高糖條件下高表達(dá)ARNO對(duì)人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞通透性的影響及其作用機(jī)制

王小龍，胡成芳，唐璐瑤，李藝，官濤，黃云劍

陸軍軍醫(yī)大學(xué)附屬新橋醫(yī)院腎內(nèi)科，重慶 400037

研究表明，內(nèi)皮細(xì)胞高通透性是糖尿病腎病、糖尿病視網(wǎng)膜疾病和糖尿病血管病變的重要始動(dòng)因素之一，但是其確切的發(fā)生機(jī)制目前仍不清楚[1]。致使腎小球血管通透性增加的原因很多，如高糖、晚期糖基化終末產(chǎn)物形成、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)增多、內(nèi)源性一氧化氮(NO)減少、炎癥及氧化應(yīng)激等[2]，但尚不清楚這些因素最終是否通過(guò)影響內(nèi)皮細(xì)胞膜屏障功能而導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加。因此，有必要深入研究高糖對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞通透性的作用機(jī)制。

Arf6是小分子GTP酶，主要位于質(zhì)膜及內(nèi)含體膜上，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)膜運(yùn)輸及胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白裝配，從而涉及細(xì)胞通透性等多種生理功能的調(diào)節(jié)[3]。本課題前期研究已證實(shí)，高糖能通過(guò)上調(diào)Arf6活性而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加，從而抑制其活性以保護(hù)高糖條件下人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的通透性[4]。Arf6受GTP酶激活蛋白(GAPs)和鳥(niǎo)苷交換因子(GEFs)的共同調(diào)節(jié)[5-7]。ARNO(ARF nucleotidebinding-site opener)是目前報(bào)道最多的催化Arf6的GEFs[7]。多項(xiàng)研究表明，高表達(dá)ARNO能增加Arf6的活性，促進(jìn)細(xì)胞膜表面血管內(nèi)皮鈣黏蛋白(vascular endothelial cadherin，VE-Cadherin)等連接蛋白內(nèi)移，進(jìn)而增加內(nèi)皮細(xì)胞的通透性[8-9]。但ARNO對(duì)高糖環(huán)境下內(nèi)皮細(xì)胞通透性的影響及相關(guān)機(jī)制尚不明確。因此，本研究通過(guò)觀察高糖對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞ARNO表達(dá)的影響，探討高糖環(huán)境下內(nèi)皮細(xì)胞通透性與ARNO/Arf6的關(guān)系，旨在揭示高糖介導(dǎo)ARNO增加內(nèi)皮細(xì)胞通透性的新機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來(lái)源及主要試劑 人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞(HRGEC)由美國(guó)ATCC公司提供，保存于中南大學(xué)細(xì)胞庫(kù)。RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素(美國(guó)Hyclone公司)，胰蛋白酶(美國(guó)Gibco公司)，異硫氰酸熒光素-右旋糖苷(西安瑞禧公司)，Transwell小室(美國(guó)Corning公司)，含綠色熒光的ARNO siRNA慢病毒、Arf6 siRNA慢病毒、陰性對(duì)照病毒及對(duì)應(yīng)引物(上海吉?jiǎng)P公司)，RNAiso Plus、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、cDNA擴(kuò)增試劑盒(日本TaKaRa公司)，兔抗ARNO抗體、Arf6活性檢測(cè)試劑盒(英國(guó)Abcam公司)，鼠抗GAPDH抗體(武漢三鷹公司)，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鼠抗IgG、兔抗IgG(北京中杉金橋公司)，聚偏氟乙烯膜(PVDF膜，重慶鼎今公司)，5×蛋白上樣緩沖液、Western blotting及IP細(xì)胞裂解液、BCA蛋白檢測(cè)試劑盒(上海碧云天公司)，D-甘露醇、D-葡萄糖(美國(guó)Solarbio公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 體外培養(yǎng)HRGEC 將HRGEC培養(yǎng)于T25培養(yǎng)瓶中，在RPMI 1640培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清和1%青鏈霉素，置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞敷育箱中培養(yǎng)。細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶約80%時(shí)，PBS清洗細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶37 ℃消化2 min，適量培養(yǎng)基終止胰酶消化并離心，重懸后以5×105個(gè)細(xì)胞/孔接種于6孔板(進(jìn)行Arf6活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)時(shí)，以5×106個(gè)細(xì)胞/瓶接種于T75培養(yǎng)瓶中)，8 h貼壁后以1%血清培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)24 h。

1.2.2 高糖時(shí)間/濃度梯度依賴(lài)實(shí)驗(yàn) 高糖時(shí)間依賴(lài)實(shí)驗(yàn)：將細(xì)胞隨機(jī)分為高糖對(duì)照組(30 mmol/L，0 min)、高糖(30 mmol/L)15 min組、高糖(30 mmol/L)30 min組、高糖(30 mmol/L)45 min組、高糖(30 mmol/L)60 min組、甘露醇組(40 mmol/L，30 min)，進(jìn)行相應(yīng)刺激后，Western blotting檢測(cè)ARNO表達(dá)，F(xiàn)ITC-Dextran檢測(cè)HRGEC細(xì)胞通透性。高糖濃度依賴(lài)實(shí)驗(yàn)：將細(xì)胞隨機(jī)分為正常糖組(5 mmol/L)、高糖10 mmol/L組、高糖20 mmol/L組、高糖30 mmol/L組、高糖40 mmol/L組、甘露醇組，刺激30 min后Western blotting檢測(cè)ARNO表達(dá)，F(xiàn)ITC-Dextran檢測(cè)HRGEC細(xì)胞通透性。

1.2.3 Western blotting檢測(cè)ARNO、Arf6蛋白的表達(dá) 各組HRGEC每孔中加入200 μl含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min，離心取上清，測(cè)定蛋白濃度，配平后加入5×蛋白上樣緩沖液并煮沸。取各蛋白樣品10 μl于12% SDS-PAGE凝膠中恒壓電泳(110 V，90 min)，恒流電轉(zhuǎn)移至PVDF膜(200 mA，90 min)，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，以1:2000稀釋ARNO抗體、1:350稀釋Arf6抗體、1:5000稀釋GAPDH抗體4 ℃孵育過(guò)夜，TBST漂洗，分別以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗IgG和鼠抗IgG二抗室溫孵育1 h，TBST再次漂洗并顯影。

1.2.4 FITC標(biāo)記葡聚糖(FITC-Dextran)檢測(cè)HRGEC細(xì)胞通透性 以2×105/ml密度將各組HRGRC接種于Transwell小室(200 μl/孔)，待細(xì)胞融合為單層后，加以相應(yīng)條件的高糖刺激，經(jīng)過(guò)相應(yīng)時(shí)間后，PBS清洗上下室，上室加入200 μl FITC-Dextran，下室加入1200 μl PBS，孵箱孵育3 h后，吸取下室液體100 μl，用酶標(biāo)儀在492 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度(A)值。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。單層內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)FITC-Dextran的通透性用通透系數(shù)Pa表示，計(jì)算方法如下：Pa=[A]/t×(1/A)×(V/[L])，其中[A]為頂室FITCDextran濃度(以熒光強(qiáng)度表示)，t為時(shí)間(s)，A為濾膜面積(cm2)，V為底室液體量(ml)，[L]為底室FITC-Dextran濃度(以熒光強(qiáng)度表示)。各處理組的通透性結(jié)果以Pa變化百分率(Pa%)表示，公式為：Pa%=實(shí)驗(yàn)組Pa/正常糖對(duì)照組Pa×100%。

1.2.5 慢病毒轉(zhuǎn)染沉默ARNO、Arf6 將細(xì)胞分為正常糖未轉(zhuǎn)染組、正常糖空載體組、正常糖ARNO siRNA組、正常糖Arf6 siRNA組。以1×105/ml的密度將HRGRC接種于24孔板中(500 μl/孔)，貼壁后加入稀釋病毒液(病毒總數(shù)/細(xì)胞總數(shù)=10)，12 h后換液，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%融合后，加入嘌呤霉素(puromycin，PM，終濃度為2 μg/ml)進(jìn)行篩選。轉(zhuǎn)染后72 h于熒光顯微鏡下觀察。待進(jìn)行轉(zhuǎn)錄、表達(dá)驗(yàn)證后，得到沉默ARNO、Arf6的HRGEC。

1.2.6 Real-time PCR檢測(cè)慢病毒轉(zhuǎn)染HRGEC后ARNO、Arf6基因的轉(zhuǎn)錄 以RNAiso Plus法提取RNA，測(cè)定濃度并配平后，以反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再用擴(kuò)增試劑盒將cDNA擴(kuò)增，以檢測(cè)正常糖未轉(zhuǎn)染組、正常糖空載體組、正常糖ARNO siRNA組(測(cè)ARNO轉(zhuǎn)錄時(shí))、正常糖Arf6 siRNA組(測(cè)Arf6轉(zhuǎn)錄時(shí))HRGEC的ARNO、Arf6基因轉(zhuǎn)錄水平，以GAPDH為內(nèi)參。每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔。引物序列見(jiàn)表1。

1.2.7 Western blotting測(cè)定Arf6活性 取未轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染空載體、ARNO siRNA的細(xì)胞，經(jīng)高糖刺激后得到高糖未轉(zhuǎn)染組、高糖空載體組及高糖ARNO siRNA組的HRGEC。在各組培養(yǎng)瓶中加入1 ml含蛋白酶抑制劑的測(cè)試緩沖液，冰上裂解15 min，離心，取240 μl上清作為input樣本，加入60 μl 5×蛋白上樣緩沖液并煮沸；取660 μl上清作為pulldown樣本，補(bǔ)足1 ml后加40 μl GGA3 PBD瓊脂珠，4 ℃搖晃孵育1 h，測(cè)試緩沖液清洗3次并吸盡上清后，加入40 μl 2×蛋白上樣緩沖液并煮沸，然后將得到的蛋白樣本按1.2.3方法進(jìn)行定量分析。

表1 Real-time PCR中各引物的序列Tab.1 Sequence of primers in Real-time PCR

1.2.8 CCK-8法檢測(cè)慢病毒對(duì)HRGEC細(xì)胞存活的影響 將細(xì)胞分為正常糖未轉(zhuǎn)染組、正常糖空載體組、正常糖ARNO siRNA組、正常糖Arf6 siRNA組，以2×104/ml密度接種于96孔板(200 μl/孔)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。48 h后加入CCK-8溶液10 μl，再次孵育1 h后，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)A值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行圖表繪制。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 時(shí)間依賴(lài)實(shí)驗(yàn)中高糖對(duì)HRGEC ARNO表達(dá)及通透性的影響 Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，與高糖對(duì)照組相比，高糖15、30、45、60 min組HRGEC ARNO表達(dá)明顯升高；與高糖15 min組相比，高糖30 min組ARNO表達(dá)升高；與高糖30 min組相比，高糖45 min組ARNO表達(dá)回落；與高糖45 min組相比，高糖60 min組ARNO表達(dá)降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。FITC-Dextran檢測(cè)結(jié)果顯示，與高糖對(duì)照組相比，高糖15、30、45、60 min組內(nèi)皮細(xì)胞通透性明顯增加；與高糖15 min組相比，高糖30 min組通透性增加；與高糖30 min組相比，高糖45 min組通透性下降；與高糖45 min組相比，高糖60 min組通透性下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。甘露醇組與高糖對(duì)照組的HRGEC ARNO表達(dá)及內(nèi)皮細(xì)胞通透性差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖1、表2)。

圖1 時(shí)間依賴(lài)實(shí)驗(yàn)中高糖對(duì)HRGEC ARNO表達(dá)的影響Fig.1 Effects of high glucose on HRGEC ARNO expression in time-dependent experiments

表2 時(shí)間依賴(lài)實(shí)驗(yàn)中高糖對(duì)HRGEC ARNO表達(dá)及通透性的影響(±s，n=3)Tab.2 Effects of high glucose on ARNO expression and permeability of HRGECs in time-dependent experiments (±s,n=3)

表2 時(shí)間依賴(lài)實(shí)驗(yàn)中高糖對(duì)HRGEC ARNO表達(dá)及通透性的影響(±s，n=3)Tab.2 Effects of high glucose on ARNO expression and permeability of HRGECs in time-dependent experiments (±s,n=3)

與高糖對(duì)照組比較，(1)P<0.05；與高糖15 min組比較，(2)P<0.05；與高糖30 min組比較，(3)P<0.05；與高糖45 min組比較，(4)P<0.05。

組別 ARNO蛋白 Pa%高糖對(duì)照組 0.242±0.029 1.000高糖15 min組 0.670±0.051(1) 1.196±0.004(1)高糖30 min組 0.960±0.106(1)(2) 1.399±0.012(1)(2)高糖45 min組 0.716±0.026(1)(3) 1.301±0.052(1)(3)高糖60 min組 0.531±0.030(1)(4) 1.184±0.030(1)(4)甘露醇組 0.227±0.041 1.014±0.005 F 61.750 76.070 P<0.001 <0.001

2.2 濃度依賴(lài)實(shí)驗(yàn)中高糖對(duì)HRGEC ARNO表達(dá)及通透性的影響 Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常糖組相比，高糖20、30、40 mmol/L組HRGEC ARNO表達(dá)明顯升高；隨高糖濃度增加，ARNO表達(dá)呈遞增趨勢(shì)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。FITC-Dextran檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常糖組相比，高糖10、20、30、40 mmol/L組內(nèi)皮細(xì)胞通透性明顯增加；隨高糖濃度增加，內(nèi)皮細(xì)胞通透性也呈遞增趨勢(shì)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。甘露醇組與正常糖組的HRGEC ARNO表達(dá)及內(nèi)皮細(xì)胞通透性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖2、表3)。根據(jù)以上時(shí)間和濃度依賴(lài)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究選擇30 mmol/L高糖刺激30 min作為后續(xù)的高糖刺激條件。

圖2 濃度依賴(lài)實(shí)驗(yàn)中高糖對(duì)HRGEC ARNO表達(dá)的影響Fig.2 Effects of high glucose on HRGEC ARNO expression in concentration-dependent experiments

表3 濃度依賴(lài)實(shí)驗(yàn)中高糖對(duì)HRGEC ARNO表達(dá)及通透性的影響(±s，n=3)Tab.3 Effects of high glucose on ARNO expression and permeability of HRGECs in concentration-dependent experiments (±s, n=3)

表3 濃度依賴(lài)實(shí)驗(yàn)中高糖對(duì)HRGEC ARNO表達(dá)及通透性的影響(±s，n=3)Tab.3 Effects of high glucose on ARNO expression and permeability of HRGECs in concentration-dependent experiments (±s, n=3)

與正常糖組比較，(1)P<0.05；與高糖10 mmol/L組比較，(2)P<0.05；與高糖20 mmol/L組比較，(3)P<0.05；與高糖30 mmol/L組比較，(4)P<0.05。

組別 ARNO蛋白 Pa%正常糖組 0.169±0.033 1.000高糖10 mmol/L組 0.220±0.030 1.147±0.015(1)高糖20 mmol/L組 0.632±0.031(1)(2) 1.237±0.023(1)(2)高糖30 mmol/L組 0.927±0.041(1)(3) 1.351±0.015(1)(3)高糖40 mmol/L組 1.183±0.098(1)(4) 1.444±0.019(1)(4)甘露醇組 0.269±0.041 0.991±0.033 F 132.400 166.700 P<0.001 <0.001

2.3 慢病毒對(duì)H R G E C的轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染后各組ARNO、Arf6基因轉(zhuǎn)錄、表達(dá)水平的影響 轉(zhuǎn)染慢病毒72 h后，熒光倒置顯微鏡下可見(jiàn)正常糖空載體組、正常糖ARNO siRNA組、正常糖Arf6 siRNA組的HRGEC均為綠色熒光，轉(zhuǎn)染效率均達(dá)80%(圖3)。CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示，正常糖未轉(zhuǎn)染組、正常糖空載體組、正常糖ARNO siRNA組、正常糖Arf6 siRNA組的吸光度分別為1.262±0.036、1.330±0.097、1.312±0.189、1.355±0.067，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.244，P=0.864)，即各組的細(xì)胞存活率無(wú)明顯差異。Real-time PCR及Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染ARNO siRNA、Arf6 siRNA后，正常糖ARNO siRNA組、正常糖Arf6 siRNA組HRGEC內(nèi)ARNO、Arf6基因轉(zhuǎn)錄及表達(dá)水平均低于正常糖未轉(zhuǎn)染組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，正常糖空載體組與正常糖未轉(zhuǎn)染組的ARNO、Arf6轉(zhuǎn)錄及表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4、表4、圖5、表5)。

圖3 轉(zhuǎn)染后各組HRGEC在熒光倒置顯微鏡下的圖像(×100)Fig.3 Images of HRGECs in each group after transfection with lentivirus under fluorescence inversion microscope (×100)

圖4 轉(zhuǎn)染ARNO siRNA慢病毒后HRGEC中ARNO蛋白的表達(dá)Fig.4 Expression of ARNO protein in HRGECs after infection with ARNO siRNA recombinant lentivirus vectors

表4 轉(zhuǎn)染ARNO siRNA慢病毒后HRGEC中ARNO mRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白的表達(dá)(±s，n=3)Tab.4 Transcription of ARNO mRNA and expression of ARNO protein in HRGECs after infection with ARNO siRNA recombinant lentivirus vectors (±s, n=3)

表4 轉(zhuǎn)染ARNO siRNA慢病毒后HRGEC中ARNO mRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白的表達(dá)(±s，n=3)Tab.4 Transcription of ARNO mRNA and expression of ARNO protein in HRGECs after infection with ARNO siRNA recombinant lentivirus vectors (±s, n=3)

與正常糖未轉(zhuǎn)染組比較，(1)P<0.05。

組別 ARNO mRNA ARNO蛋白正常糖未轉(zhuǎn)染組 1.000 0.246±0.011正常糖空載體組 1.183±0.297 0.237±0.009正常糖ARNO siRNA組 0.255±0.056(1) 0.088±0.005(1)F 15.880 208.500 P 0.004 <0.001

圖5 轉(zhuǎn)染Arf6 siRNA慢病毒后HRGEC中Arf6蛋白的表達(dá)Fig.5 Expression of Arf6 protein in HRGECs after infection with Arf6 siRNA recombinant lentivirus vectors

表5 轉(zhuǎn)染Arf6 siRNA慢病毒后HRGEC中Arf6 mRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白的表達(dá)(±s，n=3)Tab.5 Transcription of Arf6 mRNA and expression of Arf6 protein in HRGECs after infection with Arf6 siRNA recombinant lentivirus vectors (±s, n=3)

表5 轉(zhuǎn)染Arf6 siRNA慢病毒后HRGEC中Arf6 mRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白的表達(dá)(±s，n=3)Tab.5 Transcription of Arf6 mRNA and expression of Arf6 protein in HRGECs after infection with Arf6 siRNA recombinant lentivirus vectors (±s, n=3)

與正常糖未轉(zhuǎn)染組比較，(1)P<0.05。

組別 Arf6 mRNA Arf6蛋白正常糖未轉(zhuǎn)染組 1.000 0.917±0.009正常糖空載體組 1.140±0.236 0.919±0.009正常糖Arf6 siRNA組 0.314±0.090(1) 0.690±0.012(1)F 18.400 328.800 P 0.003 <0.001

2.4 沉默ARNO對(duì)高糖刺激誘導(dǎo)HRGEC的Arf6活性及通透性的影響 Western blotting及FITC-Dextran檢測(cè)結(jié)果顯示，沉默ARNO后，與高糖未轉(zhuǎn)染組及高糖空載體組相比，高糖ARNO siRNA組的ARNO蛋白、Arf6-GTP(即Arf6活性)及細(xì)胞通透性均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖6、表6)。

圖6 沉默ARNO后高糖刺激誘導(dǎo)HRGEC的ARNO表達(dá)及Arf6活性Fig.6 ARNO expression and Arf6 activity of HRGECs induced by high glucose stimulation after ARNO silencing

表6 沉默ARNO后高糖刺激誘導(dǎo)HRGEC的ARNO蛋白表達(dá)、Arf6活性及通透性(±s，n=3)Tab.6 ARNO expression, Arf6 activity and permeability of HRGECs induced by high glucose stimulation after ARNO silencing (±s, n=3)

表6 沉默ARNO后高糖刺激誘導(dǎo)HRGEC的ARNO蛋白表達(dá)、Arf6活性及通透性(±s，n=3)Tab.6 ARNO expression, Arf6 activity and permeability of HRGECs induced by high glucose stimulation after ARNO silencing (±s, n=3)

與高糖未轉(zhuǎn)染組及高糖空載體組比較，(1)P<0.05。

組別 ARNO蛋白 Arf6活性 Pa%高糖未轉(zhuǎn)染組 0.915±0.005 0.484±0.014 1.000高糖空載體組 0.916±0.012 0.490±0.008 0.978±0.040高糖ARNO siRNA組0.572±0.021(1)0.263±0.007(1)0.718±0.017(1)F 386.700 341.700 78.690 P<0.001 <0.001 <0.001

2.5 沉默Arf6對(duì)高糖刺激誘導(dǎo)HRGEC的Arf6表達(dá)及通透性的影響 Western blotting及FITC-Dextran檢測(cè)結(jié)果顯示，沉默Arf6后，與高糖未轉(zhuǎn)染組及高糖空載體組相比，高糖Arf6 siRNA組的Arf6蛋白表達(dá)及內(nèi)皮細(xì)胞通透性均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖7、表7)。

圖7 沉默Arf6后高糖刺激誘導(dǎo)HRGEC的Arf6表達(dá)Fig.7 Arf6 expression of HRGECs induced by high glucose stimulation after Arf6 silencing

表7 沉默Arf6后高糖刺激誘導(dǎo)HRGEC的Arf6表達(dá)及通透性(±s，n=3)Tab.7 Arf6 expression and permeability of HRGECs induced by high glucose stimulation after Arf6 silencing (±s, n=3)

表7 沉默Arf6后高糖刺激誘導(dǎo)HRGEC的Arf6表達(dá)及通透性(±s，n=3)Tab.7 Arf6 expression and permeability of HRGECs induced by high glucose stimulation after Arf6 silencing (±s, n=3)

與高糖未轉(zhuǎn)染組及高糖空載體組比較，(1)P<0.05。

組別 Arf6蛋白 Pa%高糖未轉(zhuǎn)染組 0.932±0.020 1.000高糖空載體組 0.899±0.022 0.978±0.040高糖Arf6 siRNA組 0.673±0.015(1) 0.768±0.050(1)F 109.200 24.020 P<0.001 0.001

3 討 論

小分子GTP酶Arf6可調(diào)節(jié)膜內(nèi)外物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)及包膜的重塑，血管內(nèi)皮的屏障功能受Arf6活性調(diào)控[10]。許多炎性因子如腫瘤壞死因子及內(nèi)毒素脂多糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮高通透性是通過(guò)Arf6實(shí)現(xiàn)的，而Robo4能抑制Arf6的活性，增加細(xì)胞膜鈣依賴(lài)性黏附素的表達(dá)，進(jìn)而穩(wěn)定內(nèi)皮的屏障功能[11-13]。白細(xì)胞介素-1(IL-1)刺激內(nèi)皮細(xì)胞高通透性也與ARNOArf6通路活化有關(guān)[8]。VEGF165及纖黏蛋白誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞遷移及滲漏也與Arf6活性增加有關(guān)，應(yīng)用SecinH3(ARNO抑制劑)可抑制其作用[13]。內(nèi)皮素-1(ET-1)刺激內(nèi)皮細(xì)胞的遷移及成管能力也與Arf6活性有關(guān)[14]。在高糖條件下，內(nèi)皮細(xì)胞周?chē)嬖诟邼舛鹊难芑钚砸蜃尤鏘L-1、腫瘤壞死因子、VEGF、ET-1等，但它們是否通過(guò)ARNO活化Arf6啟動(dòng)內(nèi)皮高通透性目前尚不清楚，因此有必要研究高糖條件下ARNO的表達(dá)及其對(duì)Arf6活性的影響。

細(xì)胞膜的許多生理活動(dòng)主要靠小G蛋白GTPGDP的精確轉(zhuǎn)換來(lái)調(diào)控，以達(dá)到細(xì)胞生理的精確要求，避免反應(yīng)過(guò)度或不足。小G蛋白Arf6的活化受到GAPs和GEFs的共同調(diào)節(jié)，GAPs是負(fù)調(diào)節(jié)因子，可催化與Arf6結(jié)合的GTP水解成GDP而抑制其活性，而GEFs是正調(diào)節(jié)因子，能促進(jìn)Arf6-GDP向Arf6-GTP的轉(zhuǎn)換從而激活A(yù)rf6。ARNO是目前報(bào)道最多的催化Arf6的GEFs。本研究發(fā)現(xiàn)，高糖是腎小球內(nèi)皮細(xì)胞ARNO表達(dá)的正誘導(dǎo)劑，與正常糖組相比，高糖可刺激內(nèi)皮細(xì)胞ARNO表達(dá)升高，該作用呈濃度依賴(lài)性(20～40 mmol/L)及時(shí)間依賴(lài)性(15～30 min)。細(xì)胞通透性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞通透性改變與ARNO表達(dá)趨勢(shì)一致，提示內(nèi)皮細(xì)胞通透性可能與ARNO表達(dá)有關(guān)。另外，在時(shí)間依賴(lài)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，30 mmol/L高糖處理腎小球上皮細(xì)胞45 min后ARNO表達(dá)和通透性有所回落，說(shuō)明高糖體外刺激對(duì)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞通透性的作用45 min后會(huì)衰減，該現(xiàn)象同樣被Sw?rd等[15]證實(shí)，提示內(nèi)皮細(xì)胞可能通過(guò)某種機(jī)制下調(diào)ARNO，啟動(dòng)應(yīng)急的負(fù)調(diào)控機(jī)制平衡或恢復(fù)內(nèi)皮的屏障功能。Xie等[16]發(fā)現(xiàn)，這種負(fù)調(diào)控機(jī)制于1周后減弱，內(nèi)皮細(xì)胞高通透性又會(huì)呈現(xiàn)出來(lái)，因此認(rèn)為這與Robo4表達(dá)下調(diào)有關(guān)。綜上，本研究推測(cè)，短期(60 min內(nèi))高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞通透性調(diào)控可能與ARNO/Arf6活化有關(guān)，長(zhǎng)期高糖誘導(dǎo)的通透性調(diào)控可能與Robo4表達(dá)不足導(dǎo)致Arf6活化有關(guān)，而高糖長(zhǎng)期作用已經(jīng)在本課題組前期實(shí)驗(yàn)(48 h以上)[4]及Xie等[16]的實(shí)驗(yàn)(5 d以上)中證實(shí)。

為了證實(shí)ARNO/Arf6信號(hào)通路參與高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮高通透性改變，筆者進(jìn)一步構(gòu)建了ARNO siRNA和Arf6 siRNA重組慢病毒載體感染HRGEC，獲得沉默ARNO和Arf6的HRGEC細(xì)胞株，分別了解ARNO和Arf6基因沉默對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞通透性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，沉默ARNO后高糖刺激誘導(dǎo)的高活性Arf6明顯降低，內(nèi)皮細(xì)胞通透性也同時(shí)降低。重要的是，沉默Arf6后高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞通透性改變被逆轉(zhuǎn)，說(shuō)明高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮高通透性是通過(guò)ARNO/Arf6信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。許多實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，阻斷ARNO/Arf6信號(hào)活化能穩(wěn)定炎性條件下的內(nèi)皮屏障功能。其中，Mannell等[17]發(fā)現(xiàn)，VEGF誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮新生及高通透性是通過(guò)ARNO實(shí)現(xiàn)的，基因沉默ARNO可減弱VEGF對(duì)內(nèi)皮的作用；Zhu等[18]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，糖尿病視網(wǎng)膜病變的ARNO/Arf6信號(hào)與VEGF/VEGFR-2信號(hào)有關(guān)，VEGF誘導(dǎo)的內(nèi)皮VEGFR-2內(nèi)化須通過(guò)ARNO/Arf6信號(hào)活化才能完成，小分子Arf6抑制劑NAV-2729可明顯抑制VEGF誘導(dǎo)的體外培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞的高通透性及糖尿病小鼠視網(wǎng)膜血管的高通透性；Davis等[19]也發(fā)現(xiàn)，阻斷Arf6活性可阻斷脂多糖誘發(fā)的內(nèi)皮滲漏并提高內(nèi)毒素小鼠的成活率；Zhu等[8]發(fā)現(xiàn)，SecinH3可抑制膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型的血管炎性滲出，其機(jī)制也與Arf6的失活有關(guān)。

綜上所述，ARNO/Arf6活化參與了高糖誘導(dǎo)的腎小球內(nèi)皮高通透性，抑制ARNO/Arf6信號(hào)可能是今后糖尿病內(nèi)皮細(xì)胞高通透性治療的新靶點(diǎn)。