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    油橄欖葉提取物的抑菌活性研究

    2020-02-26 03:15:34孔維寶楊樹玲霍煥燃張愛梅牛世全
    中國油脂 2020年2期
    關(guān)鍵詞:橄欖對數(shù)金黃色

    孔維寶,楊樹玲,霍煥燃,景 洋,張愛梅,牛世全

    (西北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,蘭州 730070)

    油橄欖是世界上著名的木本油料樹種,其葉片提取物富含橄欖苦苷和黃酮等活性成分,且含量明顯高于果實(shí),具有較強(qiáng)的抑菌活性[1-2]。在地中海地區(qū),油橄欖葉提取物早已被人們當(dāng)作民間醫(yī)藥來治療發(fā)燒和其他疾病如瘧疾等。橄欖苦苷是一類被歸于裂環(huán)烯醚萜類的苦味單萜類皂苷,毒性極低,是油橄欖葉中最具抗菌活性的物質(zhì)[3]。此外,橄欖苦苷有很強(qiáng)的抗氧化活性,尤其是作為自由基清除劑,能夠提高SOD活性[4],并具有抗腫瘤、降血糖等藥理作用[5]。

    隨著抗生素類和磺胺類等抗菌藥物的大量使用,細(xì)菌的耐藥性不斷增強(qiáng)。因此,研發(fā)高效、廣譜、低殘留、低毒的藥物將成為防治細(xì)菌感染類疾病的重中之重。研究發(fā)現(xiàn)中藥或天然植物提取物可抑制或直接殺滅病原菌而不產(chǎn)生耐藥性[6-7],因此抗菌中藥逐步成為研究熱點(diǎn)。而橄欖苦苷作為一種裂環(huán)烯醚萜類化合物,對細(xì)菌具有較強(qiáng)的抑制效果。本文以甘肅隴南油橄欖葉提取物(Olive leaves extract,OLE)為試樣,分析其對幾種常見細(xì)菌的抑菌活性,為油橄欖葉提取物制備成抗菌制劑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    1.1.1 原料與試劑

    油橄欖葉提取物(OLE):由隴南田園油橄欖科技開發(fā)有限公司提供,主要活性成分及含量為橄欖苦苷34.62%、總多酚0.15%、總黃酮10.23%。

    大腸桿菌(Escherichiacoli)CVCC1570、抗四環(huán)素大腸桿菌、金黃色葡萄球菌(S.aureus)CVCC 1882、金黃色葡萄球菌(SH7),購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)CMCC26069、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)ATCC27853、蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)CMCC(B)63302,購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院;枯草芽孢桿菌(B.subtilis),保藏于西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室。

    牛肉膏、蛋白胨、瓊脂粉、BR生化試劑,購自海博生物技術(shù)有限公司。氯化鈉、鹽酸小檗堿、氯化三苯四氮唑(TTC)、二甲基亞砜(DMSO),分析純。

    1.1.2 儀器與設(shè)備

    LDZX-30KBS型立式壓力蒸汽滅菌器,上海申安醫(yī)療器械廠;BT-25S型電子天平,德國賽多利斯;IS-RDV1型恒溫振蕩器,美國Crystal;HFsafe 1500型生物安全柜,上海力申科學(xué)儀器有限公司;WP-RO-10B型實(shí)驗(yàn)室專用超純水機(jī),四川沃特爾科技發(fā)展有限公司;TU-1810DPC型紫外可見分光光度計(jì),北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;DNP-9052-1A型電熱恒溫培養(yǎng)箱,上海鴻都電子科技有限公司;不銹鋼數(shù)顯卡尺,天津市量具廠;KQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 菌懸液的制備

    10倍稀釋法制備菌懸液:分別吸取稀釋至10-5、10-6、10-7、10-8、10-9倍的菌懸液100 μL于牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基中涂布,37℃恒溫培養(yǎng)18 h,對菌落數(shù)在30~300之間的培養(yǎng)皿進(jìn)行計(jì)數(shù),求平均值。最終挑選菌液濃度為106~107CFU/mL菌懸液備用。

    1.2.2 最低抑菌質(zhì)量濃度(MIC)、最低殺菌質(zhì)量濃度(MBC)測定

    采用96孔板肉湯稀釋法[8]測定OLE對8種供試菌的MIC和MBC。鹽酸小檗堿作為對照,每孔中加入牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基100 μL,96孔板的A~D行第1孔中加入100 μL 64 mg/mL的OLE樣品,E~H行第1孔中加入100 μL 64 mg/mL的鹽酸小檗堿樣品,二倍稀釋法使藥液濃度呈梯度遞減,第10孔中取出的藥液與培養(yǎng)基混合液棄去,第11孔為加藥不加菌液的陰性對照,第12孔為加菌液不加藥的空白對照。除第11列和第12列,每孔中加入5 μL菌懸液,置于微型振蕩器上振蕩1 min,使各孔內(nèi)溶液混勻,37℃孵育18 h,以肉眼觀察無渾濁的藥液質(zhì)量濃度即為受試菌的MIC。

    另取潔凈微孔板,每孔中加入100 μL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基,取各板中肉眼可見渾濁孔的前一澄清孔中培養(yǎng)液5 μL置于該板中培養(yǎng),每孔3個(gè)重復(fù),在37℃恒溫箱中孵育18 h后,加入5 g/L氯化三苯四氮唑(TTC)5 μL,35℃孵育2 h后觀察,有細(xì)菌生長呈紅色,繼續(xù)取前一孔培養(yǎng)液進(jìn)行觀察,直至無紅色即為該菌的MBC。

    1.2.3 抑菌活性測定

    采用牛津杯法[9]評價(jià)OLE對8種供試細(xì)菌的抑菌活性。吸取100 μL菌懸液涂布于牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基中,靜置30 min后,將平板均分為4個(gè)區(qū),分別放入5個(gè)牛津杯(裝量250 μL),每種細(xì)菌重復(fù)3次,靜置15 min后置于37℃培養(yǎng)18 h。觀察并測量各抑菌圈直徑(d),記錄抑菌圈大小。按照抗菌藥物敏感性實(shí)驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)抑菌圈直徑判定細(xì)菌對OLE的敏感度。細(xì)菌對OLE表現(xiàn)出敏感度越高則OLE對該細(xì)菌具有更好的抑菌效果。

    1.2.4 OLE對細(xì)菌生長曲線的影響

    采用稀釋法[10]分析OLE對8種供試細(xì)菌生長曲線的影響。依次將菌懸液和不同質(zhì)量濃度的OLE溶液加入滅菌后的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中,37℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)。每隔6 h置于超凈工作臺內(nèi)取樣一次,于540 nm波長處測定其吸光度,繪制細(xì)菌生長曲線。

    1.2.5 數(shù)據(jù)處理

    實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示,用SPSS18.0和Origin 9.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 MIC與MBC

    采用稀釋法分析OLE對8種供試菌的MIC和MBC,結(jié)果見表1。

    表1 OLE與鹽酸小檗堿的最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)

    由表1可知,OLE與鹽酸小檗堿在測試質(zhì)量濃度下對銅綠假單胞菌無抑制作用。OLE對表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌(SH7)及大腸桿菌的抑制作用較強(qiáng),對蠟狀芽孢桿菌、抗四環(huán)素大腸桿菌的抑制作用較弱。OLE對各細(xì)菌的MIC與MBC以及抑菌活性分別為:表皮葡萄球菌(MIC 1 mg/mL,MBC 2 mg/mL)=金黃色葡萄球菌(SH7)(MIC 1 mg/mL,MBC 2 mg/mL)=大腸桿菌(MIC 1 mg/mL,MBC 2 mg/mL)>枯草芽孢桿菌(MIC 2 mg/mL,MBC 4 mg/mL)=金黃色葡萄球菌(MIC 2 mg/mL,MBC 4 mg/mL)>蠟狀芽孢桿菌(MIC 8 mg/mL,MBC 16 mg/mL)=抗四環(huán)素大腸桿菌(MIC 8 mg/mL,MBC 16 mg/mL)。與對照鹽酸小檗堿相比,OLE對枯草芽孢桿菌、表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌(SH7)的抑菌效果低于鹽酸小檗堿,而對蠟狀芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、抗四環(huán)素大腸桿菌的抑菌效果優(yōu)于鹽酸小檗堿,對大腸桿菌的抑菌效果與鹽酸小檗堿的相當(dāng)。有研究報(bào)道[8,11]橄欖苦苷對金黃色葡萄球菌的MIC為0.031 2~0.125 mg/mL;橄欖總黃酮對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草桿菌均有抑制作用,對大腸桿菌、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌的MIC分別為0.25、0.125、0.062 5 mg/mL。以上研究與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在差異,這可能主要與供試樣品的來源及純度有關(guān)系。

    2.2 抑菌活性

    OLE對8種細(xì)菌的抑菌圈大小和細(xì)菌的敏感度如表2所示。

    表2 OLE對8種細(xì)菌的抑菌圈大小及細(xì)菌敏感度

    由表2可知,8種細(xì)菌對空白對照均表現(xiàn)出不敏感或敏感度不明顯,實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)銅綠假單胞菌對OLE表現(xiàn)不敏感或低度敏感,OLE對其他7種細(xì)菌都有抑菌作用。OLE質(zhì)量濃度為1 mg/mL時(shí),蠟狀芽孢桿菌和銅綠假單胞菌表現(xiàn)為不敏感,其他細(xì)菌均表現(xiàn)為低度敏感。OLE質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí),枯草芽孢桿菌和蠟狀芽孢桿菌分別表現(xiàn)為低度敏感與不敏感,表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌(SH7)、大腸桿菌及抗四環(huán)素大腸桿菌均表現(xiàn)為中度敏感。OLE質(zhì)量濃度為20 mg/mL時(shí),大腸桿菌、抗四環(huán)素大腸桿菌處于極度敏感(d=(25.07±3.02)mm,d=(24.89±1.58)mm),表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌(SH7)處于極度敏感(d=(20.11±1.02)mm,d=(21.35±2.06)mm,d=(20.01±1.21)mm),枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌處于中度敏感(d=(11.32±1.32)mm,d=(10.12±1.58)mm)。以上結(jié)果顯示:OLE在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對大腸桿菌、抗四環(huán)素大腸桿菌的抑菌活性最強(qiáng),其次為金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌(SH7),而枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌對OLE表現(xiàn)出敏感度不高。苯酚類或抗氧化物通過與細(xì)胞的肽聚糖作用來破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)或損害細(xì)胞膜,兩者共同作用抑制細(xì)菌的生長[12]。由于橄欖苦苷羥基鄰位二取代結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性強(qiáng)[13],以及大腸桿菌、抗四環(huán)素大腸桿菌(革蘭氏陰性菌)細(xì)胞壁肽聚糖含量低和層次少,橄欖苦苷易于進(jìn)入和產(chǎn)生抑制作用。表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌(SH7)、枯草芽孢桿菌以及蠟狀芽孢桿菌均為革蘭氏陽性菌,菌體細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)緊密,以及芽孢強(qiáng)抗逆性使得橄欖苦苷對枯草芽孢桿菌以及蠟狀芽孢桿菌的作用較弱。

    2.3 OLE對細(xì)菌生長曲線的影響

    2.3.1 OLE對芽孢桿菌生長曲線的影響(見圖1)

    注:A為蠟狀芽孢桿菌,B為枯草芽孢桿菌。

    由圖1(A)可知,在不添加OLE的培養(yǎng)基中,蠟狀芽孢桿菌在培養(yǎng)12 h后細(xì)菌生物量的積累明顯加快,12~30 h為蠟狀芽孢桿菌的對數(shù)生長期。添加OLE質(zhì)量濃度為5 mg/mL溶液的培養(yǎng)基中蠟狀芽孢桿菌在培養(yǎng)18 h后適應(yīng)環(huán)境并快速繁殖,在18~24 h處于對數(shù)生長期,與對照組比較,此時(shí)細(xì)菌的對數(shù)生長期相對延緩,說明OLE對蠟狀芽孢桿菌的生長有一定的抑制作用。當(dāng)添加OLE質(zhì)量濃度為10 mg/mL的溶液時(shí),培養(yǎng)到18 h后蠟狀芽孢桿菌開始迅速增長,在培養(yǎng)18~24 h時(shí)處于對數(shù)生長期,但菌體濃度低于5 mg/mL組,表明蠟狀芽孢桿菌隨著OLE質(zhì)量濃度的增加,對數(shù)生長期被相應(yīng)延緩或推遲。由圖1(B)可知,當(dāng)不添加OLE時(shí),培養(yǎng)到6 h后枯草芽孢桿菌開始增長,在培養(yǎng)6~30 h時(shí)處于對數(shù)生長期。OLE質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí),在培養(yǎng)18 h后枯草芽孢桿菌快速生長并進(jìn)入對數(shù)生長期。在OLE質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí),培養(yǎng)24 h后枯草芽孢桿菌增長明顯加快,24~30 h為快速生長期。表明隨著OLE質(zhì)量濃度的增加,枯草芽孢桿菌的延遲期增長,對數(shù)生長期延后。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)蠟狀芽孢桿菌與枯草芽孢桿菌對數(shù)生長期分別為12~30 h、6~30 h,添加不同質(zhì)量濃度的OLE后均可延緩蠟狀芽孢桿菌與枯草芽孢桿菌進(jìn)入對數(shù)生長期。生長曲線遲緩期的長短主要因菌種、接種量、菌齡及營養(yǎng)物質(zhì)等不同而異。本實(shí)驗(yàn)中遲緩期延長的原因可能是OLE中的活性成分作為菌體生長的抑制劑對其生長起到了抑制作用。

    2.3.2 OLE對大腸桿菌生長曲線的影響(見圖2)

    注:A為抗四環(huán)素大腸桿菌,B為大腸桿菌。

    由圖2可知,抗四環(huán)素大腸桿菌組和大腸桿菌組的生長曲線趨勢趨于一致。不添加OLE時(shí),培養(yǎng)6 h后細(xì)菌數(shù)開始快速增長并進(jìn)入對數(shù)生長期。當(dāng)OLE質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí),抗四環(huán)素大腸桿菌和大腸桿菌的對數(shù)生長期為18~30 h,此時(shí)對數(shù)生長期被延緩,細(xì)菌生長速率減慢且所需時(shí)間范圍變寬。當(dāng)OLE質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí),抗四環(huán)素大腸桿菌和大腸桿菌在培養(yǎng)18 h后細(xì)菌數(shù)迅速增加,在18~30 h為對數(shù)生長狀態(tài),但菌體濃度低于5 mg/mL組。圖2(A)表明添加OLE既可以延緩抗四環(huán)素大腸桿菌進(jìn)入對數(shù)生長期的時(shí)間,又可以降低其菌體生長量,OLE對該菌株有較強(qiáng)的抑制作用。圖2(B)表明OLE對大腸桿菌的抑制作用相對較弱。油橄欖葉中酚類物質(zhì)具有抗腫瘤、抗癌作用,此外還有廣泛的抑菌和抗氧化作用,如橄欖苦苷、蘆丁、咖啡酸等及其一定比例混合物均顯示較強(qiáng)的體外活性,具有聯(lián)合抗菌作用。Lee等[14]發(fā)現(xiàn)橄欖葉提取物中的橄欖苦苷和咖啡酸均表現(xiàn)出對微生物的抑制作用,且組合酚類化合物的抗菌效果顯著高于酚類化合物單體。

    2.3.3 OLE對葡萄球菌生長曲線的影響(見圖3)

    注:A為表皮葡萄球菌,B為金黃色葡萄球菌(SH7),C為金黃色葡萄球菌。

    由圖3(A)可知,不添加OLE的培養(yǎng)基中表皮葡萄球菌培養(yǎng)12 h左右進(jìn)入對數(shù)生長期,培養(yǎng)24 h時(shí)進(jìn)入平穩(wěn)期,之后細(xì)菌數(shù)開始快速降低。OLE質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí),表皮葡萄球菌在培養(yǎng)18 h之后細(xì)菌數(shù)增加較快,18 h左右進(jìn)入對數(shù)生長期,培養(yǎng)30 h后達(dá)到最大菌液濃度,此時(shí)表皮葡萄球菌對數(shù)生長期相對對照組被延緩,說明OLE對表皮葡萄球菌有一定抑菌作用。在OLE質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí),表皮葡萄球菌在培養(yǎng)6 h后繁殖較快,數(shù)目增加明顯,18 h左右進(jìn)入對數(shù)生長期,培養(yǎng)30 h后細(xì)菌數(shù)開始下降。由圖3(B)可知,當(dāng)不添加OLE時(shí),金黃色葡萄球菌(SH7)在開始培養(yǎng)后持續(xù)快速增長。OLE質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí),培養(yǎng)6 h細(xì)菌開始適應(yīng)環(huán)境,12 h后快速生長,對數(shù)生長期出現(xiàn)在培養(yǎng)12~36 h之間。OLE質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí),金黃色葡萄球菌(SH7)生長曲線趨勢與5 mg/mL組相一致。由圖3(C)可知,不添加OLE時(shí),培養(yǎng)6 h后金黃色葡萄球菌進(jìn)入對數(shù)生長期。OLE質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí),培養(yǎng)12 h后金黃色葡萄球菌菌數(shù)開始增加,18 h后進(jìn)入對數(shù)生長期,相比對照組,此時(shí)對數(shù)生長期被延緩,細(xì)菌生長速率減慢。當(dāng)OLE質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí),金黃色葡萄球菌在培養(yǎng)18 h后細(xì)菌數(shù)迅速增加,于18 h達(dá)對數(shù)生長狀態(tài)。以上結(jié)果表明,OLE對葡萄球菌生長曲線的對數(shù)生長期均具有延緩作用。吳遵秋等[12]利用稀釋法分析了橄欖苦苷對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、芽孢桿菌生長曲線的影響,結(jié)果顯示橄欖苦苷對3種細(xì)菌生長曲線的影響均表現(xiàn)為延緩細(xì)菌的對數(shù)生長期,與本研究結(jié)果類似。植物源提取的酚類物質(zhì)具有廣譜的抑菌性,特別是黃酮類化合物,從不同物種中提取的黃酮類化合物抑菌作用均不相同。橄欖黃酮對變形桿菌有較強(qiáng)的抑制作用,對痢疾桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用更強(qiáng);橄欖黃酮對牛乳中微生物的活動(dòng)同樣具有抑制作用,而且隨著橄欖黃酮濃度的增加,抑菌作用明顯增加[15]。OLE對細(xì)菌對數(shù)生長期的延緩作用是其中多種活性物質(zhì)相互協(xié)同作用的結(jié)果。

    2.3.4 OLE對銅綠假單胞菌生長曲線的影響(見圖4)

    圖4 不同質(zhì)量濃度OLE對銅綠假單胞菌生長曲線的影響

    由圖4可知,與對照組相比,當(dāng)OLE質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí),對銅綠假單胞菌的生長抑制作用較小,但是當(dāng)OLE質(zhì)量濃度增至10 mg/mL時(shí),生長抑制作用較明顯,尤其是在生長后期。結(jié)果表明在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi),OLE對銅綠假單胞菌的生長抑制作用與其質(zhì)量濃度直接相關(guān)。已有的研究顯示橄欖黃酮和橄欖多酚對桿菌、葡萄球菌均有較強(qiáng)的抑制作用,且隨著濃度的增加抑菌作用明顯增加[15-16]。因此,橄欖葉提取物中有效成分濃度與抑菌活性之間存在顯著的正相關(guān)性。

    3 結(jié) 論

    (1)采用稀釋法分析了OLE對8種致病菌的MIC和MBC。結(jié)果顯示,OLE與鹽酸小檗堿在測試質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對銅綠假單胞菌無抑制作用,對表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌及大腸桿菌的抑制作用較強(qiáng),對蠟狀芽孢桿菌、抗四環(huán)素大腸桿菌的抑制作用較弱。

    (2)OLE對8種致病菌的抑菌活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:在OLE質(zhì)量濃度為20 mg/mL時(shí),OLE對大腸桿菌的抑制作用最強(qiáng),對大腸桿菌和抗四環(huán)素大腸桿菌的抑菌圈直徑分別可達(dá)(25.07±3.02)mm和(24.89±1.58)mm;金黃色葡萄球菌為極度敏感,金黃色葡萄球菌和金黃色葡萄球菌(SH7)抑菌圈直徑分別為(21.35±2.06)mm和(20.01±1.21)mm;而對芽孢桿菌抑制作用相對較弱,處于中度敏感狀態(tài);對銅綠假單胞菌的抑制作用最弱,處于低度敏感狀態(tài)。

    (3)OLE主要通過延長細(xì)菌生長的延遲期,延緩對數(shù)生長期和降低菌體濃度對測試菌起抑制作用,而且隨著OLE質(zhì)量濃度的升高抑制作用增強(qiáng)。

    以上結(jié)果表明,富含橄欖苦苷和黃酮類物質(zhì)的橄欖葉提取物具有較強(qiáng)的抑菌活性,在植物源綠色抑菌制劑開發(fā)領(lǐng)域具有良好的市場前景。

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