核轉(zhuǎn)錄因子κB、P53 在膀胱癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系

高 超，高 燕，杜張敏，付 曦，黃國(guó)軍

膀胱尿路上皮癌是常見的惡性腫瘤，具有多發(fā)性和高復(fù)發(fā)率的特點(diǎn)。據(jù)估計(jì)2012 年北美大約有142 170 例膀胱癌新發(fā)病例[1]。膀胱癌在實(shí)體惡性腫瘤中的發(fā)病率排在第四位，且好發(fā)于男性，男女比例約為4∶1[2]。目前膀胱癌的確切發(fā)病及復(fù)發(fā)的分子機(jī)制并不十分清楚。目前認(rèn)為與患者整個(gè)膀胱黏膜上皮基因組不穩(wěn)定性有關(guān)。核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）可以與細(xì)胞核內(nèi)DNA 順式作用元件相結(jié)合，啟動(dòng)DNA 轉(zhuǎn)錄，在多種腫瘤中其表達(dá)水平升高，且與腫瘤的預(yù)后不良有關(guān)。P53是經(jīng)典的腫瘤抑制基因。幾乎在所有惡性腫瘤中，50%以上會(huì)出現(xiàn)P53 基因的突變。P53 基因編碼的蛋白質(zhì)是一種轉(zhuǎn)錄因子，控制著細(xì)胞周期的啟動(dòng)。當(dāng)細(xì)胞受損，且無法得到修復(fù)時(shí)，P53 蛋白將參與啟動(dòng)過程，使細(xì)胞進(jìn)入凋亡程序。本研究采用免疫組織化學(xué)SP 法檢測(cè)NF-κB 和P53 蛋白在膀胱移行上皮癌中的表達(dá)，并探討其表達(dá)與患者臨床特征和預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2014 年2 月—2017 年1 月成都市郫都區(qū)人民醫(yī)院確診并手術(shù)的膀胱移行上皮癌患者48 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：病理學(xué)確診為膀胱尿路上皮癌者，術(shù)前未接受過放化療，臨床病例資料完整，術(shù)后隨訪資料齊全。排除標(biāo)準(zhǔn)：其他病理類型的膀胱癌患者，合并其他惡性腫瘤者。選擇同期因膀胱良性病變行手術(shù)治療的非膀胱癌患者16 例，均無惡性腫瘤病史。

1.2 儀器與試劑 一抗：鼠抗人NF-κB，兔抗人P53 單克隆抗體（購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz 公司）；即用型免疫組化SP 試劑盒（購(gòu)自北京中山生物技術(shù)公司），微波爐（購(gòu)自格蘭仕公司），微量加樣儀（購(gòu)自德國(guó)Eppendor 公司）。

1.3 檢測(cè)方法 采用免疫組織化學(xué)SP 法檢測(cè)膀胱癌組織、癌旁組織及非膀胱癌患者正常尿路黏膜組織中NF-κB 和P53 蛋白的表達(dá)水平。首先對(duì)切片進(jìn)行脫蠟和水化，然后進(jìn)行抗原修復(fù)后，應(yīng)用PBS 洗2 次，加正常山羊血清封閉，室溫20 min，后甩去液體，加一抗（NF-κB 或P53），4 ℃過夜。過夜后37 ℃復(fù)溫45 min，PBS 清洗3 次后加二抗，37 ℃，1 h，PBS 清洗后加入SP 液室溫20 min。DAB 顯色10 min，顯微鏡下觀察染色程度。蘇木精復(fù)染2 min，脫水、封片然后置顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.4 觀察指標(biāo)與評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 觀察癌組織、癌旁組織和正常膀胱尿路上皮組織中NF-κB 和P53 的表達(dá)水平；記錄患者年齡、性別、腫瘤分級(jí)、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況。NF-κB 陽性染色多位于癌細(xì)胞胞漿內(nèi)，散在分布于核內(nèi)，呈棕黃色顆粒或團(tuán)塊，彌漫分布。P53 蛋白表達(dá)主要分布在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，呈棕黃色顆粒狀。根據(jù)Handel 等[3]的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)雙盲法計(jì)分：＜5%為-，5%～25%為+，26%～49%為++，≥50%為+++。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)分析采用STATA12.0 軟件完成，計(jì)量資料采用表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用例（%）表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)或fisher 確切概率法。無疾病進(jìn)展生存時(shí)間（Disease free survival, DFS）等采用中位數(shù)表示，組間比較采用Log-rank 檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化結(jié)果 NF-κB 陽性染色多位于癌細(xì)胞胞漿內(nèi)，散在分布核內(nèi)，呈棕黃色顆?；驁F(tuán)塊，彌漫分布；P53 蛋白表達(dá)主要分布在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，呈棕黃色顆粒狀，圖1。

圖1 NF-κB 和P53 表達(dá)情況

2.2 NF-κB、P53 蛋白在癌、癌旁及正常黏膜組織中的表達(dá) 膀胱癌組織的NF-κB 和P53 蛋白陽性率高于癌旁組織和正常黏膜組織，癌旁組織的NF-κB 和P53 蛋白陽性率高于正常黏膜組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

2.3 NF-Kb、P53 蛋白表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系 NF-κB 陽性表達(dá)與膀胱癌患者腫瘤病理分級(jí)存在相關(guān)性，高級(jí)別膀胱癌（G2/G3）組織中NF-κB 陽性率顯著高于低級(jí)別（G1）腫瘤組織（P＜0.05）；P53 陽性表達(dá)與膀胱癌患者腫瘤分期存在相關(guān)性，T2-3期患者陽性率顯著高于Tis-1期（P＜0.05），見表2。

表1 各組織中NF-κB、P53 蛋白陽性表達(dá)情況比較

表2 NF-κB、P53 蛋白表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系

2.4 蛋白表達(dá)表達(dá)與DFS 的關(guān)系 NF-κB 表達(dá)陽性和陰性患者的中位DFS 分別為8.9 個(gè)月和30.1 個(gè)月，陽性組復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)顯著高于陰性組[HR=2.14，95% CI=1.05 ～4.33 (P＜0.05)]；P53 表達(dá)陽性和陰性患者的DFS 分別為9.2 個(gè)月和28.6 個(gè)月，陽性組復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)顯著高于陰性組[HR=2.02，95%CI=1.22 ～3.62(P＜0.05)]，表3，圖2。

表3 NF-κB、P53 蛋白表達(dá)與DFS 的關(guān)系

圖2 NF-κB、P53 表達(dá)與腫瘤復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系

3 討論

膀胱癌是我國(guó)泌尿系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤[4]。由于其具有多發(fā)性、癌旁黏膜存在癌前病變的特點(diǎn)，治療后的復(fù)發(fā)率仍高達(dá)30%～50%[5-6]，給患者及家庭帶來極大的健康和生活壓力。目前，膀胱癌發(fā)生發(fā)展的確切分子機(jī)制并不十分清晰。近年來的研究顯示，DNA 損傷-修復(fù)平衡在膀胱癌的發(fā)生中發(fā)揮重要作用[7-9]。DNA 損傷后的及時(shí)修復(fù)在維持基因組的穩(wěn)定性、防止腫瘤的發(fā)生起關(guān)鍵作用。有研究報(bào)道DNA 損傷反應(yīng)可通過下面兩條途徑來監(jiān)控腫瘤的發(fā)生：（1）ATM/CHK2/p53 通路誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯、DNA 修復(fù)和凋亡；（2）ATM/NKG2DL 通路誘導(dǎo)抗腫瘤免疫。研究認(rèn)為，實(shí)體惡性腫瘤普遍存在p53 基因突變或其他DNA修復(fù)、凋亡相關(guān)分子功能異常[10-11]。

NF-κB 為一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族，包括5個(gè) 亞 單 位：Rel（cRel）、p65（RelA，NF-κB3）、RelB 和p50（NF-κB1）、p52（NF-κB2）[12]。NF-κB 的抑制單位IκB 通過其C 末端特定的錨蛋白重復(fù)序列（ankyrin repeat motif）與NF-κB結(jié)合，并覆蓋NLS 阻止NF-κB 向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移。在靜息的細(xì)胞中，NF-κB 和IκB 形成復(fù)合體，以無活性形式存在于胞漿中。當(dāng)細(xì)胞受細(xì)胞外信號(hào)刺激后，IκB 激酶復(fù)合體（IκB kinase，IKK）活化將IκB 磷酸化，使NF-κB 暴露核定位位點(diǎn)。游離的NF-κB 迅速移位到細(xì)胞核，與特異性κB序列結(jié)合，誘導(dǎo)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄[13]。已有研究表明[14-15]，有多條信號(hào)通路參與MICA 的表達(dá)調(diào)控。對(duì)活化的T 淋巴細(xì)胞和宮頸癌HeLa 細(xì)胞MICA蛋白表達(dá)機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)，MICA 基因第1 內(nèi)含子含有轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 結(jié)合位點(diǎn)，NF-κB 抑制劑PDTC 能抑制MICA 蛋白表達(dá)，而且轉(zhuǎn)染NF-κB基因到HeLa 細(xì)胞能上調(diào)MICA 表達(dá)，表明MICA可能是NF-κB 的靶基因[16]。前面提到，一些DNA 損傷劑可通過ATM 介導(dǎo)的DNA 損傷反應(yīng)途徑上調(diào)NKG2DL 表達(dá)，而ATM 介導(dǎo)的DNA 損傷反應(yīng)又可誘導(dǎo)NF-κB 活化[17]，因此，筆者推測(cè)NF-κB 可能是聯(lián)系DNA 損傷反應(yīng)和MICA 表達(dá)的中介分子。ATM 誘導(dǎo)NF-κB 活化的信號(hào)通路已基本清楚，探討ATM/NF-κB 通路對(duì)MICA表達(dá)的調(diào)控作用將為監(jiān)控膀胱癌的復(fù)發(fā)和進(jìn)展提供新靶點(diǎn)?？扇苄訫ICA 蛋白（sMICA）形成是腫瘤實(shí)現(xiàn)免疫逃逸的新機(jī)制，患者血清和尿液中sMICA 是否可作為新的膀胱癌標(biāo)志物也是值得探討的問題。另有NF-κB 可以通過與細(xì)胞核DNA結(jié)合啟動(dòng)某些基因的轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化及凋亡[18]。在多種惡性腫瘤細(xì)胞如胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌及結(jié)直腸癌中均可檢測(cè)到NF-κB 的異常變動(dòng)，且其異常表達(dá)與腫瘤的預(yù)后不良有關(guān)。

本研究分析了48 例膀胱癌患者癌組織、癌旁組織和非膀胱癌患者正常尿路黏膜組織中NF-κB和P53 蛋白陽性表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)癌組織中NF-κB和P53 陽性率顯著高于癌旁組織和非腫瘤患者正常膀胱黏膜組織，提示NF-κB 和P53 在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮重要作用。同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn)NF-κB 與膀胱癌患者腫瘤病理分級(jí)有關(guān)，高級(jí)別膀胱癌（G2/G3）組織中NF-κB 陽性率顯著高于低級(jí)別（G1）腫瘤組織。而P53 與膀胱癌患者腫瘤分期存在相關(guān)性，T2-T3期患者陽性率顯著高于Tis-T1 期。提示NF-κB 和P53 的陽性表達(dá)可能與腫瘤的惡性程度及侵襲能力有關(guān)。但其確切相關(guān)性有待進(jìn)一步的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)。同時(shí)，本研究分析了NF-κB 和P53 蛋白表達(dá)與患者DFS 的關(guān)系，結(jié)果提示NF-κB 和P53 陽性表達(dá)組的DFS 顯著小于陰性組，說明NF-κB 和P53可作為膀胱癌術(shù)后復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)的潛在分子標(biāo)志物。