIB3細(xì)胞較sh-NC細(xì)胞胞漿內(nèi)紅色脂滴明顯增多(圖2A)；定量結(jié)果顯示shTRIB3油紅O著色較sh-NC顯著增多(P<0.01，圖2B)。成脂誘導(dǎo)7 d和14 d，qRT-PCR檢測成脂分化相關(guān)基因PPARγ、CD36和C/EBPα表達(dá)水平，結(jié)果顯示shTRIB3較sh-NC成脂相關(guān)基因表達(dá)顯著升高(P<0.01, 圖2C)， 因此，敲低TRIB3促進(jìn)hASCs成脂向分化。

2.3 構(gòu)建TRIB3過表達(dá)的hASCs細(xì)胞系

將TRIB3過表達(dá)(TRIB3-overexpression, TRIB3-over)及其對照組(NC-overexpression, NC-over)慢病毒轉(zhuǎn)染hASCs，轉(zhuǎn)染后3 d在倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染質(zhì)粒中綠色熒光蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)情況，估計(jì)轉(zhuǎn)染效率達(dá)70%左右(圖3A)。qRT-PCR檢測證實(shí)，過表達(dá)組TRIB3mRNA表達(dá)量較NC-over組增高約1.6倍(P<0.01, 圖3B)， TRIB3蛋白表達(dá)也顯著升高，表明成功構(gòu)建了TRIB3過表達(dá)的hASCs細(xì)胞系(圖3C)。

2.4 過表達(dá)TRIB3抑制hASCs成脂向分化

成脂誘導(dǎo)14 d和21 d(圖4A)，油紅O染色可見TRIB3-over細(xì)胞較NC-over細(xì)胞胞漿內(nèi)紅色脂滴明顯減少；定量結(jié)果同樣顯示TRIB3-over油紅O著色較NC-over顯著下降(P<0.01，圖4B)。成脂誘導(dǎo)14 d和21 d，qRT-PCR檢測成脂分化相關(guān)基因PPARγ、CD36和LPL表達(dá)水平，可見TRIB3-over較NC-over成脂相關(guān)基因表達(dá)顯著降低(P<0.01，圖4C)，因此，過表達(dá)TRIB3抑制hASCs成脂向分化。

3 討論

脂肪組織工程是修復(fù)軟組織缺損的前沿治療方法。當(dāng)前，脂肪組織工程開展的主要方法包括，支架引導(dǎo)、復(fù)合物注射、破碎網(wǎng)膜引導(dǎo)和從頭合成脂肪再生[18]。種子細(xì)胞是脂肪組織工程的重要組成部分。hASCs具有較強(qiáng)的增殖能力和多系分化潛能，且取材簡易，來源豐富，是較為理想的種子細(xì)胞類型[7,19]。然而，在脂肪再生的研究中，hASCs也存在一些尚未解決的問題，包括隨著體外增殖和成脂誘導(dǎo)時(shí)間的延長，hASCs成脂分化能力逐漸減弱，新生脂肪量較少，不能滿足脂肪組織重建的要求[20-21]。因此，如何提高h(yuǎn)ASCs成脂分化能力是基于hASCs的脂肪組織工程脂肪再生研究的重要內(nèi)容[22-24]。

TRIB3在糖代謝、脂代謝等重要生物學(xué)過程中起到重要作用[25-26]。TRIB3在糖代謝中的作用表現(xiàn)為TRIB3高表達(dá)導(dǎo)致胰島素抵抗，其作用機(jī)制與Akt通路相關(guān)。作為假性激酶，TRIB3可與Akt的絲氨酸(Ser)473位點(diǎn)和蘇氨酸(Thr)308位點(diǎn)直接結(jié)合，抑制Akt在Ser473位點(diǎn)的磷酸化，從而抑制Akt活性。Akt起到糖攝入時(shí)抑制肝糖原釋放的重要作用；空腹時(shí)，TRIB3對Akt活性的抑制促進(jìn)肝糖原釋放[27-28]，病理狀態(tài)下TRIB3的過度高表達(dá)導(dǎo)致肝糖原分解過多，進(jìn)一步加重高血糖與胰島素抵抗現(xiàn)象，因此發(fā)揮對胰島素作用的抑制作用[29]。胰島素可以促進(jìn)前脂肪細(xì)胞成脂分化和成熟脂肪細(xì)胞中的脂肪堆積，TRIB3對胰島素代謝的抑制作用導(dǎo)致其對脂肪代謝過程也起到抑制作用[15],因此，TRIB3在脂代謝和脂肪細(xì)胞分化過程中的作用與其在胰島素代謝中的作用有關(guān)。

TRIB3作為調(diào)節(jié)體內(nèi)平衡的重要調(diào)控因子，有望成為調(diào)控hASCs成脂向分化的重要靶點(diǎn)，但TRIB3對hASCs成脂向分化影響的研究尚未見報(bào)道。本研究通過慢病毒轉(zhuǎn)染建立了穩(wěn)定敲低、過表達(dá)TRIB3的hASCs細(xì)胞系。通過油紅O定性染色、油紅O定量和qRT-PCR等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在成脂誘導(dǎo)條件下，敲低TRIB3可以顯著促進(jìn)hASCs成脂向分化，過表達(dá)TRIB3抑制hASCs成脂向分化，明確了TRIB3在hASCs成脂向分化中的重要作用?，F(xiàn)有的研究顯示，多種信號通路參與調(diào)節(jié)hASCs的譜系定向分化，hASCs成脂向分化與成骨向分化存在一定的拮抗關(guān)系[30-33]，因此，在hASCs成脂分化能力受到抑制的同時(shí)，其成骨分化能力可能增強(qiáng)，這一趨勢有待進(jìn)一步的深入研究。TRIB3影響hASCs成脂分化的具體分子機(jī)制還有待進(jìn)一步探索。既往研究揭示了PPARγ是TRIB3參與脂代謝調(diào)節(jié)和前脂肪細(xì)胞分化的重要調(diào)控分子。在本實(shí)驗(yàn)中，未成脂誘導(dǎo)時(shí)，過表達(dá)TRIB3組(TRIB3-over)較對照組(NC-over)PPARγ表達(dá)明顯下降；成脂誘導(dǎo)后，敲低TRIB3組(shTRIB3)較對照組(sh-NC)PPARγ表達(dá)顯著升高，過表達(dá)TRIB3組(TRIB3-over)較對照組(NC-over)PPARγ表達(dá)明顯下降。這一研究結(jié)果提示TRIB3參與調(diào)節(jié)hASCs成脂向分化的分子機(jī)制很可能與PPARγ通路相關(guān)，為下一步的深入研究提供了方向。

TRIB3在脂肪細(xì)胞正常成脂分化過程中表達(dá)水平的變化是研究其在脂肪細(xì)胞分化中作用的重要組成部分。研究發(fā)現(xiàn)[17, 34]，3T3-L1前脂肪細(xì)胞細(xì)胞分化成熟過程中TRIB3蛋白表達(dá)呈現(xiàn)與mRNA不同的變化趨勢。在成脂向分化過程中TRIB3mRNA水平呈現(xiàn)先下降后上升的變化趨勢。未經(jīng)成脂誘導(dǎo)時(shí)(成脂誘導(dǎo)0 d)TRIB3mRNA水平較高，約為前脂肪細(xì)胞中TRIB3mRNA最大表達(dá)量的40%，0 d到2 dTRIB3mRNA逐漸減少，其后隨著成脂誘導(dǎo)時(shí)間延長，直至成脂誘導(dǎo)14 dTRIB3mRNA水平保持穩(wěn)定上升。另一方面，TRIB3蛋白0 d水平較低，成脂分化過程中表達(dá)始終穩(wěn)定上升。TRIB3蛋白與mRNA水平表達(dá)變化趨勢的區(qū)別提示，3T3-L1前脂肪細(xì)胞細(xì)胞中TRIB3表達(dá)可能存在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制。

事實(shí)上，TRIB3作為體內(nèi)重要的平衡調(diào)節(jié)因子，其轉(zhuǎn)錄后調(diào)控存在多種形式。有關(guān)TRIB3的上游調(diào)控機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，TRIB3是血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)中miR-24[35-36]、miR-96[10,37]的有效靶點(diǎn)。miR-24、miR-96可與TRIB3轉(zhuǎn)錄本的3′非編碼區(qū)(3′-untranslated region, 3′-UTR)的不同位點(diǎn)相結(jié)合，抑制TRIB3蛋白表達(dá)。此外，在一項(xiàng)關(guān)于Jurkat T細(xì)胞的研究中，通過基因芯片技術(shù)篩選出miR-219-5p可與TRIB3靶向結(jié)合，抑制TRIB3表達(dá)[38]。針對非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)的研究發(fā)現(xiàn)，miR-124可直接靶向抑制TRIB3表達(dá)，在NAFLD發(fā)病機(jī)制中起到重要作用[39],因此，多種miRNAs可與TRIB3靶向結(jié)合，抑制TRIB3表達(dá)，在多種生物學(xué)過程中起到重要作用。目前，尚沒有研究報(bào)道hASCs中miRNAs對TRIB3的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，能否通過調(diào)控hASCs中miRNAs水平調(diào)節(jié)TRIB3表達(dá)，并進(jìn)一步促進(jìn)hASCs成脂向分化，具有重要研究意義。更深入的研究有必要通過基因芯片、雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)等多種實(shí)驗(yàn)方法，發(fā)現(xiàn)、驗(yàn)證hASCs中與TRIB3靶向作用的調(diào)控分子，并明確miRNAs與TRIB3相互作用對hASCs成脂向分化的影響。