加味旋覆代赭湯對非酸反流所致慢性食管病變大鼠腸化及CDX2、DLK1 表達(dá)的影響

唐麗明，宋 寧，張桂賢，熊 鷹，劉大衛(wèi)，杜紅躍，袁紅霞

Barrett 食管（Barrett' s esophagus, BE）是指被覆在食管下段的正常復(fù)層鱗狀上皮被腸化柱狀上皮所取代的病理現(xiàn)象，是食管腺癌的主要癌前病變之一[1-4]。胃酸及胃蛋白酶被公認(rèn)是引起B(yǎng)E 的主要因素，但質(zhì)子泵抑制劑（PPI）二十多年的廣泛使用，并未降低BE 和食管腺癌發(fā)病率，反而有升高趨勢。隨著食管24 小時pH 檢測及膽汁反流監(jiān)測技術(shù)的推廣，發(fā)現(xiàn)反流到食管內(nèi)的內(nèi)容物混有十二指腸液（其中含有膽汁），如國外報道半數(shù)以上BE 患者食管反流物中含十二指腸內(nèi)容物（含膽汁），因此非酸反流對食管黏膜的損傷作用逐漸被重視，且隨后多項臨床和基礎(chǔ)研究也證實膽汁在反流性食管炎（RE）、BE 及其并發(fā)食管腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用[5-8]。本研究采用十二指腸-食管吻合術(shù)（胃全切）建立大鼠十二指腸-食管非酸反流模型，觀察加味旋覆代赭湯對該模型食管腸化及尾型同源盒轉(zhuǎn)錄因子-2（CDX2）、DLK1表達(dá)的影響，為其臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF 級成年雄性Wistar 大鼠80 只，體質(zhì)量180～220 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，動物合格證號11400700347254。

1.2 藥物 加味旋覆代赭湯的制備，首先按處方配比，根據(jù)該方在《傷寒雜病論》中的劑量換算，取處方量藥材飲片：旋覆花15 g，代赭石5 g，清半夏10 g，生姜25 g，人參10 g，炙甘草15 g，大棗15 g，山慈菇15 g，白花蛇舌草30 g（飲片購自天津市中新藥業(yè)中藥飲片廠），由天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所制劑研究室煎煮濃縮成每克相當(dāng)于4 g生藥的浸膏，用時以蒸餾水稀釋成所需濃度備用；鋁碳酸鎂片（達(dá)喜）為拜耳公司產(chǎn)品，規(guī)格為500 mg/粒，用時配成10 g/L 濃度溶液。

1.3 主要試劑與儀器 CDX2 抗體、DLK1 抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記羊抗兔二抗為美國Abcam 公司產(chǎn)品。EG1150H 型包埋機、RM2235/2245 切片機、ASP300 脫水機、DM400B正置顯微鏡為德國Leica 公司產(chǎn)品。

1.4 大鼠十二指腸-食管吻合術(shù)（胃全切）非酸反流模型建立 在“十二指腸-胃-食管反流大鼠模型”[9]基礎(chǔ)上結(jié)合文獻(xiàn)[10]加以改良，即采用“結(jié)合胃全切的十二指腸-食管吻合術(shù)”建立“大鼠十二指腸-食管非酸反流模型”（造模25 周），以提高十二指腸內(nèi)容物反流程度，提高食管下端BE發(fā)生率（見圖1）。

圖1 十二指腸-食管吻合術(shù)（胃全切）大鼠模型示意圖

1.5 動物分組及治療 成年雄性Wistar 大鼠80只，體重180 ～220 g，隨機分為4 組，每組20 只，即假手術(shù)組、模型組、加味旋覆代赭湯組、鋁碳酸鎂片（達(dá)喜）組（500 mg/粒，配成10 g/L 濃度）。造模25 周后，加味旋覆代赭湯組經(jīng)口灌服加味旋覆代赭湯（相當(dāng)于30 g 生藥/kg），每日1 次，連續(xù)3 周；達(dá)喜照組在造模后25 周開始經(jīng)口灌服達(dá)喜藥液（300 mg/kg），每日1 次，連續(xù)3 周。

1.6 標(biāo)本留取及檢測指標(biāo) 治療3 周后，連同假手術(shù)組，共4 組動物，10%水合氯醛3 mL/kg 腹腔注射麻醉大鼠，打開胸腹腔，剪取食管下段及吻合段，縱行剖開食管，進(jìn)行大體病理觀察；對食管下端緊鄰吻合口處組織行HE 染色，觀察食管病理組織學(xué)改變，并按病理組織學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分[11]；另采用免疫組化法進(jìn)行CDX2 及DLK1 染色，觀察其在腸化生上皮細(xì)胞上的表達(dá)。免疫組化操作步驟按說明書進(jìn)行。CDX2 蛋白陽性染色為細(xì)胞核染色呈棕黃色顆粒，而DLK1 陽性細(xì)胞染色主要位于細(xì)胞膜和胞漿內(nèi)，呈棕黃色，二者主要分布于杯狀細(xì)胞（腸化生）區(qū)域，每張切片隨機選取5 個高倍視野，光鏡下選擇陽性染色區(qū)域，采用Image-pro plus（IPP）6.0 軟件測量選擇區(qū)域內(nèi)的積分光密度（IOD）值，并計算出陽性區(qū)域的平均IOD 值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 16.0 軟件對本研究數(shù)據(jù)資料進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料采用表示，兩組比較采用t檢驗；兩組間率的比較采用卡方檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般觀察 術(shù)后25 ～28 周，模型組存活15只，死亡5 只；加味旋覆代赭湯組存活17 只，死亡3 只；達(dá)喜組存活16 只，死亡4 只；假手術(shù)組存活19 只，死亡1 只。死亡大鼠均解剖探查，7只死于食管穿孔，不明原因6 只。大體病理觀察可見模型組食管下段顯著增粗，縱行剖開食管，可見下端食管顯著增厚，食管下段黏膜呈廣泛顯著不規(guī)則隆起，外觀顏色呈白斑樣改變。加味旋覆代赭湯組食管大體病理較模型組顯著減輕，達(dá)喜組食管大體病理較模型組無顯著差異（圖2）。

圖2 各組大鼠食管大體組織學(xué)觀察

2.2 食管病理組織學(xué)改變 加味旋覆代赭湯組的食管炎癥程度較模型組顯著減輕（P＜0.01），但達(dá)喜組與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；加味旋覆代赭湯組BE 發(fā)生率顯著低于模型組（P＜0.05），但達(dá)喜組與模型組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；其他病理改變，如糜爛及潰瘍、基底細(xì)胞增生、鱗狀上皮增生，加味旋覆代赭湯組均較模型組顯著減輕（P＜0.05），見表1、圖3。

表1 各組大鼠食管病理組織學(xué)改變[>n（%）]

圖3 各組大鼠食管病理組織學(xué)改變（HE 染色，×100）

2.3 CDX2、DLK1 蛋白表達(dá)水平 加味旋覆代赭湯組的CDX2、DLK1 表達(dá)水平均顯著低于模型組（P＜0.01），而達(dá)喜組與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖4、5。

圖4 各組大鼠食管組織CDX2、DLK1 表達(dá)（免疫組織化學(xué)染色，×100）

圖5 各組大鼠食管組織CDX2、DLK1 免疫組化染色平均IOD 值

3 討論

非酸反流與BE 及食管腺癌發(fā)生關(guān)系密切。非酸物質(zhì)中尤其是膽汁酸可通過激活其核受體FXR/CDX2 途徑促進(jìn)胃食管黏膜腸化及癌變。Notch 途徑調(diào)控上皮增殖細(xì)胞向杯狀細(xì)胞分化。CDX2 為同源異型盒基因家族的成員之一，其編碼的蛋白是腸道特異性基因關(guān)鍵調(diào)控因子，對腸上皮的分化、增殖以及形態(tài)及功能的維持發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用。正常胃黏膜上皮中CDX2 呈陰性，但在慢性萎縮性胃炎的胃黏膜上皮中隨杯狀細(xì)胞等腸道特異性細(xì)胞的出現(xiàn)，CDX2 的表達(dá)顯著增強[12]；而將CDX2 轉(zhuǎn)入正常小鼠胃黏膜上皮細(xì)胞，可發(fā)生腸上皮化生，提示CDX2 異位表達(dá)可能是胃黏膜出現(xiàn)腸上皮表型的始動因子。近年研究發(fā)現(xiàn)CDX2蛋白也異位表達(dá)于BE[13-14]。反流性食管炎所致的BE 中食管的鱗狀上皮被腸上皮所代替，CDX2 的表達(dá)亦呈明顯增強趨勢，提示CDX2 高表達(dá)在BE的腸化中可能起重要作用，即CDX2 可誘導(dǎo)細(xì)胞向腸上皮分化。

Notch 信號通路由一系列蛋白分子家族組成，包括Notch 受體、其配體、正負(fù)修飾分子以及轉(zhuǎn)錄因子，參與細(xì)胞的生長、增殖、分化等調(diào)控過程。Notch 受體和其配體DLK1、DLK2、DLK3、DLK4 是通過細(xì)胞之間接觸發(fā)揮作用[15]。Notch與胃癌和結(jié)直腸癌的發(fā)病機制密切相關(guān)[16]，抑制Notch 信號會導(dǎo)致增殖細(xì)胞向杯狀細(xì)胞分化，而Notch 信號激活將會引起隱窩增殖細(xì)胞擴增，并抑制其向分泌型細(xì)胞分化。研究發(fā)現(xiàn)膽汁酸可通過CDX2 依賴模式激活Notch1/DLK1 信號途徑，顯示二者之間存在串話（crosstalk）效應(yīng)，提示在非酸反流所致BE 腸上皮化生過程中，Notch1/DLK1信號途徑與CDX2 具有協(xié)同交互作用。

本實驗采用十二指腸-食管吻合術(shù)（胃全切）建立大鼠十二指腸-食管反流模型，在建模28 周時，進(jìn)行病理組織學(xué)觀察，吻合口段食管顯著增厚，食管下段黏膜呈廣泛顯著不規(guī)則隆起，外觀顏色呈白斑樣改變，近半數(shù)模型大鼠發(fā)生了典型BE 表現(xiàn)，并伴顯著腸化生（杯狀細(xì)胞增生），經(jīng)免疫組織學(xué)檢查，Notch1 配 體DLK1 表達(dá)及CDX2 表達(dá)顯著增強，與腸化生相關(guān)，初步提示CDX2 與Notch1/DLK1 信號途徑參與食管上皮腸化生，與BE 發(fā)生有關(guān)。

目前大部分對BE 的中醫(yī)治療，例如對于內(nèi)鏡檢查發(fā)現(xiàn)食管黏膜呈顆粒樣增粗或證實為BE 的患者，多加用山慈菇和白花蛇舌草，在旋覆代赭湯降逆化痰、益氣和胃基礎(chǔ)上，增加了化痰散結(jié)、清熱散結(jié)的作用[17-18]。本研究模型大鼠經(jīng)加味旋覆代赭湯治療后，食管大體病理改變顯著減輕；病理組織學(xué)檢查顯示重度食管炎發(fā)生率顯著降低，糜爛及潰瘍、基底細(xì)胞增生、鱗狀上皮增生等病變顯著減輕；BE 發(fā)生率也顯著降低；免疫組化檢測CDX2、DLK1 表達(dá)，二者在加味旋覆代赭湯組的表達(dá)也均顯著低于模型組。因此，本研究結(jié)果提示加味旋覆代赭湯可通過抑制CDX2 及Notch信號分子DLK1 表達(dá)，從而抑制腸化，減少非酸反流所導(dǎo)致的BE 發(fā)生。