偎膿長(zhǎng)肉法對(duì)大鼠慢性潰瘍組織病理學(xué)及肉芽組織VEGF、Notch1、TGF-β1 表達(dá)的影響

朱朝軍，張朝暉，周 冰，張 楊，劉現(xiàn)周，霍 磊，郭 悅

偎膿長(zhǎng)肉法是中醫(yī)外科獨(dú)具特色的外治法之一，藥物經(jīng)瘡周皮膚和瘡面肉芽組織的吸收，發(fā)揮藥瘡交互作用，“膿-肉”的變化反映了瘡面愈合過程中促修復(fù)物質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化[1]。肉芽組織吸收藥物中的有效物質(zhì)后發(fā)生一系列變化，產(chǎn)生的“膿”促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)，對(duì)于“膿”液中促創(chuàng)面修復(fù)物質(zhì)的研究較多[1]，但對(duì)肉芽組織內(nèi)促創(chuàng)面修復(fù)物質(zhì)的變化研究較少。偎出之膿中含有大量活性的“巨噬細(xì)胞”，巨噬細(xì)胞與創(chuàng)面愈合關(guān)系密切，貫穿創(chuàng)面修復(fù)整個(gè)過程，可以分泌多種細(xì)胞因子，刺激細(xì)胞增殖，促進(jìn)創(chuàng)面血管化、肉芽化，加速膠原沉積[2]。前期研究表明：偎膿長(zhǎng)肉法可早期抑制M1 型巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的誘導(dǎo)性一氧化氮合酶表達(dá)，再促進(jìn) M2 型巨噬細(xì)胞表型指標(biāo)精氨酸酶1 表達(dá)升高[3]。生肌象皮膏是中醫(yī)外科常用的偎膿長(zhǎng)肉外用藥之一，常用于瘡面生肌收口階段。本文觀察了偎膿長(zhǎng)肉法對(duì)肉芽組織內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞 生 長(zhǎng) 因 子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、Notch1、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD 大鼠24 只，（280±20）g，購(gòu)自中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[動(dòng)物許可號(hào)：SCXK-(軍)2012-0004]。

1.2 藥物與試劑 外用藥物：生肌象皮膏（批準(zhǔn)文號(hào)津藥制Z20070652 號(hào)）：象皮（制）、血余炭、龜甲、地黃、當(dāng)歸、石膏、爐甘石、蜂蠟。功能主治：殺菌、偎膿生肌、收斂。不良反應(yīng)、禁忌及注意事項(xiàng)均尚不明確。醫(yī)用凡士林油紗條：新鄉(xiāng)華西衛(wèi)材有限公司。TGF-β1、Notch1、VEGF 抗體均購(gòu)自天津瑞博星科技有限公司。

1.3 菌種 金黃色葡萄球菌（ATCC25923 株），由北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院國(guó)家中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)學(xué)科免疫實(shí)驗(yàn)室提供。菌液中金黃色葡萄球菌含量為（3～5）×109cfu/mL。菌液制備：取金黃色葡萄球菌，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)24 h 后，取下菌落加適量無(wú)菌氯化鈉注射液研磨，制成含（3～5）億個(gè)金黃色葡萄球菌/mL 的菌液。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 大鼠分組及造模方法 大鼠24 只，隨機(jī)分為4 組正常組、對(duì)照組、模型組、治療組，每組6只。除正常組外，其他3 組用“激素干預(yù)-皮膚缺損-細(xì)菌感染”復(fù)合因素疊加法制備慢性皮膚潰瘍大鼠模型。腹腔注射水合氯醛（10%，0.25 g/kg）麻醉大鼠后，手術(shù)剪機(jī)械性在背部雙側(cè)剪去直徑為2 cm 的圓形傷口，深達(dá)筋膜層，噴灑1 mL 菌液至傷口上，傷口周圍出現(xiàn)紅、腫，創(chuàng)面可見膿性分泌物。除正常組外，大鼠造模后肌注醋酸氫化可的松（80 mg/kg），連續(xù)3 d 造成難愈性創(chuàng)面模型。

1.4.2 治療方法 本研究選用具有偎膿生肌作用的生肌象皮膏用于創(chuàng)面換藥。大鼠慢性難愈合創(chuàng)面成功后，左側(cè)創(chuàng)面用于取材，右側(cè)創(chuàng)面用于觀察愈合情況。治療組：慢性創(chuàng)面+生肌象皮膏換藥；模型組：慢性創(chuàng)面+生理鹽水紗條換藥；對(duì)照組：慢性創(chuàng)面+凡士林紗條換藥；正常對(duì)照組：不做任何干預(yù)。換藥時(shí)，藥膏面積與創(chuàng)面面積相當(dāng)，藥膏厚約1 mm。換藥1 次/d，連續(xù)治療14 d。

1.4.3 標(biāo)本采取 治療3、7、14 d，治療組、對(duì)照組、模型組取左側(cè)創(chuàng)面。以每個(gè)創(chuàng)面為中心，分別取上、下、右側(cè)三個(gè)位置。取材時(shí)，用無(wú)菌手術(shù)器械分離、切取1 cm×1 cm 大小組織（含創(chuàng)面肉芽組織及瘡周皮膚組織）。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 大鼠瘡面愈合情況 觀察瘡面肉芽生長(zhǎng)情況，觀察瘡面的愈合情況，測(cè)量瘡面的面積。

1.5.2 瘡面肉芽組織形態(tài)學(xué)觀察 取材后的組織，常規(guī)包埋、石蠟切片，行HE 染色，顯微鏡下觀察瘡面組織炎性細(xì)胞、毛細(xì)血管、成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等變化。

1.5.3 TGF-β1、Notch1、VEGF 在組織內(nèi)的表達(dá) 免疫組化測(cè)定TGF-β1、Notch1、VEGF 在組織內(nèi)的表達(dá)情況，具體方法參照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS16.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，多組間均數(shù)比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。以α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠瘡面面積比較 造模后，治療組大鼠瘡面愈合最快；對(duì)照組次之；模型組愈合最慢。治療3 天時(shí)，各組大鼠瘡面面積差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。治療7 天時(shí)，與模型組相比，對(duì)照組、治療組面積縮小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與對(duì)照組相比，治療組面積縮小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。治療14 天時(shí)，與模型組相比，對(duì)照組、治療組創(chuàng)面明顯縮小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與對(duì)照組相比，治療組創(chuàng)面面積明顯縮小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），創(chuàng)面接近愈合。結(jié)果見表1。

表1 4 組大鼠瘡面面積比較（cm2）

2.2 瘡面組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果 HE 染色光鏡觀察大鼠治療不同階段瘡面肉芽組織形態(tài)（圖1）。正常組大鼠皮膚組織結(jié)構(gòu)較為完整，可見完整表皮層，真皮層毛囊結(jié)構(gòu)，無(wú)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

治療3 天：模型組表皮下出血嚴(yán)重，可見大量紅細(xì)胞（紅色箭頭所示），組織可見大面積炎癥及壞死，炎性細(xì)胞多為中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞（黑色箭頭所示），未見肉芽組織。對(duì)照組組織內(nèi)可見少量嗜堿性顆粒（藍(lán)色箭頭所示），可見少量毛細(xì)血管和大量成纖維細(xì)胞（黑色箭頭所示），并伴有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（紅色箭頭所示）。治療組組織內(nèi)可見少量毛細(xì)血管和大量成纖維細(xì)胞（黑色箭頭所示），組織內(nèi)可見少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)（紅色箭頭所示）。

圖1 4 組大鼠瘡面組織形態(tài)學(xué)觀察（HE 染色，×100）

治療7 天：模型組組織內(nèi)可見少量嗜堿性顆粒（藍(lán)色箭頭所示），少量毛細(xì)血管和大量成纖維細(xì)胞，并伴有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（黑色箭頭所示），可見呈透明樣異物，其周圍有少量多核巨細(xì)胞（如黃色箭頭所示）。對(duì)照組組織內(nèi)可見少量毛細(xì)血管和大量成纖維細(xì)胞，伴有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（黑色箭頭所示）；組織內(nèi)可見大量形態(tài)各異、大小不一的空泡（紅色箭頭所示）。治療組組織內(nèi)可見豐富的毛細(xì)血管和大量成纖維細(xì)胞（黑色箭頭所示），可見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（紅色箭頭所示）。

治療14 天：模型組肉芽組織內(nèi)可見豐富的毛細(xì)血管和大量成纖維細(xì)胞，部分毛細(xì)血管擴(kuò)張，毛細(xì)血管內(nèi)可見淤血（黑色箭頭所示），近表皮處可見大量纖維素滲出（黃色箭頭所示），組織內(nèi)可見大量炎性細(xì)胞（紅色箭頭所示）。對(duì)照組組織內(nèi)可見豐富的毛細(xì)血管和大量的成纖維細(xì)胞（黑色箭頭所示），可見少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（紅色箭頭所示）。治療組潰瘍面形成較為成熟的肉芽組織，組織內(nèi)可見大量的成纖維細(xì)胞（黑色箭頭所示），表皮完整，未見明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

2.3 肉芽組織VEGF 表達(dá)的比較 在治療第3 天時(shí)，模型組、對(duì)照組、治療組VEGF 的表達(dá)量呈升高趨勢(shì)，與正常組相比，三組的VEGF 表達(dá)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組相比，對(duì)照組、治療組VEGF 的表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），與對(duì)照組相比，治療組VEGF 的表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。在治療第7 天時(shí)，VEGF 的表達(dá)量最高，與正常組相比，模型組、對(duì)照組、治療組VEGF 的表達(dá)量差異都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組相比，對(duì)照組、治療組VEGF 的表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與對(duì)照組相比，治療組VEGF 的表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。在治療第14 天時(shí)，與正常組相比，模型組VEGF的表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其他各組間VEGF 的表達(dá)量無(wú)差異。模型組、對(duì)照組、治療組治療前后的VEGF 表達(dá)均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。結(jié)果見表2，圖2。

表2 4 組大鼠瘡面肉芽組織VEGF 表達(dá)變化

圖2 4組大鼠治療7 天時(shí)瘡面肉芽組織VEGF 表達(dá)（×100）

2.4 肉芽組織TGF-β1 表達(dá)的比較 在治療第3天和第7 天時(shí)，模型組、對(duì)照組、治療組TGF-β1的表達(dá)量呈逐漸升高趨勢(shì)，與正常組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組相比，對(duì)照組、治療組TGF-β1 的表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），與對(duì)照組相比，治療組TGF-β1 的表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。治療第14 天，各組間TGF-β1 的表達(dá)量無(wú)明顯差異。模型組、對(duì)照組、治療組治療前后的TGF-β1 表達(dá)均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。結(jié)果見表3，圖3。

表3 4組大鼠瘡面肉芽組織TGF-β1 表達(dá)變化

圖3 4 組大鼠治療7 天時(shí)瘡面肉芽組織TGF-β1 的表達(dá)（×100）

2.5 肉芽組織Notch1 表達(dá)的比較 在治療第3天時(shí)，治療組Notch1 含量最低，與正常組、模型組、對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），正常組、模型組、對(duì)照組Notch1 含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；在治療第7 天時(shí)，模型組Notch1表達(dá)量較正常組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），正常組、對(duì)照組Notch1 表達(dá)量較治療組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；治療第14 天，各組間Notch1 含量無(wú)明顯差異。治療前后模型組、對(duì)照組、治療組的Notch1 表達(dá)量大體呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)。結(jié)果見表4，圖4。

表4 4組大鼠瘡面肉芽組織Notch1 表達(dá)變化

圖4 4組大鼠治療3 天大鼠瘡面肉芽組織Notch1 表達(dá)（×100）

3 討論

巨噬細(xì)胞在瘡面愈合、組織修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用。本研究HE 染色顯示隨著瘡面肉芽生長(zhǎng)、面積縮小巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)減少的趨勢(shì)；造模后炎性細(xì)胞增多，隨著瘡面縮小，成纖維細(xì)胞和毛細(xì)血管逐漸增多，炎性細(xì)胞逐漸減少的趨勢(shì)，偎膿長(zhǎng)肉法治療組變化較另外兩組明顯。巨噬細(xì)胞在炎性瘡面修復(fù)過程中，主要通過胞葬作用、表型轉(zhuǎn)換發(fā)揮作用，二者相互聯(lián)系、相互影響。根據(jù)活化的方式、細(xì)胞表面標(biāo)志或功能，巨噬細(xì)胞可分為Ml 和M2 兩個(gè)亞群[4-5]。巨噬細(xì)胞通過與多種細(xì)胞（包括內(nèi)皮細(xì)胞，周細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞）相互作用調(diào)節(jié)血管生成，且在微血管的發(fā)生、成熟過程中也發(fā)揮重要作用[6-7]。

炎性反應(yīng)早期，多種介質(zhì)能夠誘導(dǎo)M1 型巨噬細(xì)胞比例升高，有利于病原微生物的清除；隨著炎性進(jìn)展，M2 型巨噬細(xì)胞逐漸增多，占據(jù)主導(dǎo)地位，抑制炎性反應(yīng)，促進(jìn)瘡面修復(fù)。巨噬細(xì)胞胞葬作用可抑炎性因子的釋放，促進(jìn)TGF-β、血小板活化因子的表達(dá)[4]。胞葬作用異常，導(dǎo)致慢性炎性反應(yīng)的發(fā)生，血管生成相關(guān)因子釋放減少，造成如慢性難愈性潰瘍等。研究顯示藥物可治療巨噬細(xì)胞胞葬作用及表型轉(zhuǎn)換治療慢性皮膚潰瘍[4-5]，也有學(xué)者開展了外用中藥對(duì)巨噬細(xì)胞極化及吞噬功能的研究[8-9]，提示外用中藥可通過影響巨噬細(xì)胞極化及吞噬功能促進(jìn)瘡面修復(fù)。

本研究顯示偎膿長(zhǎng)肉法通過影響VEGF 和Notch1、TGF-β1 的表達(dá)促進(jìn)瘡面內(nèi)毛細(xì)血管的生成和肉芽的生長(zhǎng)，進(jìn)而促進(jìn)瘡面修復(fù)。HE 染色顯示，偎膿長(zhǎng)肉法在大鼠瘡面修復(fù)早期可減輕炎性反應(yīng)，在中、后期可促進(jìn)毛細(xì)血管生成和瘡面愈合。HE 染色顯示肉芽組織內(nèi)巨噬細(xì)胞也呈現(xiàn)在干預(yù)早期較多，中、晚期減少的趨勢(shì)，但是不能確定巨噬細(xì)胞的表型。早期研究就揭示偎膿長(zhǎng)肉法換藥的分泌物內(nèi)含有大量形態(tài)和功能活躍的巨噬細(xì)胞，提高巨噬細(xì)胞內(nèi)酶活性促進(jìn)瘡面修復(fù)[10-11]，結(jié)合本研究結(jié)果，推測(cè)偎膿長(zhǎng)肉法可通過影響巨噬細(xì)胞極化，促進(jìn)肉芽組織內(nèi)血管生成相關(guān)因子的表達(dá)，促進(jìn)瘡面愈合。有研究顯示：Notch 信號(hào)通路可調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化，二者間存在相互作用；在調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞生物學(xué)功能中發(fā)揮關(guān)鍵作用，巨噬細(xì)胞的極化與Notch1、Notch2、Notch3 受體的表達(dá)呈正相關(guān)[12]。

偎膿長(zhǎng)肉法促進(jìn)大鼠慢性皮膚潰瘍創(chuàng)面愈合可能與調(diào)節(jié)肉芽組織內(nèi)VEGF 和Notch1 的表達(dá)有關(guān)[3]。Notch 1 是VEGF 的下游信號(hào)通路。VEGF激活VEGFR1 和VEGFR2 后，誘導(dǎo)Notch1 及其配體DLL4 的表達(dá)，DLL4/Notch 1 的上調(diào)能防止新生血管過量芽生，促進(jìn)功能性血管網(wǎng)的正常構(gòu)建[13-15]。Notch 信號(hào)通路對(duì)血管內(nèi)皮尖端細(xì)胞的選擇、新生血管形態(tài)和功能發(fā)育起重要作用，Notch 信號(hào)通路與VEGF 通過影響尖端細(xì)胞的生物學(xué)行為共同調(diào)節(jié)血管的發(fā)生[16]。本研究顯示偎膿長(zhǎng)肉法治療組大鼠慢性瘡面愈合最快，病理學(xué)也顯示偎膿長(zhǎng)肉法治療組在早期出現(xiàn)少量毛細(xì)血管，7 天時(shí)出現(xiàn)豐富毛細(xì)血管，14天時(shí)潰瘍面形成較為成熟的肉芽組織，提示偎膿長(zhǎng)肉法可促進(jìn)瘡面毛細(xì)血管、成纖維細(xì)胞的生成，加速瘡面愈合。

本研究免疫組化顯示VEGF 和Notch1 的表達(dá)趨勢(shì)為VEGF 高表達(dá)時(shí)Notch1 低表達(dá)，在早中期（3～7 天），隨著瘡面面積的縮小，組織內(nèi)VEGF的表達(dá)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，而Notch1 在組織內(nèi)的表達(dá)呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)，巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)先增多后減少的趨勢(shì)。偎膿長(zhǎng)肉過程中是否存在Notch1 與巨噬細(xì)胞的相互作用，仍有待進(jìn)一步研究。本研究只是初步觀察到該趨勢(shì)，在瘡面修復(fù)、毛細(xì)血管生成過程中巨噬細(xì)胞、VEGF 和Notch1信號(hào)通路的作用及具體機(jī)制仍待深入的研究來揭示。

最近一項(xiàng)應(yīng)用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞減少多比柔星所致癌癥患者的心臟毒性的研究中，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞通過釋放VEGF、激活Jagged 1/Notch 1而抑制TGF-β1 的表達(dá)[17]，本研究顯示VEGF/Notch1 的表達(dá)未抑制TGF-β1 的表達(dá)，而VEGF/Notch1/TGF-β1 在腫瘤領(lǐng)域及慢性瘡面修復(fù)中的作用研究較少，仍有待探討。

綜上所述，偎膿長(zhǎng)肉法可能是通過調(diào)節(jié)瘡面肉芽組織內(nèi)VEGF/Notch1/TGF-β1 表達(dá)起到促進(jìn)肉芽生長(zhǎng)的作用。偎膿長(zhǎng)肉過程中是否存在Notch信號(hào)通路與巨噬細(xì)胞的相互作用、存在VEGF/Notch1/TGF-β1 相互調(diào)節(jié)，仍有待深入研究。