• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    應(yīng)用PBL教學(xué)法實(shí)例講解如何發(fā)現(xiàn)引物污染

    2022-07-14 08:44:10孔亞林戴競耀劉承利
    檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床 2022年13期
    關(guān)鍵詞:污染源空白對照核酸

    王 成,趙 剛,孔亞林,蒲 猛,戴競耀,劉承利△

    空軍特色醫(yī)學(xué)中心:1.肝膽外科;2.外科學(xué)教研室,北京 100142

    隨著生物科技的發(fā)展,以聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)為主的核酸試驗(yàn)應(yīng)用越來越廣泛[1],實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制和生物安全是PCR技術(shù)初學(xué)者應(yīng)掌握的重要內(nèi)容[2]。不論是中學(xué)、大學(xué)實(shí)驗(yàn)課的學(xué)生還是實(shí)驗(yàn)技術(shù)方面的初學(xué)者對避免核酸污染等質(zhì)量控制的意識(shí)均不強(qiáng)。由于PCR耗時(shí)較長,注意力不易集中[3],容易受核酸污染,必須設(shè)計(jì)空白對照才能及時(shí)發(fā)現(xiàn)假陽性結(jié)果[4],但枯燥的理論講解學(xué)生不易接受,教學(xué)效果不好。以問題為基礎(chǔ)(PBL)教學(xué)法是一種基于“問題”為中心的教學(xué)模式,是目前國際上較為流行的一種教學(xué)法。案例選擇和問題設(shè)計(jì)是PBL教學(xué)法的主要切入點(diǎn),對初學(xué)者理解抽象問題非常有幫助。本文圍繞在一次PCR教學(xué)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)空白對照管中有核酸污染的實(shí)例,遂把PBL教學(xué)法應(yīng)用于枯燥的對照重復(fù)試驗(yàn),理清了發(fā)現(xiàn)和判定核酸污染來源的過程,學(xué)生們反映教學(xué)效果很好,理解較為深刻。

    1 資料與方法

    1.1 學(xué)生情況及試驗(yàn)事件 小班教學(xué),學(xué)生5人,教學(xué)過程發(fā)現(xiàn)空白對照管有核酸擴(kuò)增,于是采用PBL教學(xué)法[5],以實(shí)例為引導(dǎo),設(shè)計(jì)教學(xué)試驗(yàn),結(jié)合實(shí)際圖表,啟發(fā)學(xué)生分層思維,最終引導(dǎo)學(xué)生們找到污染源。

    1.2 一般資料 組織來源為6份液氮凍存的SD大鼠肝臟組織。大鼠來源的Yes 相關(guān)蛋白(YAP)引物兩種,分別由美國Invitrogen和中國上海生工公司設(shè)計(jì)合成,均具有較好的特異性。

    1.3 儀器與試劑 熒光定量PCR儀為Roche Light Cycle (2.0)系統(tǒng),軟件版本3.5。采用Trizol 總RNA試劑提取總RNA,取材器械、凍存管及雙蒸水(ddH2O)均經(jīng)1%二乙基焦碳酸酯水處理。反轉(zhuǎn)錄試劑盒(DRR03S)及熒光定量PCR試劑盒(DRR041S)均購自TaKaRa寶生物工程大連有限公司。

    1.4 方法 PBL教學(xué)法采用案例選擇、問題設(shè)計(jì)、思維導(dǎo)圖、情景教學(xué)等,以實(shí)例為線索,以學(xué)生為主導(dǎo)。

    1.5 試驗(yàn)技術(shù)方法 RNA 提取應(yīng)用Trizol、氯仿、異丙醇提取,75%乙醇洗滌RNA沉淀。應(yīng)用凝膠電泳法(瓊脂糖)鑒定RNA未被降解,以紫外分光光度計(jì)對RNA樣品進(jìn)行純度分析和定量。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA按試劑盒配制反應(yīng)體系。

    1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Light Cycler 數(shù)據(jù)分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。直觀比較Ct值[6],Ct值越大,起始模板數(shù)越低。

    2 結(jié) 果

    2.1 以實(shí)例為引導(dǎo),使學(xué)生直觀認(rèn)識(shí)什么是核酸污染 PCR擴(kuò)增試驗(yàn)結(jié)束后發(fā)現(xiàn)“空白對照管”的反應(yīng)曲線清晰可見,說明該反應(yīng)體系內(nèi)有核酸擴(kuò)增,可推斷空白對照管反應(yīng)體系內(nèi)存在核酸污染。通過反應(yīng)曲線圖學(xué)生們對“假陽性”有了直觀認(rèn)識(shí)。

    2.2 問題出在哪里?引導(dǎo)學(xué)生自問自答 空白對照管中含有3種成分:ddH2O、引物及PCR試劑,其中ddH2O的配制、分裝、加樣過程操作較多,比較容易污染,而且ddH2O較引物和PCR試劑更容易獲取,應(yīng)作為首先排除對象。

    2.3 與學(xué)生一道設(shè)計(jì)驗(yàn)證試驗(yàn) 選用新的ddH2O作為對照,重復(fù)試驗(yàn),同時(shí)原ddH2O同步參與重復(fù)試驗(yàn),試驗(yàn)反應(yīng)條件不變,引物不變,挑選擴(kuò)增曲線較好的7號(hào)樣品作為cDNA模板,觀察在含新ddH2O的反應(yīng)體系中是否有核酸擴(kuò)增,結(jié)果見表1。通過比較PCR結(jié)束后的Ct值可比較反應(yīng)體系的起始模板核酸量,Ct值越大,核酸量越小。

    表1 重復(fù)試驗(yàn)1

    2.4 ddH2O污染的可能性很小 學(xué)生們一致認(rèn)為,B管和D管均無模板,但均有核酸擴(kuò)增,Ct值差別不大(即起始模板數(shù)差別不大),所以2個(gè)反應(yīng)體系均有核酸污染,且污染程度相近。因B、D這2管分別為不同的ddH2O,2次配制的ddH2O均有污染的可能性較小。特別是B、D這2管的Ct值相近,污染程度相同,故暫不考慮污染源是ddH2O。另外,學(xué)生們認(rèn)為,A管和C管有相等數(shù)量模板,ddH2O不同,因Ct值差別不大,說明起始模板數(shù)差別不大,同樣說明2次配制的ddH2O無明顯差別。因此,前、后2次ddH2O均被污染的可能性均很小,綜合分析后考慮為ddH2O以外的試劑有污染。

    2.5 教員思維引導(dǎo),學(xué)生制訂方案 教員提示:試驗(yàn)所用引物一般來自2家公司,每次所用引物是經(jīng)過分裝的。學(xué)生們思考后認(rèn)為,分裝引物過程存在污染的可能,如需驗(yàn)證引物污染,可以選取未開封、未分裝的原引物。另外,可選用另一家公司的引物同時(shí)做對照,發(fā)現(xiàn)原引物出廠時(shí)已被污染。進(jìn)一步重復(fù)試驗(yàn),試驗(yàn)條件不變,目的是驗(yàn)證原分裝引物中是否有核酸污染。見表2。 Ct值很大說明起始模板的核酸量很小,Ct值為0.00,說明反應(yīng)體系內(nèi)不含核酸模板。

    表2 重復(fù)試驗(yàn)2

    2.6 引物1(首次試驗(yàn)分裝后的引物)為污染源 學(xué)生們逐條分析:H管含標(biāo)準(zhǔn)模板,擴(kuò)增同前,提示引物2可用。F管、G管無擴(kuò)增,說明ddH2O、PCR試劑、引物1′(新開封的引物1原裝液)及引物2(另一家引物公司設(shè)計(jì)及制備的引物)均無核酸污染。E管反應(yīng)體系未加入cDNA模板但仍有核酸擴(kuò)增,考慮引物1有污染,結(jié)合E管擴(kuò)增曲線Ct值遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于有標(biāo)準(zhǔn)模板擴(kuò)增的H管,說明起始模板數(shù)很小,這符合試驗(yàn)中引物加樣量較小的實(shí)際情況。全體學(xué)生一致認(rèn)為,分裝引物1內(nèi)的核酸污染是污染源,推測是引物分裝或加樣過程中污染。

    3 討 論

    在分子生物學(xué)教學(xué)實(shí)踐中,有關(guān)PCR中核酸污染的內(nèi)容是一個(gè)難點(diǎn)。在理論層面,學(xué)生們基本掌握核酸污染方式中最重要的是氣溶膠污染[7],因此,包括PCR在內(nèi)的核酸試驗(yàn)被要求在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行操作。在污染源分型上亦不難理解,常見污染類型包括:(1)標(biāo)本污染,包括收集標(biāo)本的容器污染,標(biāo)本密封不嚴(yán)造成交叉污染及核酸提取過程中吸樣槍污染。(2) PCR試劑污染[8],包括加樣槍、容器、ddH2O等溶液被PCR核酸模板污染。(3)PCR產(chǎn)物污染,有報(bào)道PCR產(chǎn)物污染離心機(jī),導(dǎo)致氣溶膠顆粒在離心機(jī)氣流作用下進(jìn)入到未蓋嚴(yán)的離心管中[9-10]。本文通過激發(fā)學(xué)生的逆向思維分析,主動(dòng)了解污染類型及污染可能來源,使孤立的試驗(yàn)方法變得系統(tǒng),使試驗(yàn)教學(xué)更生動(dòng)、高效,增強(qiáng)了學(xué)生的主動(dòng)性,提高了學(xué)習(xí)效率。

    教學(xué)中常常強(qiáng)調(diào)PCR污染的監(jiān)測可通過對照試驗(yàn)來實(shí)現(xiàn),陰性對照尤為重要,每次PCR務(wù)必做陰性對照,包括不加模板的空白對照、不加引物的空白對照及模板和引物均不加僅有試驗(yàn)試劑的空白對照等。但學(xué)生們沒有切身感受,常有僥幸心理,為了減少試驗(yàn)步驟、節(jié)省時(shí)間會(huì)省略部分甚至全部陰性對照的配制。本研究就是沒有設(shè)置無引物的對照,所以導(dǎo)致無法在發(fā)現(xiàn)假陽性的第一時(shí)間判斷污染的來源。

    本教學(xué)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)空白對照有DNA擴(kuò)增,污染來源不明,當(dāng)無法準(zhǔn)確判斷污染源時(shí)需進(jìn)一步設(shè)計(jì)對照試驗(yàn),以找出污染源。進(jìn)一步的試驗(yàn)仍需要設(shè)立空白對照,根據(jù)下一步試驗(yàn)結(jié)果確定或排除某類污染源,最后通過試驗(yàn)驗(yàn)證污染源。引物污染較隱蔽,對試驗(yàn)結(jié)果的影響容易被忽視,只有設(shè)立良好的空白對照,才能及時(shí)發(fā)現(xiàn)假陽性和判定假陽性的來源。引物污染具有不易被發(fā)現(xiàn)的特殊性[11-12],由于擔(dān)心原裝引物內(nèi)有污染,試驗(yàn)中學(xué)生們拓展思維,應(yīng)用了2個(gè)不同的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,一個(gè)是新開封的引物原裝液,另一個(gè)是另一家引物公司設(shè)計(jì)及制備的引物,從2個(gè)層級搜尋污染源,最終發(fā)現(xiàn)是分裝的引物內(nèi)有核酸污染,可能是在分裝過程或使用過程中被污染。這期間,學(xué)生參與了試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案,對設(shè)計(jì)過程及試驗(yàn)過程均透徹理解。

    教學(xué)中教員進(jìn)一步強(qiáng)調(diào),鑒于核酸污染的發(fā)生率較高,并且所導(dǎo)致的后果嚴(yán)重,PCR實(shí)驗(yàn)室內(nèi)應(yīng)采取相應(yīng)的措施防范污染。一些單位參照美國PDCA[P策劃(P)、實(shí)施(D)、檢查(C)、處置(A)]質(zhì)量管理循環(huán)體系,在控制實(shí)驗(yàn)室污染方面已經(jīng)取得明顯效果[13]。另外,通過加強(qiáng)PCR分析前的質(zhì)量控制[14]、對實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行環(huán)境監(jiān)測,均有利于提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性[15]。以上諸多措施均是避免PCR污染的有效方法,但如果不設(shè)空白對照卻無法發(fā)現(xiàn)污染源,如果空白對照不夠全面,亦無法判定污染來源??瞻讓φ盏脑O(shè)立是PCR發(fā)現(xiàn)和判定假陽性的關(guān)鍵,是避免試驗(yàn)結(jié)果受核酸污染影響的重要手段。

    PBL教學(xué)法的目的是提高學(xué)生發(fā)現(xiàn)問題、解決問題的能力,因此,設(shè)計(jì)問題要緊密結(jié)合PCR的實(shí)際,由淺入深、層層推進(jìn),讓學(xué)生能夠思路清晰、邏輯清楚地完成實(shí)驗(yàn)流程,從而解決試驗(yàn)中的問題。本文應(yīng)用PBL教學(xué)法加實(shí)例教學(xué),把復(fù)雜的

    PCR污染問題逐步轉(zhuǎn)化為層次分明、邏輯清楚的科學(xué)問題,突破傳統(tǒng)教學(xué)模式。在試驗(yàn)教學(xué)過程中,教師由知識(shí)的傳授者轉(zhuǎn)變?yōu)檫壿嫹治龅囊龑?dǎo)者,通過學(xué)生自主學(xué)習(xí)和理解解決疑難問題。

    猜你喜歡
    污染源空白對照核酸
    測核酸
    中華詩詞(2022年9期)2022-07-29 08:33:50
    全員核酸
    中國慈善家(2022年3期)2022-06-14 22:21:55
    第一次做核酸檢測
    快樂語文(2021年34期)2022-01-18 06:04:14
    持續(xù)推進(jìn)固定污染源排污許可管理全覆蓋
    核酸檢測
    中國(俄文)(2020年8期)2020-11-23 03:37:13
    例析陰性對照與陽性對照在高中生物實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的應(yīng)用
    過表達(dá)H3K9me3去甲基化酶對豬克隆胚胎體外發(fā)育效率的影響(內(nèi)文第 96 ~ 101 頁)圖版
    基于污染源解析的空氣污染治理對策研究
    十二五”期間佳木斯市污染源排放狀況分析
    Identifying vital edges in Chinese air route network via memetic algorithm
    黄色成人免费大全| 国产成人欧美在线观看| 久久久久九九精品影院| 精品久久久久久久毛片微露脸| 国产91精品成人一区二区三区| 新久久久久国产一级毛片| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 97人妻天天添夜夜摸| www日本在线高清视频| 国产激情欧美一区二区| 欧美日本亚洲视频在线播放| 美女国产高潮福利片在线看| 精品卡一卡二卡四卡免费| 淫妇啪啪啪对白视频| 国产片内射在线| 多毛熟女@视频| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 最新在线观看一区二区三区| 在线观看日韩欧美| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 亚洲av熟女| 大型av网站在线播放| 一级片免费观看大全| 久久久久久久久久久久大奶| 最近最新中文字幕大全免费视频| 日韩欧美免费精品| 中文字幕人妻丝袜制服| 成在线人永久免费视频| 日本精品一区二区三区蜜桃| 国产精品国产av在线观看| avwww免费| 精品国产亚洲在线| 色综合婷婷激情| e午夜精品久久久久久久| 真人一进一出gif抽搐免费| 亚洲人成电影观看| a在线观看视频网站| 99riav亚洲国产免费| 在线观看免费日韩欧美大片| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 麻豆av在线久日| 国产黄色免费在线视频| 亚洲一码二码三码区别大吗| 最近最新中文字幕大全免费视频| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 91字幕亚洲| 男人舔女人的私密视频| 欧美一区二区精品小视频在线| 亚洲熟女毛片儿| 欧美精品亚洲一区二区| 激情在线观看视频在线高清| 手机成人av网站| 色老头精品视频在线观看| 欧美激情久久久久久爽电影 | 午夜日韩欧美国产| 麻豆一二三区av精品| 亚洲色图综合在线观看| 久久 成人 亚洲| 亚洲av片天天在线观看| 亚洲av片天天在线观看| 亚洲午夜理论影院| 9191精品国产免费久久| 午夜福利影视在线免费观看| 亚洲av片天天在线观看| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 精品卡一卡二卡四卡免费| 成人精品一区二区免费| 久久精品国产综合久久久| 亚洲av成人一区二区三| 韩国av一区二区三区四区| 无限看片的www在线观看| 精品久久久精品久久久| 国产熟女xx| 超碰成人久久| 欧美国产精品va在线观看不卡| 国产免费男女视频| 高清欧美精品videossex| 亚洲国产精品合色在线| 水蜜桃什么品种好| 国产精品亚洲一级av第二区| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 亚洲欧美激情在线| 丰满饥渴人妻一区二区三| 国产一区二区三区视频了| 亚洲精品国产区一区二| 亚洲全国av大片| 亚洲成人免费av在线播放| 午夜影院日韩av| av在线播放免费不卡| 免费av毛片视频| 99热只有精品国产| 国产一区二区三区综合在线观看| 国产三级黄色录像| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 久久久久久大精品| 精品免费久久久久久久清纯| 欧美在线一区亚洲| 视频在线观看一区二区三区| 国产欧美日韩一区二区精品| 国产麻豆69| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 又紧又爽又黄一区二区| 麻豆成人av在线观看| 精品国产亚洲在线| 亚洲精品一二三| 精品国产美女av久久久久小说| 99精品欧美一区二区三区四区| 国产午夜精品久久久久久| 成人亚洲精品一区在线观看| 久久人妻熟女aⅴ| av网站免费在线观看视频| 日韩大码丰满熟妇| 免费在线观看黄色视频的| 最新在线观看一区二区三区| 欧美一级毛片孕妇| 久久午夜综合久久蜜桃| 欧美最黄视频在线播放免费 | 一进一出抽搐gif免费好疼 | 午夜精品久久久久久毛片777| aaaaa片日本免费| 午夜成年电影在线免费观看| 国产在线精品亚洲第一网站| 可以在线观看毛片的网站| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 又黄又爽又免费观看的视频| 亚洲精品成人av观看孕妇| 天堂俺去俺来也www色官网| 亚洲 国产 在线| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 1024香蕉在线观看| 久久精品人人爽人人爽视色| cao死你这个sao货| 久久性视频一级片| 亚洲欧美激情综合另类| www国产在线视频色| √禁漫天堂资源中文www| 久久影院123| 国产精品野战在线观看 | 19禁男女啪啪无遮挡网站| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 满18在线观看网站| 成年人黄色毛片网站| 亚洲欧美激情综合另类| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 黄片播放在线免费| 久久精品国产综合久久久| 亚洲国产精品合色在线| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 日韩免费av在线播放| 国产野战对白在线观看| 国产主播在线观看一区二区| 久久精品影院6| 国产精品av久久久久免费| 国产成人精品无人区| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 十八禁人妻一区二区| 热99re8久久精品国产| 亚洲成国产人片在线观看| 国产精品永久免费网站| 国产精品野战在线观看 | videosex国产| 国产成人精品久久二区二区91| 桃红色精品国产亚洲av| 日韩有码中文字幕| 精品久久久久久成人av| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 欧美精品啪啪一区二区三区| 丰满饥渴人妻一区二区三| 久久欧美精品欧美久久欧美| 亚洲片人在线观看| 美女高潮到喷水免费观看| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 又大又爽又粗| 精品一区二区三区四区五区乱码| 亚洲欧美精品综合久久99| 99精品在免费线老司机午夜| 国产精品久久久久成人av| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 99国产极品粉嫩在线观看| 国产91精品成人一区二区三区| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 大码成人一级视频| xxx96com| 国产伦一二天堂av在线观看| 久久精品91蜜桃| 国产亚洲精品第一综合不卡| 18禁国产床啪视频网站| 国产亚洲精品久久久久5区| 桃红色精品国产亚洲av| 少妇的丰满在线观看| 脱女人内裤的视频| 午夜激情av网站| 亚洲全国av大片| 80岁老熟妇乱子伦牲交| av在线天堂中文字幕 | 法律面前人人平等表现在哪些方面| 久久青草综合色| 欧美精品亚洲一区二区| 亚洲伊人色综图| 在线免费观看的www视频| 男女之事视频高清在线观看| 在线观看免费日韩欧美大片| 两人在一起打扑克的视频| 制服人妻中文乱码| 老司机亚洲免费影院| 丝袜在线中文字幕| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 一个人免费在线观看的高清视频| 18美女黄网站色大片免费观看| 三级毛片av免费| 欧美+亚洲+日韩+国产| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 男女床上黄色一级片免费看| 久久久久久久精品吃奶| 黄色片一级片一级黄色片| 国产av一区在线观看免费| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 12—13女人毛片做爰片一| 黄色 视频免费看| 国产精品影院久久| 亚洲精品一区av在线观看| 免费高清视频大片| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 国产亚洲欧美98| 99国产精品99久久久久| 亚洲欧美激情在线| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 亚洲七黄色美女视频| 亚洲欧美激情综合另类| 丁香六月欧美| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 日本 av在线| 亚洲人成77777在线视频| 日韩大码丰满熟妇| 久久久国产一区二区| 91精品国产国语对白视频| 又紧又爽又黄一区二区| 国产不卡一卡二| 亚洲九九香蕉| 99热国产这里只有精品6| 黄片播放在线免费| 精品福利观看| 无遮挡黄片免费观看| 午夜福利在线免费观看网站| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 多毛熟女@视频| 国产成+人综合+亚洲专区| 少妇粗大呻吟视频| 欧美激情 高清一区二区三区| 日本免费a在线| bbb黄色大片| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 久久国产精品影院| 国产不卡一卡二| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 在线观看免费午夜福利视频| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 亚洲自拍偷在线| 精品久久久久久久毛片微露脸| 三级毛片av免费| 国产精品电影一区二区三区| 超碰97精品在线观看| 宅男免费午夜| 久久精品成人免费网站| 成人三级做爰电影| 又黄又爽又免费观看的视频| 久久人人精品亚洲av| 国产一区二区激情短视频| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 黄色怎么调成土黄色| 黄片播放在线免费| 波多野结衣一区麻豆| 国产又色又爽无遮挡免费看| xxxhd国产人妻xxx| 国产精品野战在线观看 | 久久九九热精品免费| 高潮久久久久久久久久久不卡| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 国产精品 国内视频| 看免费av毛片| 在线永久观看黄色视频| 久久久国产成人精品二区 | 国产区一区二久久| 欧美亚洲日本最大视频资源| 母亲3免费完整高清在线观看| 看免费av毛片| 国产成年人精品一区二区 | 国产91精品成人一区二区三区| 精品久久久久久电影网| 超碰97精品在线观看| 国产成人精品无人区| 一区二区三区国产精品乱码| 精品乱码久久久久久99久播| 久久久国产一区二区| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 99在线视频只有这里精品首页| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 成年人免费黄色播放视频| √禁漫天堂资源中文www| 亚洲精品一区av在线观看| 香蕉国产在线看| 成年版毛片免费区| 丝袜美腿诱惑在线| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 1024视频免费在线观看| 国产精品国产高清国产av| 免费高清在线观看日韩| 国产1区2区3区精品| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 黑人猛操日本美女一级片| 午夜影院日韩av| 99香蕉大伊视频| 麻豆成人av在线观看| 国产伦人伦偷精品视频| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 日本精品一区二区三区蜜桃| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 国产精品久久久av美女十八| 操美女的视频在线观看| 日韩精品青青久久久久久| 久久精品亚洲av国产电影网| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 国产伦人伦偷精品视频| 午夜福利影视在线免费观看| 一个人免费在线观看的高清视频| 日日爽夜夜爽网站| 国产一区二区三区综合在线观看| 久久久久久久久免费视频了| a级片在线免费高清观看视频| 一级片'在线观看视频| av中文乱码字幕在线| 久久久国产成人免费| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 精品久久久久久成人av| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 久久这里只有精品19| 老汉色∧v一级毛片| 这个男人来自地球电影免费观看| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 精品福利永久在线观看| 又黄又爽又免费观看的视频| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 在线国产一区二区在线| 视频区欧美日本亚洲| 亚洲在线自拍视频| 88av欧美| 99精品在免费线老司机午夜| 亚洲熟妇熟女久久| 91老司机精品| 国产精品二区激情视频| 亚洲情色 制服丝袜| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 中出人妻视频一区二区| 精品国产一区二区三区四区第35| 精品欧美一区二区三区在线| 国产精品久久久av美女十八| 老司机福利观看| 久久国产乱子伦精品免费另类| 99热国产这里只有精品6| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 这个男人来自地球电影免费观看| 日韩中文字幕欧美一区二区| 久久性视频一级片| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 91国产中文字幕| 女同久久另类99精品国产91| 又大又爽又粗| 亚洲三区欧美一区| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 精品第一国产精品| 亚洲精品一二三| 成人影院久久| 久久中文看片网| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 亚洲成人国产一区在线观看| 最近最新中文字幕大全电影3 | av免费在线观看网站| 国产亚洲精品久久久久5区| 午夜91福利影院| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 99久久人妻综合| 精品久久久久久电影网| 在线视频色国产色| 91麻豆av在线| 一区福利在线观看| 老司机在亚洲福利影院| 欧美黑人欧美精品刺激| 999久久久精品免费观看国产| 新久久久久国产一级毛片| 香蕉丝袜av| 国产区一区二久久| 女性被躁到高潮视频| 一进一出好大好爽视频| 后天国语完整版免费观看| 成人精品一区二区免费| 日韩精品免费视频一区二区三区| 后天国语完整版免费观看| 免费日韩欧美在线观看| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 女人精品久久久久毛片| 水蜜桃什么品种好| 国产三级黄色录像| 亚洲avbb在线观看| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 亚洲人成77777在线视频| 国产成人精品久久二区二区免费| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 咕卡用的链子| а√天堂www在线а√下载| 757午夜福利合集在线观看| 大型av网站在线播放| 欧美日韩av久久| 中亚洲国语对白在线视频| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 成人手机av| 老汉色∧v一级毛片| 女警被强在线播放| 亚洲美女黄片视频| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 久久中文看片网| 精品国内亚洲2022精品成人| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 久久久久国产一级毛片高清牌| 男人舔女人下体高潮全视频| 国产高清videossex| 黄片小视频在线播放| 亚洲在线自拍视频| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 国产av又大| 午夜视频精品福利| av片东京热男人的天堂| 午夜福利欧美成人| 国产精品一区二区在线不卡| 一进一出抽搐gif免费好疼 | 无遮挡黄片免费观看| 欧美一级毛片孕妇| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 国产成人av激情在线播放| 国产午夜精品久久久久久| 热re99久久国产66热| 亚洲性夜色夜夜综合| 高清欧美精品videossex| 国产成人精品久久二区二区91| 亚洲精品成人av观看孕妇| 中文欧美无线码| 久久久久久人人人人人| 夜夜夜夜夜久久久久| 国产xxxxx性猛交| 成人18禁在线播放| 免费高清视频大片| 午夜91福利影院| 99国产精品一区二区蜜桃av| 午夜两性在线视频| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 波多野结衣av一区二区av| av网站在线播放免费| 国产精品久久久人人做人人爽| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 99精国产麻豆久久婷婷| av免费在线观看网站| 成人黄色视频免费在线看| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 中文字幕色久视频| 亚洲第一青青草原| 男男h啪啪无遮挡| 欧美日韩乱码在线| 少妇 在线观看| 欧美日韩视频精品一区| 亚洲成人免费av在线播放| 日本三级黄在线观看| 欧美黑人欧美精品刺激| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 69av精品久久久久久| 亚洲成人免费电影在线观看| 精品无人区乱码1区二区| 亚洲第一av免费看| 欧美大码av| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 欧美在线一区亚洲| 国产一区二区三区视频了| 亚洲人成伊人成综合网2020| 国产不卡一卡二| 久久国产精品人妻蜜桃| 成在线人永久免费视频| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 欧美日韩视频精品一区| 亚洲国产精品999在线| 久久午夜综合久久蜜桃| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 亚洲国产欧美网| 日日干狠狠操夜夜爽| 亚洲欧美激情在线| 操美女的视频在线观看| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 在线看a的网站| 亚洲熟女毛片儿| 热99re8久久精品国产| 日韩精品免费视频一区二区三区| 99精品在免费线老司机午夜| 最近最新中文字幕大全免费视频| 老汉色∧v一级毛片| 少妇的丰满在线观看| 欧美午夜高清在线| 亚洲欧美一区二区三区久久| 丝袜人妻中文字幕| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 精品久久久久久成人av| 国产一区二区激情短视频| 99国产精品一区二区三区| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 高清欧美精品videossex| 黄片大片在线免费观看| 99国产极品粉嫩在线观看| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 女性生殖器流出的白浆| 欧美不卡视频在线免费观看 | 国产一区在线观看成人免费| 人人澡人人妻人| 国产亚洲精品久久久久5区| 夜夜看夜夜爽夜夜摸 | 黄色 视频免费看| 大码成人一级视频| 亚洲久久久国产精品| 午夜福利影视在线免费观看| 国产精华一区二区三区| 在线视频色国产色| 免费观看精品视频网站| 久久久久久久精品吃奶| 国产高清视频在线播放一区| 欧美成人免费av一区二区三区| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 亚洲一区二区三区不卡视频| 嫁个100分男人电影在线观看| 午夜免费成人在线视频| 国产片内射在线| videosex国产| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 精品无人区乱码1区二区| 精品国产美女av久久久久小说| 精品国产国语对白av| 十八禁人妻一区二区| 午夜免费成人在线视频| 欧美久久黑人一区二区| 狠狠狠狠99中文字幕| 亚洲精品中文字幕在线视频| 久久久国产一区二区| 国产亚洲欧美在线一区二区| 午夜激情av网站| 国产国语露脸激情在线看| 国产精品国产av在线观看| 国产熟女xx| 久久午夜亚洲精品久久| 国产成人系列免费观看| 亚洲色图综合在线观看| 日韩人妻精品一区2区三区| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 成人亚洲精品av一区二区 | 欧美国产精品va在线观看不卡| 亚洲激情在线av| 亚洲男人的天堂狠狠| 日韩欧美一区视频在线观看| 午夜成年电影在线免费观看| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 黑人欧美特级aaaaaa片| 啦啦啦 在线观看视频| 精品国产国语对白av| 日日干狠狠操夜夜爽| 麻豆成人av在线观看| tocl精华| 亚洲专区中文字幕在线| 桃色一区二区三区在线观看| 精品久久久久久,| 久久伊人香网站| 免费高清视频大片| 韩国av一区二区三区四区| 高清黄色对白视频在线免费看| 亚洲五月色婷婷综合| 麻豆国产av国片精品| 日韩欧美国产一区二区入口| 欧美成人免费av一区二区三区| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 天堂动漫精品| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| av福利片在线| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 青草久久国产| 亚洲第一av免费看| 男男h啪啪无遮挡| 国产精华一区二区三区| 一a级毛片在线观看| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 欧美日韩视频精品一区| 两个人免费观看高清视频| 精品国产国语对白av| 真人一进一出gif抽搐免费| 男人舔女人下体高潮全视频| netflix在线观看网站| 久久精品亚洲av国产电影网| 午夜福利欧美成人| 久久精品国产综合久久久| 久久性视频一级片| 日本 av在线| 午夜91福利影院| 一级作爱视频免费观看| 国产一卡二卡三卡精品|