鈣網(wǎng)織蛋白-短發(fā)夾RNA 慢病毒載體構(gòu)建及其對(duì)喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞Hep-2 中鈣網(wǎng)織蛋白表達(dá)的影響△

高樹峰，楊明福，張克輝，游龍貴，王富華，王心濤，劉遺斌，羅冬，蔡云香

贛州市人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，江西 贛州3410000

喉癌是耳鼻咽喉頭頸外科常見的惡性腫瘤，發(fā)病率高，在中國，其占全身腫瘤的1%～2%，占耳鼻咽喉惡性腫瘤的11%～22%。早期喉癌的治療方法以手術(shù)或放療為主，中晚期喉癌的治療方法為以手術(shù)為主的綜合治療。雖然目前的治療手段提高了喉癌患者的5 年生存率，但術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍是喉癌患者的主要死因[1-2]。因此，尋找有效、簡便、不良反應(yīng)小的新治療方法成為耳鼻咽喉科工作者關(guān)注的焦點(diǎn)。喉癌的發(fā)生是以癌基因的激活和抑癌基因的失活為基礎(chǔ)的多步驟、多階段過程，因此，尋找阻斷癌基因激活與抑癌基因失活的靶向基因是目前研究的工作重點(diǎn)[3-4]。鈣網(wǎng)織蛋白（cal‐reticulin，CRT）具有促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬腫瘤細(xì)胞并破壞腫瘤細(xì)胞的功能，當(dāng)細(xì)胞凋亡時(shí)，CRT 會(huì)發(fā)生簇集，與相關(guān)蛋白所識(shí)別的磷脂酰絲氨酸（phos‐phatidylserine，Ps）、C1q 形成“來吃我”信號(hào)識(shí)別復(fù)合體，啟動(dòng)清除、吞噬過程，同時(shí)，促使凋亡細(xì)胞被樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）等識(shí)別并呈遞給CD4+和CD8+，從而激發(fā)抗腫瘤免疫應(yīng)答[5]。為了探究CRT 在喉癌發(fā)展過程中的可能機(jī)制，本研究自行設(shè)計(jì)并構(gòu)建了CRT-短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）慢病毒載體，鑒定了其對(duì)人喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞Hep-2 中CRT基因的沉默效果，為后續(xù)研究CRT基因功能奠定基礎(chǔ)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

限制性內(nèi)切酶EcoRⅡ、BamHⅠ、T4DNA 連接酶及DNA 凝膠回收試劑盒均購自TaKaRa 公司；DH5α大腸桿菌購自上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司；慢病毒包裝細(xì)胞293T 細(xì)胞、Lipofectami‐neTM2000 轉(zhuǎn)染試劑、SYBR Green qPCR SuperMix 試劑盒、immobilon western chemilum HRP substrate 試劑均購自Invitrogen 公司；高純度質(zhì)粒小提試劑盒、胎牛血清均購自Hyclone 公司；LymphoprepTM分離液購自NycoPrep 公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒、CRT 抗體、兔抗人免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）抗體均購自Abcam 公司；人喉鱗狀細(xì)胞癌上皮細(xì)胞Hep-2 購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。

1.2 方法

1.2.1 人CRT siRNA 靶序列的設(shè)計(jì)合成及表達(dá)載體構(gòu)建 通過國家生物技術(shù)信息中心（the Nation‐al Center for Biotechnology Information，NCBI）檢索人CRT基因信息，獲取CRT基因核苷酸序列，使用相關(guān)的siRNA 干擾序列設(shè)計(jì)軟件并經(jīng)Blast 比對(duì)分析同源性后，選擇3 條特異性較高的核心編碼序列（coding sequence，CDS），分 別 命 名 為siRNA1（GAGAAAGATAAAGGTTTGCAGACAAGCCAG ‐GATGCACGCT）、siRNA2（CAACAGCCAGGTG‐GAGTCCGGCTCCTTGGAAGACGATTGG）和siR‐NA3（ACGAGACGTGGGGCGTAACAAAGGCAG‐CAGAGAAACAAAT），同時(shí)選擇一條無意義的序列作為陰性對(duì)照，命名為Negative siRNA（TAT‐CAGCACGTGTCAGTACG）。將這4 條序列構(gòu)建成穩(wěn)定的表達(dá)載體CRT siRNA（1、2、3）-pSIH1-H1-copGFP 和Negative siRNA-pSIH1-H1-copGFP，將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，挑取單克隆菌落進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）鑒定，并對(duì)陽性單克隆菌液進(jìn)行測序。

1.2.2 有效序列的篩選 采用高純度質(zhì)粒小提取試劑盒提取純化CRT siRNA-pSIH1-H1-copGFP 質(zhì)粒，然后利用LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑分別將其轉(zhuǎn)入培養(yǎng)的喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞Hep-2 中，通過實(shí)時(shí)PCR 檢測細(xì)胞中CRTmRNA 的相對(duì)表達(dá)量，以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參基因?；虮磉_(dá)效率=（1-siR‐NA 序列mRNA 占空白對(duì)照組的百分比）/轉(zhuǎn)染率。選擇一條沉默效率最高的CRT siRNA。

1.2.3 慢病毒載體的包裝及滴度測定 選擇沉默效率最高的CRT siRNA 包裝生產(chǎn)CRT-shRNA 慢病毒。具體操作方法：用限制性內(nèi)切酶EcoRⅡ、BamHⅠ將pLVX-shRNA 載體雙酶切后，用DNA 凝膠回收試劑盒純化回收線性片段，再使用T4 DNA連接酶將回收的載體片段與CRT siRNA 片段連接。經(jīng)PCR 鑒定為陽性且測序正確的載體命名為Lv-CRT shRNA。將Lv-CRT shRNA 質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒導(dǎo)入293T 細(xì)胞中，獲得高滴度的慢病毒。將高滴度的慢病毒按照10 倍梯度稀釋后轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞，培養(yǎng)48 h 后，用熒光顯微鏡對(duì)熒光陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)并計(jì)算慢病毒滴度。

1.2.4 慢病毒載體體外感染 取培養(yǎng)狀態(tài)良好的第二代喉癌細(xì)胞系Hep-2，感染實(shí)驗(yàn)前24 h 進(jìn)行接種，使用Ham’s F-12+10%胎牛血清（fetal calf se‐rum，F(xiàn)BS）的完全培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，然后使用CRT siRNA-慢病毒液感染，添加病毒液，感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）為30。感染后24 h 進(jìn)行換液，換液后72、96 h 于顯微鏡下觀察細(xì)胞有無綠色熒光蛋白表達(dá)，并進(jìn)行傳代、培養(yǎng)，傳代后24、72 h 分別觀察，然后繼續(xù)做傳代培養(yǎng)。

1.2.5 基因及蛋白表達(dá)水平檢測 取傳代培養(yǎng)細(xì)胞菌液，提取總RNA 和總蛋白，進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR 和蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測。實(shí)驗(yàn)分為3 組，即空白對(duì)照組（喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞Hep-2）、陰性對(duì)照組（喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞Hep-2+Lv-Negative shR‐NA）、shRNA 組（喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞Hep-2+Lv-CRT shRNA）。采用實(shí)時(shí)PCR 檢測3 組喉鱗狀細(xì)胞癌 細(xì) 胞Hep-2 中CRT基 因 的 表 達(dá) 量：取10 μg 總RNA，以O(shè)ligo（dT）為引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 后，取5 μl cDNA 模板，使用SYBR Green qPCR superMix試劑盒進(jìn)行熒光定量檢測。CRT基因的上游引物 為5'-ACTGTACTGATCATACGAGACG-3'，下 游引物為5'-CAGCGTCCAATTTGTTTCTCTGC-3'。β-actin基因的上游引物為5'-CTCCATCCTGGCCTC‐GCTGT-3'，下游引物為5'-GCTGTCACCTTCACC‐GTTCC-3'。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃3 min，95 ℃30 s，60 ℃30 s，共36 個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，導(dǎo)出計(jì)算結(jié)果，采用2-ΔΔCt法對(duì)CRT基因的表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定量分析。Western blot 檢測方法：提取3 組喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞Hep-2 總蛋白后，采用BCA 蛋白定量試劑盒對(duì)蛋白進(jìn)行初步定量，每組取等量蛋白進(jìn)行上樣，采用8%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（so‐dium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophore‐sis，SDS-PAGE）進(jìn)行凝膠電泳后，將目的條帶轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST（Tris-HCl Strip Buf‐fer Tween）緩沖液封閉轉(zhuǎn)膜1 h，室溫下與一抗（CRT 抗體）孵育2 h，洗去未結(jié)合一抗，再于室溫下與二抗（兔抗人IgG 抗體）孵育1 h，洗去未結(jié)合二抗，于雜交膜上加入immobilon western chemilum HRP substrate，反應(yīng)5 min 后，于暗室進(jìn)行曝光、顯影、定影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0、SAS 9.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher 確切概率法。相關(guān)性分析采用Spearman 秩相關(guān)分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人CRT siRNA 表達(dá)載體的鑒定

CRT siRNA-pSIH1-H1-copGFP 表達(dá)載體的PCR 產(chǎn) 物 大 小 為240 bp，Negative siRNA-pSIH1-H1-copGFP 的PCR 產(chǎn) 物 為220 bp。PCR 陽 性 鑒 定及測序分析結(jié)果顯示，插入片段的序列及方向均與預(yù)期結(jié)果一致。（圖1）

圖1 PCR陽性鑒定結(jié)果

2.2 有效序列的篩選

含靶序列CRT siRNA1、CRT siRNA2、CRT siR‐NA3 的載體轉(zhuǎn)染喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞Hep-2 的表達(dá)量均低于空白對(duì)照，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。含靶序列CRT siRNA1、CRT siRNA2 的載體轉(zhuǎn)染喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞Hep-2 的基因表達(dá)效率均低于CRT siRNA3，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。含不同靶序列的載體轉(zhuǎn)染喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞Hep-2 后的表達(dá)量和表達(dá)效率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表1）

表1 不同靶序列的基因表達(dá)情況（±s）

表1 不同靶序列的基因表達(dá)情況（±s）

注：a與空白對(duì)照比較，P＜0.05；b與CRT siRNA3比較，P＜0.05

靶序列CRT siRNA1 CRT siRNA2 CRT siRNA3 Negative siRNA空白對(duì)照F值P值表達(dá)量1.24±0.22a 1.64±0.31a 0.84±0.20a 3.61±0.53 3.66±0.54 40.096＜0.05轉(zhuǎn)染率（%）92.05±1.36 90.13±1.05 91.68±1.24 90.32±1.14—1.918＞0.05表達(dá)效率（%）71.73±1.18b 61.45±1.26b 84.78±0.95 1.34±0.41—316.910＜0.05

2.3 慢病毒載體的滴度測定及感染情況

經(jīng)測定，慢病毒載體的滴度為3.5×107TU/ml，MOI=30 時(shí)，慢病毒轉(zhuǎn)染至Hep-2 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率在90%以上。

2.4 基因及蛋白表達(dá)水平

實(shí)時(shí)PCR 結(jié)果顯示，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞Hep-2 中CRT基因的表達(dá)水平分別為（3.662±0.023）和（3.620±0.031），兩組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；shRNA 組喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞Hep-2 中CRT基因的表達(dá)水平為（0.829±0.006），低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，差異 均 有 統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 意 義（t=206.434、245.783，P＜0.05）。Western blot 結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，shRNA 組喉癌Hep-2 細(xì)胞中CRT 蛋白的表達(dá)水平明顯下降。

3 討論

CRT 是一種主要存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的Ca2+結(jié)合蛋白，也存在于細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞的胞漿顆粒和嗜中性粒細(xì)胞表面，由單一基因編碼，位于人19號(hào)染色體，包含9 個(gè)外顯子，具有高度的進(jìn)化保守性。CRT 最初被認(rèn)為僅參與了Ca2+平衡的調(diào)節(jié)。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)CRT 在抑制腫瘤血管生成、抗原呈遞和細(xì)胞凋亡中也具有重要作用[6-8]。細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，CRT 發(fā)生簇集并與相關(guān)蛋白結(jié)合形成“來吃我”信號(hào)識(shí)別復(fù)合體，清除、吞噬巨噬細(xì)胞[9]。CRT 能夠引起E7 抗原特異性分泌γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ），使CD4+T 淋巴細(xì)胞明顯增殖，從而發(fā)揮抗腫瘤作用，還能通過“交叉啟動(dòng)”效應(yīng)增強(qiáng)細(xì)胞核因子對(duì)腫瘤特異性抗原的免疫原性，從而增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤能力[10]。近年來，又發(fā)現(xiàn)CRT 能夠被蒽環(huán)類抗生素誘導(dǎo)表達(dá)于細(xì)胞表面，并促使樹突狀細(xì)胞的吞噬及細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答，增強(qiáng)蒽環(huán)類抗生素的化療效果[11]。研究發(fā)現(xiàn)，白血病、非霍奇金淋巴瘤以及膀胱癌、腦癌和膽囊癌的腫瘤細(xì)胞表面均表達(dá)CRT，腫瘤細(xì)胞的侵襲性增強(qiáng)，腫瘤細(xì)胞中CRT 的表達(dá)水平也相應(yīng)升高，而大多數(shù)正常細(xì)胞群表面不表達(dá)或弱表達(dá)CRT[12-14]。Boasman 等[15]發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞表面的CRT 具有促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬并破壞這些腫瘤細(xì)胞的功能，大多數(shù)腫瘤細(xì)胞不會(huì)受到巨噬細(xì)胞攻擊的原因是這些腫瘤細(xì)胞同時(shí)還表達(dá)另外一種分子CD47，從而抵消了CRT 促吞噬的信號(hào)。通過沉默CRT基因在腫瘤細(xì)胞的表達(dá)反向證明CRT的過表達(dá)在腫瘤發(fā)展中的作用，可能會(huì)給以CRT為靶點(diǎn)的基因治療提供新途徑。

RNAi 技術(shù)能以少量的dsRNA 達(dá)到同源基因特異性沉默的目的，其作用原理是siRNA 與其對(duì)應(yīng)的內(nèi)源基因mRNA 特異性結(jié)合，阻止翻譯過程，從而達(dá)到基因沉默的效果，是研究基因功能、表達(dá)調(diào)控機(jī)制及基因治療領(lǐng)域的關(guān)鍵技術(shù)[16]。RNAi 常用的載體有質(zhì)粒載體和慢病毒載體，相比而言，慢病毒載體有更大的優(yōu)勢，不僅能轉(zhuǎn)染分裂期細(xì)胞，又能轉(zhuǎn)染非分裂期細(xì)胞，大大提高了轉(zhuǎn)染效率；同時(shí)慢病毒載體的穩(wěn)定性更好，可以容納大片段的外源基因，并能夠長久穩(wěn)定表達(dá)，且免疫反應(yīng)小，因此，其已經(jīng)成為理想的轉(zhuǎn)基因載體，應(yīng)用越來越廣泛[17]。

本研究利用RNAi 技術(shù)設(shè)計(jì)了3 條以CRT基因?yàn)榘悬c(diǎn)的siRNA，構(gòu)建表達(dá)CRT siRNA-pSIH1-H1-copGFP 質(zhì)粒，經(jīng)PCR 陽性鑒定及測序分析證明插入片段的序列及方向均與預(yù)期一致，通過轉(zhuǎn)染喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞Hep-2 篩選出沉默效率最高的CRT siRNA3。將CRT siRNA3包裝生產(chǎn)CRT-shRNA慢病毒后，得到高滴度（3.5×107TU/ml）的慢病毒載體Lv-CRT shRNA，完全可以滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的需求。以人喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞Hep-2 為靶細(xì)胞進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染率可達(dá)90%，經(jīng)實(shí)時(shí)PCR 和West‐ern blot 檢測證實(shí)，重組慢病毒可以抑制Hep-2 細(xì)胞中CRT 蛋白及基因的表達(dá)水平，提示本研究成功構(gòu)建了CRT-shRNA 慢病毒干擾載體，為對(duì)以CRT為靶點(diǎn)的基因治療的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。