小球藻不飽和脂肪酸的提取工藝及功能活性研究進(jìn)展

葛勝晗，林以琳，李世洋，胡嘉淼，林少玲

(福建農(nóng)林大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，福州 350000)

小球藻(Chlorella)是單細(xì)胞藻類，是綠藻門小球藻科中的一個(gè)重要的屬，包括大約10個(gè)種，生態(tài)分布廣，易于培養(yǎng)，生長(zhǎng)速度快，應(yīng)用價(jià)值高[1]。小球藻活性成分主要有多糖、小球藻生長(zhǎng)因子(CGF)[2]、多不飽和脂肪酸[3]等，主要成分如表1所示。小球藻資源的開發(fā)被視為20世紀(jì)90年代世界生物技術(shù)領(lǐng)域取得重要進(jìn)展之一[4]。

表1 小球藻主要成分 g/100 g

不飽和脂肪酸對(duì)人體有重要的生理功能,能調(diào)節(jié)人體的脂質(zhì)代謝、治療和預(yù)防心腦血管疾病、抗炎、抗癌、抗肥胖、促進(jìn)幼體發(fā)育和提高幼體成活率、預(yù)防和改善老年癡呆等[5-6]。小球藻油脂中亞油酸、亞麻酸等不飽和脂肪酸含量很高，不同種類小球藻油脂中的不飽和脂肪酸含量不同，其中以異養(yǎng)蛋白核小球藻的為最高。小球藻不飽和脂肪酸的研究近年來(lái)成為研究熱點(diǎn)，更多高效、環(huán)保、便捷的提取方式被開發(fā)改進(jìn)，其多種生物活性也得到了研究驗(yàn)證。本文對(duì)小球藻不飽和脂肪酸的提取、富集和功能活性研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，為其進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

1 小球藻不飽和脂肪酸的提取

小球藻不飽和脂肪酸的提取原料一般有小球藻干粉和濕藻兩種，提取流程如圖1所示。

圖1 小球藻不飽和脂肪酸提取流程

1.1 破壁

小球藻油都在藻細(xì)胞內(nèi)，而藻細(xì)胞被堅(jiān)實(shí)的細(xì)胞壁包裹著，直接提取油脂的效率非常低，因此小球藻的破壁處理極具必要性。破壁方法主要有物理破壁、化學(xué)破壁和生物破壁法。物理破壁法選擇更多且操作方便，而化學(xué)法和生物法相對(duì)而言更加快捷、高效。

常見的微藻細(xì)胞物理破壁法有機(jī)械法和非機(jī)械法(如圖2所示)，其中部分方法因自身限制和技術(shù)進(jìn)步已少有研究應(yīng)用，目前仍在研究開發(fā)利用的方法有超聲法、高壓均質(zhì)法、脈沖電場(chǎng)法等。物理破壁法通?？膳c提取同時(shí)進(jìn)行。

圖2 物理破壁法[7]

化學(xué)破壁法主要有化學(xué)滲透法、酸熱法等。化學(xué)滲透法是利用穿透性強(qiáng)的有機(jī)溶劑(如甲醇)，直接穿透細(xì)胞壁進(jìn)行油脂的提取。魯龍等[8]優(yōu)化濃硫酸破碎小球藻細(xì)胞壁工藝條件為：物料質(zhì)量濃度100 g/L，濃硫酸質(zhì)量為干物質(zhì)質(zhì)量的25%,水浴溫度90℃，水浴時(shí)間1.5 h。在最優(yōu)條件下，異養(yǎng)小球藻的脂提率可達(dá)55%以上。

生物破壁法主要有酶法和菌法。何擴(kuò)等[9]研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)合酶或糖化酶與纖維素酶共同使用在小球藻破壁中，會(huì)對(duì)小球藻破壁起消極作用，破壁效果不如單一使用纖維素酶。鄧春芳等[10]探究了不同溶藻菌對(duì)小球藻破壁效果的影響，得到破壁率由高到低為嗜水氣單胞菌(Aeromonahydrophila)>熒光假單胞菌(Pseudomonasflurescens)>脫氮胞鰻氏菌(Bowmanelladenitrificans)>環(huán)狀芽孢桿菌(Bacilluscirculars)>漳州科迪亞菌(Kordiasp.)。

1.2 脂肪酸的提取

1.2.1 油脂水解法提取脂肪酸

油脂水解法即先提取油脂，再通過(guò)水解油脂得到脂肪酸。小球藻油脂的提取有溶劑浸提法、超臨界CO2萃取法等[11]。溶劑浸提法已獲得十分全面的研究，常以超聲輔助進(jìn)行。常用的提取溶劑有正己烷、石油醚、甲醇、氯仿、二氯甲烷以及混合溶劑體系。周佩佩[12]研究發(fā)現(xiàn)，二氯甲烷-甲醇溶劑體系對(duì)海藻中脂質(zhì)的提取率最高。Hadrich[13]、陳煒[14]、肖艷[15]等均以氯仿-甲醇(體積比2∶1)為浸提溶劑提取小球藻細(xì)胞脂質(zhì)，但氯仿、正己烷等因其有害性而在工業(yè)生產(chǎn)中受到嚴(yán)格控制，為此，Mahmood等[16]研究開發(fā)了環(huán)境友好型生物溶劑(乙酸乙酯、乳酸乙酯、環(huán)戊基甲醚(CPME)和2-四氫呋喃)提取小球藻油，并發(fā)現(xiàn)這些生物溶劑的提取性能都優(yōu)于正己烷，尤其是2-四氫呋喃和乳酸乙酯的提取率分別為正己烷的2倍和3倍。但生物溶劑雖然能提高油脂提取率，但會(huì)降低提取的油脂中多不飽和脂肪酸的含量，在食品工業(yè)應(yīng)用中可利用性不高。

與溶劑浸提法相比，超臨界CO2萃取法更加綠色溫和[17]，但對(duì)于設(shè)備和條件要求較為嚴(yán)格。近年來(lái)，超臨界萃取中各種CO2擴(kuò)充液(CXLs)在油脂提取中獲得了廣泛研究[18]，在CXL中溶解一定量的CO2可以生成具有良好輸運(yùn)性質(zhì)的混合物，如密度、黏度、擴(kuò)散率和溶解度，而適量的極性有機(jī)溶劑的存在有利于溶質(zhì)的溶解[19]。Yang等[20]發(fā)現(xiàn)，CO2-甲醇擴(kuò)充液(CXM)是一種優(yōu)于甲醇、乙醇、加壓甲醇和乙醇的油脂提取溶劑，在優(yōu)化操作條件(甲醇流速1 mL/min，CO2流速3 mL/min，壓力5.5 MPa，溫度358 K)下，小球藻油得率可達(dá)16%。宋啟煌等[21]采用超臨界CO2從小球藻中萃取脂質(zhì)，得到最佳的萃取條件為：壓力30 MPa，溫度35℃，CO2耗量250 mL/g，改性劑乙酸乙酯添加量為藻質(zhì)量的70%。

提取的小球藻油脂的水解一般采用先皂化、除去不皂化物，再用鹽酸將pH調(diào)到2～3，然后用正己烷萃取、分離得到游離脂肪酸[22]。

1.2.2 堿提法提取脂肪酸

堿提法也稱為皂化提取法，該法跳過(guò)脂質(zhì)提取的步驟，直接將提取和皂化過(guò)程在一個(gè)操作中實(shí)現(xiàn)，相較于油脂提取法更為簡(jiǎn)便直接，但研究和使用的較少。堿提法常用的堿為NaOH或KOH，常用的溶劑為甲醇，具體操作流程為：往藻粉中加入飽和皂化溶液，反應(yīng)數(shù)小時(shí)或4℃過(guò)夜；抽濾，濾液中加入HCl調(diào)節(jié)pH至1～2；加入正己烷萃取分液，即可得到小球藻脂肪酸。吳慶[23]分別采用甲醇-KOH、乙醇-KOH和異丙醇-KOH 3種皂化劑對(duì)小球藻不飽和脂肪酸進(jìn)行提取，經(jīng)尿素包含富集多不飽和脂肪酸，發(fā)現(xiàn)，以甲醇-KOH作為皂化劑多不飽和脂肪酸色譜峰的分離效果損好，且較乙醇-KOH和異丙醇-KOH能得到更高的不飽和度。

1.3 不飽和脂肪酸的富集

根據(jù)脂肪酸理化性質(zhì)，如脂肪酸中雙鍵數(shù)目、位置、碳鏈長(zhǎng)度、溶解度等的不同，可利用多種方法將不飽和脂肪酸從混合脂肪酸中分離。常用的富集方法有有機(jī)溶劑分離法、尿素包合法、銀離子絡(luò)合法、層析法、分子蒸餾法、酶解法等，幾種常見的富集方法的特點(diǎn)如表2所示。目前關(guān)于小球藻不飽和脂肪酸的富集研究較少，且以尿素包合法為主[14]。因此，可探索將分子蒸餾法、吸附分離法、低溫結(jié)晶法等已用于不飽和脂肪酸富集的方法用于小球藻不飽和脂肪酸富集工藝中。

表2 4種多不飽和脂肪酸富集純化方法比較(以α-亞麻酸為例)[24]

2 小球藻不飽和脂肪酸的功能活性

2.1 改善記憶活性

對(duì)于不飽和脂肪酸，尤其是DHA、EPA的改善記憶活性早有大量研究和定論，但是對(duì)于小球藻不飽和脂肪酸在這方面的表現(xiàn)近年才得到較多的關(guān)注。Yukio等[25]用添加0.08%DHA的培養(yǎng)液培養(yǎng)的小球藻提取小球藻油(DFCO)，發(fā)現(xiàn)DFCO的攝食干預(yù)能提高小鼠大腦中DHA含量，降低C18∶0含量。長(zhǎng)期的DFCO膳食干預(yù)能顯著提高小鼠大腦內(nèi)DHA的含量，顯著提高小鼠對(duì)于迷宮的記憶，有望預(yù)防和治療阿爾茨海默病。Morgese等[26]的研究進(jìn)一步表明，急性口服富含n-3和n-6 不飽和脂肪酸的小球藻脂提物(CLE)能使大鼠海馬體去甲腎上腺素(NA)和血清素(5-HT)升高，改善其短期記憶。但該項(xiàng)研究同時(shí)也表示，經(jīng)過(guò)CLE處理的大鼠在探索能力、運(yùn)動(dòng)活動(dòng)、焦慮和類似抑郁的行為方面無(wú)顯著變化，而社會(huì)行為顯著減少，因此在使用CLE作為膳食補(bǔ)充劑時(shí)需謹(jǐn)慎，也許具有潛在的毒性作用。

2.2 免疫活性

張士嬌[22]對(duì)小球藻EPA對(duì)小鼠免疫功能的影響進(jìn)行研究，結(jié)果表明：給小鼠喂食小球藻EPA后可以顯著減弱環(huán)磷酰胺造成的小鼠脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)、血清溶血素等免疫器官的影響,減緩環(huán)磷酰胺所造成的小鼠免疫低下的程度；在細(xì)胞免疫水平上,高劑量的EPA可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的增殖活性、吞噬活性以及LPS和ConA誘導(dǎo)的脾細(xì)胞的增殖活性,NK細(xì)胞的殺傷活性；在mRNA表達(dá)水平上，EPA可以有效預(yù)防環(huán)磷酰胺對(duì)小鼠脾細(xì)胞中IL-2、IL-6、IL-12、TNF-α、IFN-γ 5種細(xì)胞免疫因子及巨噬細(xì)胞中IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α、IFN-γ 5種細(xì)胞免疫因子造成的mRNA表達(dá)水平的降低,并且可以提高正常小鼠的免疫調(diào)節(jié)功能。并且該研究還表明，并不是EPA的劑量越高，作用效果越好。萬(wàn)照東[27]則在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步開發(fā)制作了小球藻粉條，就小球藻粉條的免疫活性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，小球藻粉條依舊具有良好的免疫活性，能減輕環(huán)磷酰胺造成的小鼠免疫低下的程度，調(diào)節(jié)與免疫相關(guān)的酶活性和mRNA表達(dá)水平，并表示其免疫作用是通過(guò)小球藻中含量豐富的EPA達(dá)到的。

2.3 抗炎和抗氧化活性

厲劍劍等[28]采用超臨界CO2萃取小球藻油，雖然小球藻油的抗氧化能力不及葉黃素晶體，但由于其含有豐富的不飽和脂肪酸，使其DPPH自由基清除率遠(yuǎn)高于葉黃素晶體。研究證實(shí)，在眾多疾病如哮喘[29-30]、肥胖[31-32]等的成病機(jī)理中，氧化應(yīng)激和炎癥的作用密不可分，而小球藻不飽和脂肪酸的抗氧化和抗炎活性表現(xiàn)良好。Park等[33]用不同濃度的小球藻二氯甲烷提取物(CDE)孵育用脂多糖(LPS)刺激引起氧化應(yīng)激和炎癥的264.7小鼠巨噬細(xì)胞，結(jié)果表明，CDE預(yù)處理LPS刺激的巨噬細(xì)胞能夠通過(guò)提高谷胱甘肽(GSH)和抗氧化酶(如過(guò)氧化物歧化酶)活性以及抑制mRNA轉(zhuǎn)錄降低導(dǎo)致的iNOS蛋白表達(dá)來(lái)抑制NO的產(chǎn)生，從而改善炎癥性疾病以及抑制氧化應(yīng)激。Panahi等[34]研究表明，含有3.34%不飽和脂肪酸的小球藻提取物(CVE)作為膳食干預(yù)能有效平衡所有氧化應(yīng)激引起的改變，從而防止哮喘，并且有效促進(jìn)炎癥性肺部疾病患者的氣道重塑。

2.4 抗菌活性

肖艷等[15]對(duì)小球藻油進(jìn)行粗提、多不飽和脂肪酸的分離以及EPA的純化，并將處理后的脂肪酸分別進(jìn)行甲酯化處理后進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，研究結(jié)果表明，處理后的脂肪酸甲酯對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草桿菌具有一定的抑制和殺滅作用，而對(duì)大腸桿菌和綠膿桿菌沒(méi)有明顯的抑菌效果。江紅霞[35]研究發(fā)現(xiàn)小球藻脂肪酸提取物(γ-亞麻酸含量最高)對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑制效果要好于革蘭氏陰性菌。

2.5 抗腫瘤活性

小球藻不飽和脂肪酸的抗腫瘤活性的研究主要以小球藻油的形式進(jìn)行。童茜茜等[36]通過(guò)超臨界CO2萃取得到小球藻精油，并就其對(duì)人類結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和凋亡的作用進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，小球藻精油呈劑量依賴性抑制HT29細(xì)胞增殖(P<0.01)，并引起明顯的細(xì)胞周期阻滯，將細(xì)胞周期阻滯在S(G2/M)期，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞具有增殖抑制效應(yīng)及凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)，推測(cè)小球藻精油抗腫瘤作用可能是脂肪酸和小分子揮發(fā)性物質(zhì)協(xié)同、多靶點(diǎn)作用的結(jié)果。小球藻精油是一種極具發(fā)展?jié)摿Φ目菇Y(jié)腸癌藥物，而其中不飽和雙鍵是其抗腫瘤作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

3 小球藻不飽和脂肪酸在食品中的應(yīng)用與展望

早從20世紀(jì)90年代開始，就已經(jīng)出現(xiàn)大量與小球藻相關(guān)的小球藻食品，如小球藻片、小球藻飲料等。針對(duì)小球藻不飽和脂肪酸功能活性所開發(fā)的功能性食品中，小球藻粉條已被證實(shí)有良好的免疫活性，且其制作工藝和配料也非常常見易得。還有針對(duì)小球藻不飽和脂肪酸中富含DHA、EPA的特點(diǎn)，開發(fā)增強(qiáng)記憶力的保健食品，尤其適用于學(xué)生和老年人，已被證實(shí)每日定量食用可以達(dá)到健腦效果。小球藻不飽和脂肪酸的提取和功能活性近年已得到廣泛關(guān)注、研究，并且在食品工業(yè)生產(chǎn)中得到了一定應(yīng)用，但有很多期待的功能活性尚未得到研究證明(如降血脂、抗肥胖等)，已證明的部分功能活性也缺乏更完善的機(jī)理探索。小球藻不飽和脂肪酸還需更廣泛、持續(xù)、深入的研究，其在食品工業(yè)生產(chǎn)中大規(guī)模的應(yīng)用也仍然需要進(jìn)一步的開發(fā)。小球藻不飽和脂肪酸的開發(fā)應(yīng)用將為食品科學(xué)注入新的活力。