丹黃消炎液對糖尿病小鼠創(chuàng)面組織中HIF1-α及VEGF 表達的影響

劉國濤，王 軍，周 玉，盧增珍

慢性創(chuàng)面難愈是糖尿病最常見的并發(fā)癥之一，往往反復發(fā)作、遷延不愈、治療費用高[1]。現代研究表明，糖尿病創(chuàng)面血管新生的主要機制與低氧誘導因子1-α（HIF1-α）/血管內皮生長因子（VEGF）軸密切相關[2]。雖然表皮生長因子類凝膠可以促進創(chuàng)面VEGF 的表達，但不適用于伴有感染的糖尿病創(chuàng)面[3]。祛瘀生肌類中藥不僅可以促進創(chuàng)面壞死組織的脫落，還可以促進VEGF 表達[4]。課題組前期臨床研究表明，丹黃消炎液外敷對糖尿病創(chuàng)面具有很好的療效[5]，但具體作用機制尚不明確。本研究通過建立I 型糖尿病小鼠創(chuàng)面模型，探討丹黃消炎液通過HIF1-α/VEGF 治療糖尿病創(chuàng)面的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF 級雄性BALB/c 小鼠共60 只，8周齡，體質量（19±2）g，由中國食品藥品檢定研究院提供，實驗動物許可證號SCXK（京）2014-0013。

1.2 藥物 丹黃消炎液為天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院院內制劑，由天津中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院提供（主要成分：黃芪、丹參、皂角刺、當歸、銀花、大黃、關黃柏。其中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚和大黃甲醚的總含量不少于生藥的1.5%），每克含生藥6.67 g。0.9%氯化鈉溶液，國藥準字：H37022336，山東辰欣藥業(yè)股份有限公司。醫(yī)用碘伏，國藥準字：20180811，山東利爾康醫(yī)療科技股份有限公司。

1.3 主要試劑及儀器 鏈脲佐菌素（STZ，批號：Y161101），北京索萊寶科技用有限公司；檸檬酸（批號：20180401），天津大茂化學試劑廠；檸檬酸鈉（批號：20180509），天津大茂化學試劑廠；異氟烷（批號：045740），深圳市瑞沃德生命科技有限公司；血糖試紙（批號：4527442），上海強生醫(yī)療器械有限公司；血糖儀（AW0647775005A）,上海強生醫(yī)療器械有限公司；AKT 一抗：北京博奧森生物技術有限公司。β-actin 內參抗體：天津賽爾生物有限公司。辣根過氧化酶（HRP）標記二抗：天津賽爾生物有限公司。Epgiadients PCR 儀：Eppendorf 公司。ABI 7500 fast 熒光定量PCR 儀：Life Technologies 公司。

1.4 I 型糖尿病小鼠模型的建立 隨機選取10 只小鼠作為正常組，余50 只禁食不禁水16 h，稱重后用一次性無菌1 mL 注射器以60 mg/kg 將1%的STZ 檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液經腹腔注入小鼠體內，連續(xù)5 d；對照組10 只腹腔注射檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液。1 周后將隨機血糖＞16.7 mmol/L的小鼠挑出，此次實驗成功制作I 型糖尿病小鼠40 只[6]。

1.5 創(chuàng)面模型的建立 取I 型糖尿病小鼠40 只與正常組小鼠10 只，參考文獻[7]方法用動物剃毛器在背部刮出25 mm×25 mm 區(qū)域，用脫毛膏脫去剩余毛發(fā)，正常飼喂1 d。然后將小鼠以4%的異氟烷誘導麻醉，將小鼠俯臥位固定，以3%異氟烷維持麻醉。稍用力拉伸小鼠一側腰背部皮膚使之拉伸變平，用15 mm×15 mm 的印章標記，局部碘伏消毒，用眼科剪沿著邊緣剪去全層皮膚，醫(yī)用無菌敷料貼敷，自粘型彈力繃帶固定，分籠飼養(yǎng)。

1.6 分組與給藥 將造模成功的糖尿病創(chuàng)面小鼠隨機挑選30 只采用區(qū)組隨機法分為模型組、陽性藥組、中藥組，每組10 只，正常組10 只。模型組、正常組用生理鹽水1 mL/只外敷，陽性藥組用碘伏1 mL/只外敷，中藥組丹黃消炎液1 mL/只外敷，醫(yī)用自粘繃帶包扎，連續(xù)用藥7 d。

1.7 觀察指標及方法 分組后檢測各組小鼠血糖：下午14：00 先用75%酒精棉球消毒鼠尾皮膚和眼科剪，待酒精揮發(fā)后剪破鼠尾尾尖1 mm，擦去第一滴血，用血糖試紙檢測小鼠尾巴第二滴血，記錄讀數并于小鼠尾部涂布紅霉素軟膏以防感染；給藥7 d 后對小鼠進行麻醉，計算各組創(chuàng)面愈合面積：用數碼相機固定距離(30 cm)、固定焦距、固定標尺下照片，并用Image J 軟件計算治療愈合面積。

1.8 病理學染色 給藥7 d 后收集各組小鼠創(chuàng)面部位皮膚組織，HE 染色觀察各組小鼠創(chuàng)面組織病理學變化；此外，運用Masson 染色觀察各組小鼠創(chuàng)面纖維組織分布及含量。

1.9 熒光定量PCR 檢測HIF1-α 及VEGF mRNA表達水平 造模給藥后，提取各組小鼠創(chuàng)面皮膚中總RNA，反轉錄合成cDNA，采用SYBR Green Real Time RT-PCR 試劑盒進行擴增，檢測各組小鼠創(chuàng)面皮膚組織中HIF1-α 及VEGF mRNA 表達，以β-actin 為內參，具體引物序列見表1。

表1 引物序列

1.10 免 疫 組 化 檢 測CD31、HIF1-α 和VEGF蛋白表達水平 造模給藥后，運用免疫組化法檢測各組小鼠創(chuàng)面皮膚組織中CD31、HIF1-α 和VEGF 蛋白表達水平。

1.11 統計學方法 采用SPSS 22.0 軟件進行統計分析，計量資料采用表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q 檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠血糖水平比較 陽性藥組、中藥組和模型組的小鼠血糖值顯著高于正常組（P＜0.01），陽性藥組、中藥組和模型組間的小鼠血糖值差異無統計學意義，均符合I 型糖尿病小鼠模型的評定標準[6]，見表2。

表2 各組小鼠血糖水平比較

2.2 各組小鼠治療后創(chuàng)面愈合面積比較 正常組、陽性藥組和中藥組的創(chuàng)面愈合面積均大于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05），且中藥組創(chuàng)面愈合面積大于正常組和陽性藥組，差異均有統計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 各組小鼠創(chuàng)面愈合面積比較

2.3 治療7 d 后各組創(chuàng)面病理切片HE 染色結果 HE 染色可見各組組織損傷處大面積壞死，表皮、真皮結構不清，局部可見出血（紅色箭頭）；膿細胞滲出（黃色箭頭）：模型組＞正常組＞陽性藥組＞中藥組；嗜酸性絲網狀或均質狀（黑色箭頭）：模型組＞正常組＞陽性藥組=中藥組。炎性細胞浸潤（橙色箭頭）：模型組＞正常組＞陽性藥組＞中藥組；肉芽組織內纖維結締組織（綠色箭頭）：模型組＜正常組＜陽性藥組＜中藥組；新生毛細血管（藍色箭頭）：模型組＜正常組＜陽性藥組＜中藥組，見圖1。

圖1 各組治療7 d 后小鼠創(chuàng)面組織的HE 染色圖

2.4 治 療7 d 后 各 組 創(chuàng) 面Masson 染 色 結果 Masson 染色可見各組組織損傷處大量肌纖維組織，與模型組相比，其余各組創(chuàng)面組織中纖維組織顯著增多且排列致密，其中正常組最為明顯，中藥組和陽性藥組次之，見圖2。各組肌纖維容積分數，與模型組相比，正常組、陽性藥組和中藥組肌纖維容積分數顯著增加，且中藥組的肌纖維容積分數高于陽性藥組，差異均有統計學意義（P＜0.05），見表4。

表4 各組小鼠的肌纖維容積分數比較

2.5 各組小鼠創(chuàng)面組織中HIF1-α、VEGF mRNA水平比較 與模型組相比，正常組、陽性藥組、中藥組HIF1-α mRNA 和VEGF mRNA 表達水平顯著上調，且中藥組的HIF1-α、VEGF mRNA 表達水平高于陽性藥組，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖3。

圖3 各組治療7 d 天后小鼠創(chuàng)面HIF1-α、VEGF mRNA 表達水平（n=6）

2.6 各組小鼠創(chuàng)面組織中CD31、HIF1-α、VEGF 表達水平比較 CD31 主要表達于毛細血管部位，見圖4，與模型組相比，正常組、陽性藥組、中藥組小鼠創(chuàng)面組織中 CD31 顯著增加，且中藥組高于陽性藥組，差異有統計學意義（P＜0.05）。HIF1-α 及VEGF 主要表達于纖維組織與血管內皮細胞的細胞質中（見圖5、6）。與模型組相比，正常組、陽性藥組及中藥組創(chuàng)面組織中HIF1-α及VEGF 陽性表達水平顯著增加（P＜0.05）。中藥組的HIF1-α 與陽性藥組相比無統計學差異，但兩組HIF1-α 蛋白陽性表達水平均低于正常組（P＜0.05）；中藥組創(chuàng)的VEGF 蛋白表達水平顯著高于陽性藥組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表5。

圖4 各組小鼠創(chuàng)面組織中CD31 免疫組化染色（×100）

圖5 各組小鼠創(chuàng)面組織中HIF1-α 免疫組化染色（×100）

圖6 各組小鼠創(chuàng)面組織中VEGF 免疫組化染色（×100）

表5 各組創(chuàng)面組織中CD31、HIF1-α 和VEGF 比較

3 討論

糖尿病創(chuàng)面愈合緩慢機制尚不明確，造成創(chuàng)面感染、血糖難以控制，尤其是發(fā)生在足部的糖尿病創(chuàng)面會引發(fā)骨髓炎、敗血癥等嚴重危及患者生命的并發(fā)癥[1]。糖尿病屬中醫(yī)文獻中的“消渴”范疇，在此基礎上形成的創(chuàng)面可見于中醫(yī)“脫疽”，《明代外科正宗》又有“若無變證，外無混雜，此十中可保其三四矣；若割取后，黑色仍漫，痛腫尤甚，敗惡無膿，口干舌硬，食不知味者終死”記載。當下中醫(yī)治療多以固本箍毒、祛腐生新為糖尿病足潰瘍治療原則[8]。中醫(yī)外治法可以直接作用于創(chuàng)面，具有較好的箍圍去腐長肉的功效，且可以減少全身用藥對脾胃帶來的影響。因此，中醫(yī)外治法在促進創(chuàng)面愈合方面更具優(yōu)勢。糖尿病創(chuàng)面的病因，起初表現為局部的潰破，氣血瘀阻不暢，瘀而化熱成膿成腐，導致創(chuàng)面愈合延遲。清熱化瘀類中藥具有清熱利濕、化瘀生肌的作用，同時中藥濕敷可以有效減輕創(chuàng)面滲出，使藥力深達患處促進肉芽生長，在創(chuàng)面外治中廣泛應用。

研究表明，糖尿病會導致嚴重的并發(fā)癥，影響身體的各個器官代謝，糖尿病會導致皮膚血管數量減少和VEGF 表達下降，同時糖尿病造成皮膚抗氧化防御水平降低，這是導致皮膚損傷后愈合延遲的潛在原因[9]。各種原因導致糖尿病患者皮膚損傷后，機體修復大致分為止血、炎癥、增殖和重塑四個階段[10]，糖尿病創(chuàng)面炎癥階段腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和 白 細 胞 介 素-1β（interleukin-1β，IL-1β）的表達升高，活性氧（reactive oxygen species，ROS）產生增多[11]。在正常的血氧供應條件下，HIF1-α 會迅速羥基化；在低氧組織條件下，HIF1-α 的羥基化減少，非羥基化的HIF1-α 蛋白可以穩(wěn)定并啟動VEGF 基因的表達[12]，而高濃度的ROS 誘導會降低HIF1-α 與其輔酶p300 的結合，導致HIF1-α 反式激活功能下降，使得缺氧誘導的VEGF 表達降低導致新生血管受損[13]。因此，HIF1-α/VEGF 的功能受損是糖尿病患者血管生成障礙和傷口愈合延遲的重要原因。本研究結果提示，糖尿病小鼠創(chuàng)面VEGF 蛋白表達量低于普通小鼠創(chuàng)面；丹黃消炎液治療后小鼠創(chuàng)面可見CD31、HIF1-α 和VEGF 表達水平升高；HIF1-α和VEGF mRNA 水平增加；然而HIF1-α 和VEGF蛋白免疫組化結果提示糖尿病的某些機制會下調HIF1-α 的表達，治療后有其他因子或蛋白可以通過不依賴HIF1-α 的方式增加VEGF 的表達。課題組前期臨床研究表明，丹黃消炎液外敷不僅能有效控制創(chuàng)面感染，還可以有效促進傷口縮小,促進創(chuàng)面趨向愈合，提示創(chuàng)面感染可能是導致這種現象的原因之一[14]。

文獻報道，黃芪可以提高創(chuàng)面VEGF 的表達并促進愈合[15]。其有效成分黃芪甲苷IV 可以刺激細胞遷移，并上調HIF1-α 表達促進血管生成[16]。丹參有效成分丹參酮IIA 通過促進HIF1-α 和VEGF 因子的表達對缺血組織產生保護作用[17]。與單體藥相比，丹參黃芪藥可以從創(chuàng)面愈合的多階段多靶點干預VEGF 表達[18]。目前，中醫(yī)外治法治療糖尿病創(chuàng)面的常見機制有：抑制晚期糖基化終產物誘導的細胞凋亡和細胞功能障礙，促進巨噬細胞的轉型，激活Wnt/β-catenin 通路抑制糖原合成酶3β 的活性等[19-20]。糖尿病創(chuàng)面及周圍的成纖維細胞、血管內皮細胞、巨噬細胞等，可分泌多種生長因子，包括轉化生長因子-β1、胰島素樣生長因子-1、表皮生長因子等，通過激活相應的通路，促進創(chuàng)面的愈合[21]。本研究結果顯示，糖尿病模型小鼠創(chuàng)面VEGF、HIF1-α 的表達下調，提示糖尿病模型小鼠出現了創(chuàng)面愈合延遲，這與現在的研究結果一致。丹黃消炎液外敷可以增加CD31 的熒光強度，表明血管生成增多；同時可以促進創(chuàng)面VEGF、HIF1-αmRNA 表達，促進創(chuàng)面愈合。臨床研究發(fā)現，在患有2 型糖尿病和糖尿病足的患者的血液循環(huán)和組織活檢中，血管生成因子SDF-1α 均顯著降低[22]。這說明基質細胞衍生因子-1α（SDF-1α）可能通過激活HIF1-α/VEGF 信號通路參與了糖尿病創(chuàng)面的愈合過程。糖尿病創(chuàng)面是機制復雜的慢性創(chuàng)面之一，中醫(yī)中藥對慢性創(chuàng)面的促愈也是從多通路、多靶點來發(fā)揮作用的[23]。本方對創(chuàng)面愈合的其他蛋白或通路是否有促進作用，尚需將進行更深層次的課題研究和臨床驗證。