公英解毒洗劑對下肢靜脈性潰瘍患者血清MMP-3及TIMP-1 表達的影響的研究

趙 波，王雁南，許永楷，梁 剛，李涵泊，張 玥，陳柏楠

下肢靜脈性潰瘍是多種下肢靜脈性疾病的常見晚期并發(fā)癥，如下肢靜脈曲張、下肢深靜脈血栓形成后遺癥、原發(fā)性下肢深靜脈瓣膜功能不全等。該病因靜脈高壓難以糾正，局部組織缺氧、感染及菌群失調(diào)、組織代謝障礙等問題而經(jīng)久難愈，且易復發(fā)從而嚴重影響患者的生活質(zhì)量，已成為當今醫(yī)學界的一個難題[1-3]。公英解毒洗劑是山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院使用多年的經(jīng)典外治方劑，經(jīng)多年的臨床檢驗證實其療效顯著、安全可靠，而且在前期的科研工作中已經(jīng)從宏觀角度對公英解毒洗劑治療操作規(guī)范進行了系統(tǒng)性的研究，建立了標準化熏洗流程，并對肢體慢性潰瘍病人熏洗前后瘡面潰瘍周圍血流灌注量、氧分壓變化情況進行了監(jiān)測。但從微觀角度，對公英解毒洗劑的作用機制及作用靶點尚有待觀察研究。本研究旨在通過監(jiān)測基質(zhì)金屬蛋白酶-3（MMP-3）和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1（TIMP-1）的動態(tài)變化，從分子生物學角度闡述公英解毒洗劑的作用機制及作用靶點，為公英解毒洗劑的臨床推廣應用提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 病例來源 選取山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院周圍血管病科2016 年5 月1 日—2018 年5 月31日收治的下肢靜脈性潰瘍患者75 例。發(fā)病部位左下肢36 例，右下肢29 例，雙下肢10 例；病因下肢靜脈曲張32 例，下肢深靜脈瓣膜功能不全16 例，下肢深靜脈血栓形成后遺癥25 例，下肢靜脈畸形2 例；潰瘍病程3～42 個月。應用隨機數(shù)字表分為對照組25 例，復方黃柏液組25 例，公英解毒洗劑組25 例。對照組25 例中男15 例，女10 例；年齡54～78（59.1±4.5）歲；復方黃柏液組25 例中男12 例，女13 例；年齡49～71（59.4±6.6）歲。公英解毒洗劑組25 例中男11 例，女14 例；年齡44～77（60.5±8.3）歲。三組患者年齡、性別構(gòu)成差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。所有患者均簽署知情同意書。

1.1.2 診斷標準 參照國家中醫(yī)藥管理局制定的《中醫(yī)病證診斷療效標準》進行診斷：（1）以小腿內(nèi)側(cè)多見。（2）局部初起常先癢后痛，色紅，糜爛，迅速轉(zhuǎn)為潰瘍。潰瘍大小不等，呈灰白或暗紅色，表面或附有黃色膿苔，膿水穢臭難聞。病久潰瘍邊緣變厚高起，四周皮色黯黑，漫腫或伴有濕疹，收口后易反復發(fā)作。（3）多見于下肢患有筋脈橫解（靜脈曲張）的患者。

1.1.3 納入標準 （1）符合上述下肢靜脈性潰瘍診斷標準者。（2）潰瘍面積≤20 cm2。

1.1.4 排除標準 （1）動脈缺血性潰瘍，如糖尿病肢體動脈閉塞癥、血栓閉塞性脈管炎、閉塞性動脈硬化癥等發(fā)生潰瘍者。（2）踝肱指數(shù)（ABI）＜0.8。（3）壞死性血管炎等變態(tài)反應性疾病伴有皮膚潰瘍者。（4）特異性潰瘍，如神經(jīng)性潰瘍、放射性潰瘍等。（5）合并嚴重化膿性感染者，如膿毒血癥。（6）合并嚴重心、肝、腎疾患及惡性腫瘤、血液系統(tǒng)疾病、結(jié)締組織疾病和精神類疾病者。（7）有外治療法禁忌證者。

1.2 研究方法

1.2.1 公英解毒洗劑（批件號：魯藥制再注20090125）方藥組成及使用方法 （1）方藥組成：蒲公英30 g，黃柏、連翹、苦參、木鱉子各12 g，金銀花、丹皮、赤芍、白芷、甘草各10 g。（2）加工及使用方法：中藥飲片購自山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，用自動煎藥機（北京東華原醫(yī)療設(shè)備有限責任公司）煎煮成100 mL 的袋裝濃縮液。

1.2.2 治療方法 在給予患者基礎(chǔ)疾病對癥治療的基礎(chǔ)上，按研究方案進行創(chuàng)面的局部治療?；A(chǔ)治療包括中藥湯劑內(nèi)服，口服及靜滴活血化瘀中成藥；合并感染者針對膿培養(yǎng)藥敏結(jié)果應用抗生素靜滴；糖尿病患者予以檢測血糖并降糖治療；心腦血管患者予以監(jiān)控血壓并適當應用降壓藥等。（1）對照組：創(chuàng)面進行常規(guī)清潔換藥，創(chuàng)面周圍以酒精棉球消毒，創(chuàng)面內(nèi)以0.9%生理鹽水棉球蘸拭后，無菌包扎。（2）復方黃柏液組和公英解毒洗劑組：創(chuàng)面周圍以酒精棉球消毒，創(chuàng)面內(nèi)以0.9%生理鹽水棉球蘸拭后，然后應用復方黃柏液、公英解毒洗劑分別進行濕敷治療，無菌包扎。兩組治療頻率均為每天1 次，均于治療的第1、7、14天觀察療效性指標，并抽取血液標本。

1.2.3 療效性指標 （1）創(chuàng)面愈合情況觀察：于治療第1、7、14 天，觀察創(chuàng)面顏色、滲液量、腫脹程度等。（2）創(chuàng)面愈合率：應用數(shù)碼相機拍照，ImageJ2x 軟件記錄創(chuàng)面面積并計算創(chuàng)面愈合率=（創(chuàng)面初始面積－給藥后第n 天創(chuàng)面面積）/創(chuàng)面初始面積×100%。（3）炎癥因子水平檢測：于治療第1、7、14 天抽取患者足背靜脈血10 ml，置于肝素抗凝管中，送山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院檢驗科應用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)法檢測MMP-3、TIMP-1 及超敏C-反應蛋白（hs-CRP）水平。

2 研究結(jié)果

2.1 創(chuàng)面愈合率 治療第7 天，創(chuàng)面愈合率由高到低依次為：公英解毒洗劑組＞復方黃柏液組＞對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；治療第14天，公英解毒洗劑組和復方黃柏液組的創(chuàng)面愈合率均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），但公英解毒洗劑組與復方黃柏液組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 各組治療不同特點創(chuàng)面愈合率的比較

2.2 血清中hs-CRP 的表達 治療第1 天，三組血清hs-CRP表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；治療第7 天，三組血清hs-CRP 由高到低依次為：對照組＞復方黃柏液組＞公英解毒洗劑組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；治療第14 天，復方黃柏液組和公英解毒洗劑組的血清hs-CRP 均低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但公英解毒洗劑組與復方黃柏液組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表2。

表2 各組不同時點血清中hs-CRP 含量比較 （mg/L）

2.3 血清中MMP-3 的表達 治療第1 天，三組間血清中MMP-3 水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；治療第7 天，MMP-3 表達水平由高到低依次為：對照組＞復方黃柏液組＞公英解毒洗劑組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；治療第14 天，復方黃柏液組和公英解毒洗劑組的血清MMP-3 均低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但公英解毒洗劑組與復方黃柏液組血清中MMP-3 的表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表3。

表3 各組不同時點血清中MMP-3 含量比較(μg/L)

2.4 血清中TIMP-1 的表達 治療第1 天，三組間TIMP-1 表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；治療第7 天，TIMP-1 表達水平由高到低依次為：公英解毒洗劑組＞復方黃柏液組＞對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；治療第14 天，復方黃柏液組和公英解毒洗劑組的TIMP-1 水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但公英解毒洗劑組與復方黃柏液組血清中TIMP-1 水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表4。

表4 各組不同時點血清中TIMP-1 含量比較 (μg/L）

3 討論

近年來，隨著人們生活方式的改變和人口的老齡化，下肢靜脈性潰瘍的發(fā)病率正以驚人的速度逐年增加，因其病程長、涉及學科多、發(fā)病機制復雜、治療難度大且治療費用高等特點，嚴重影響著患者的生活和工作，加重了家庭和社會負擔，成為創(chuàng)面修復領(lǐng)域研究的重點和難點[4-5]。下肢靜脈性潰瘍創(chuàng)面修復涉及諸多因素，近年來研究表明基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是參與細胞外基質(zhì)（ECM）降解的主要酶蛋白家族，在傷口愈合、血管增生等正常生理過程中，參與基質(zhì)蛋白的細胞外降解和分解，促使細胞穿越基底膜[6-8]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)MMP-3 也稱基質(zhì)溶素-1，其能夠降解多種ECM 成分，參與組織形態(tài)發(fā)生、創(chuàng)面修復、炎癥反應等生理、病理過程，其水解底物包括III、IV、V、IX 型膠原，蛋白聚糖、纖維連接蛋白、層粘連蛋白等，是一種重要的細胞外基質(zhì)調(diào)節(jié)酶[9-10]。MMP-3 能通過水解各種ECM 成分而激活其他的MMPs（如MMP1、7、8、13、9等），因而被認為其在MMPs 的生物活性中起始動作用[11-12]。MMP-3 的表達可見于組織創(chuàng)傷后的不同時間段，有研究顯示甚至在創(chuàng)傷后28 天仍可檢測到MMP-3 的表達，表明MMP-3 不僅參與了ECM 降解而且也與創(chuàng)面修復、ECM 重塑和組織改建密切相關(guān)，并可能參與慢性炎癥中活性調(diào)節(jié)進而影響創(chuàng)傷愈合延遲或纖維化等?；|(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMPs）是一組低分子質(zhì)量的蛋白，廣泛分布于組織和體液中，可由成纖維細胞、上皮細胞、內(nèi)皮細胞等產(chǎn)生[13]。目前發(fā)現(xiàn)的TIMPs家 族 成 員 有4 種：TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4。其中TIMP-1 能被多種細胞因子誘導產(chǎn)生，以可逆的非共價鍵形式按1:1 比例與MMP-3結(jié)合成復合物。此外TIMPs 是多功能分子，不僅具有細胞生長因子樣作用，還能促進成纖維細胞增生及膠原合成，使ECM 沉積并抑制其降解，調(diào)控ECM 代謝和抑制血管的生成等作用。MMPs與TIMPs 是膠原代謝的主要調(diào)節(jié)物質(zhì)，兩者相互作用共同維持著潰瘍?nèi)庋拷M織基質(zhì)的分解與重構(gòu)[14-15]。MMP-3、TIMP-1 是目前國內(nèi)外研究的熱點，可較客觀的反映潰瘍?nèi)庋拷M織的生物學狀態(tài)，判定疾病的預后。

中醫(yī)學對下肢靜脈性潰瘍的治療有著悠久的歷史，“祛腐生肌”是中醫(yī)外科瘡瘍外治過程中的獨特經(jīng)驗和方法，也是中醫(yī)辨證論治思想在外科證治中的生動體現(xiàn)，其中具有代表性的山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院驗方“公英解毒洗劑”經(jīng)40余年臨床經(jīng)驗證實療效顯著、安全可靠。王雁南等[16]應用公英解毒洗劑治療靜脈性潰瘍治愈率28.95%，顯愈率71.05%，有效率97.37%，臨床效果顯著。在藥理方面目前國內(nèi)對公英解毒洗劑的單味藥物的藥理研究比較多，如公英解毒洗劑中的主要成分為蒲公英，苦參、黃柏、連翹、金銀花、赤芍、白芷、木鱉子等，功效為清熱解毒、消腫止痛[17]。方中前六位中藥均有清熱解毒的功效，現(xiàn)代研究提示其均有廣譜抗菌作用，其中蒲公英、苦參、黃柏、金銀花對抑制葡萄球菌的生長尤為突出[18]。此外赤芍還可散瘀消腫，入肝經(jīng)血分以活血散瘀止痛，現(xiàn)代藥理顯示其具有抗凝、抗血栓作用。木鱉子可消腫散結(jié)，攻毒療瘡，有抑制葡萄球菌及化膿鏈球菌、抗病毒、抗炎作用。但是一劑中藥的功效并不是單味藥物功效的簡單疊加，而是一個復雜的生物和化學變化的過程，雖然前期的臨床研究已經(jīng)對不同溫度、濃度公英解毒洗劑治療下肢靜脈性潰瘍的療效進行了系統(tǒng)的研究和總結(jié)，對其促進糖尿病潰瘍愈合的機理進行了初步的總結(jié)和分析，但總體而言其療效機理的研究還僅僅局限在抗菌、消炎、改善微循環(huán)等方面，對外用藥物具體的療效機制、作用靶點及干預組織修復方面，尤其是從信號通路及分子生物學的角度和深度有待進一步的研究和總結(jié)。因此，本課題選取山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院的驗方“公英解毒洗劑”和目前已廣泛應用于臨床的上市藥物“復方黃柏液”，以這兩種臨床療效確切的外用藥作為代表藥物，通過測定足背靜脈血中不同時期MMP-3、TIMP-1 蛋白的表達情況，探討公英解毒洗劑的作用機制、作用靶點及下肢靜脈性潰瘍難愈合的分子機制，從而為疾病的治療提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

本研究通過統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，治療的第7、14 天，公英解毒洗劑組與復方黃柏液組血清中hs-CRP 和MMP-3 的表達顯著低于對照組，表明hs-CRP 與MMP-3 都可以反映機體炎性反應的狀況，具有較高的靈敏度。另外，hs-CRP 的表達變化也更加證實了公英解毒洗劑可有效抑制炎癥反應，是炎性反應早期的首選藥物。而MMP-3、TIMP-1 通過對ECM 的降解以調(diào)控創(chuàng)面肉芽組織的過度增生。公英解毒洗劑組和復方黃柏液組的創(chuàng)面愈合率高于對照組，提示公英解毒洗劑和復方黃柏液均有清熱解毒祛腐的功效，符合傳統(tǒng)中醫(yī)外科“祛腐生肌”的理論。再有，研究結(jié)果顯示公英解毒洗劑組的MMP-3、hs-CRP 表達均低于復方黃柏液組，表明公英解毒洗劑在抑菌、抗炎方面的功效優(yōu)于復方黃柏液，值得臨床推薦。但本課題尚未引入“生肌”類藥物進行比較，因此對下肢靜脈性潰瘍難愈合的因素尚需進一步的研究。