銀杏葉片黃化過程中光合色素含量和葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化特征研究

王藝斐，姜澤東，張 敖，計(jì)舒文，何夢(mèng)原，朱延姝

(沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866)

【研究意義】銀杏(GinkgobilobaL.)為落葉喬木，是中國(guó)北方大量栽培的重要觀賞性樹木。銀杏葉片在秋季低溫下變黃，觀賞性極高。然而，好景不長(zhǎng)，銀杏葉片黃化后不久即脫落。這種脫落可能與光抑制引起的衰老有關(guān)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】秋季氣溫下降，導(dǎo)致植物葉片光合作用中參與暗反應(yīng)過程的酶活性顯著降低，CO2同化速率減慢，而氣溫降低影響光合作用光反應(yīng)速率的程度相對(duì)較小[1]。光反應(yīng)與暗反應(yīng)速率之間的失衡造成激發(fā)能過剩，即植株葉片吸收的光能超過CO2同化所能利用的能量。過剩光能引起光抑制，導(dǎo)致葉片光合作用速率持續(xù)降低[2]。葉片吸收的過剩光能產(chǎn)生活性氧，后者引起細(xì)胞膜脂和蛋白質(zhì)分子等生物大分子的氧化分解[3]，加快葉片的衰老?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】越冬植物秋季葉片的主要功能是盡可能地維持光合作用，為下一年春天的生長(zhǎng)積累營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并且在葉片脫落前維持細(xì)胞的基本結(jié)構(gòu)和功能，以利于將葉片中合成的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)盡可能多的轉(zhuǎn)移到越冬的延存器官。因此，秋季葉片適當(dāng)性衰老對(duì)多年生樹木越冬前的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)移和貯存具有重要意義。在秋季低溫脅迫時(shí)，控制葉片衰老的關(guān)鍵是清除由光能過剩所導(dǎo)致產(chǎn)生的過多活性氧[4]。銀杏葉片在秋季衰老過程中外觀顏色顯著變紅或黃化。研究表明，植物葉片主動(dòng)延緩衰老的手段是依靠葉片所含光合色素中的類胡蘿卜素和花色素來清除產(chǎn)生的活性氧[5-8]。【擬解決的關(guān)鍵問題】本文以3種不同顏色銀杏葉片為材料，比較光合色素含量、葉綠素?zé)晒鈪?shù)和吸收光譜，為了解秋季銀杏葉衰老脫落機(jī)制及其調(diào)控提供研究思路和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

材料選取種植在沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)的銀杏(GinkgobilobaL.)樹，樹齡約30年。以向陽(yáng)且程度一致的無病變、無損傷的綠色葉、淺綠色葉和黃色葉為實(shí)驗(yàn)材料，測(cè)定葉片的吸收光譜、葉綠素?zé)晒鈪?shù)及光合色素含量。測(cè)定時(shí)間為2016年10月上旬，上午，當(dāng)天平均氣溫為20 ℃，光照強(qiáng)度為897.867 μmol·m-2·s- 1，5次重復(fù)。

1.2 測(cè)定指標(biāo)和方法

1.2.1 吸收光譜測(cè)定 銀杏葉片吸收光譜的測(cè)定使用英國(guó)HANSATECH公司的Unispec-SC Spectral Analysis System(PP-Systems)測(cè)定銀杏3種不同顏色葉片的吸收光譜。

1.2.2 葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)曲線測(cè)定 使用植物效率儀(Handy PEA，英國(guó)HANSATECH公司)測(cè)定葉綠素?zé)晒鈪?shù)。首先用葉夾夾住葉片中部，暗適應(yīng)時(shí)間為30 min。獲得的參數(shù)包括：Fo(初始熒光minimal fluorescence)、Fm(最大熒光maximal fluorescence)、Fv(可變熒光variable fluorescence，F(xiàn)v=Fm-Fo)、Fv/Fm(PSⅡ最大光化學(xué)效率 optimal/maximal quantum yield of PSⅡ)、Wk(PSⅡ供體側(cè)傷害指數(shù))、ETo/RC(電子傳遞所需能量)、DIo/RC(反應(yīng)中心熱耗散)和RC/CSm(單位面積反應(yīng)中心數(shù)量)。

1.2.3 光合色素含量測(cè)定 參考韋友歡[9]提取光合色素的方法，使用95 %乙醇浸提總色素，測(cè)定提取液470、474、485、645、663 nm下的吸光值，計(jì)算葉綠素a(Chla)、b(Chlb)、葉綠素a+b(Chla+Chlb)、胡蘿卜素和葉黃素含量。

計(jì)算公式為：葉綠素a濃度(mg/L)=(9.784×OD663-0.99×OD645)；葉綠素b濃度(mg/L)=(12.6×OD645-4.65×OD663)；葉綠素a含量(mg/g)=葉綠素a濃度(mg/L)×提取液總體積(L)/樣品鮮重(g)；葉綠素b含量(mg/g)=葉綠素b濃度(mg/L)×提取液總體積(L)/樣品鮮重(g)；胡蘿卜素(mg/g)=(12.6OD485-6.00OD470-0.0298a+0.336b) ×提取液總體積(L)/樣品鮮重(g)(公式中的a為葉綠素a濃度，b為葉綠素b濃度，下同)；類胡蘿卜素(mg/g)=(4.92OD474-0.0255a-0.225b) ×提取液總體積(L)/樣品鮮重(g)；葉黃素(mg/g)=(10.2OD470-11.5OD485-0.0036a-0.652b)×提取液總體積(L)/樣品鮮重(g)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 17.0軟件分析銀杏3種顏色葉片的熒光參數(shù)和吸收光譜數(shù)據(jù)，采用Microsoft Office Excel 2016繪制數(shù)據(jù)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 銀杏葉片黃化過程光合色素含量比較

表1顯示，銀杏3種顏色葉片光合色素含量存在差異。綠色葉、淺綠色葉和黃葉的葉綠素a+b、葉綠素a和葉綠素b含量依次降低，均達(dá)到顯著水平，且與它們的外觀顏色表現(xiàn)一致；同時(shí)，隨著銀杏葉片變黃，類胡蘿卜素含量與葉綠素a+b含量變化趨勢(shì)為均逐漸降低，達(dá)到極顯著水平，但類胡蘿卜素含量下降幅度小于葉綠素含量下降的幅度；葉綠素a+b/類胡蘿卜素值下降且差異達(dá)極顯著水平，說明類胡蘿卜素的含量相對(duì)增加；銀杏葉片中胡蘿卜素和葉黃素的含量隨著葉片顏色由綠色到黃色過程中均逐漸降低，其差異達(dá)到極顯著水平。隨著葉片黃化，葉綠素a+b/總色素值降低，而類胡蘿卜素/總色素、胡蘿卜素/總色素和葉黃素/總色素值卻均升高。這表明盡管銀杏葉片黃化過程中總色素及各組分色素均發(fā)生降解，呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，但類胡蘿卜素、胡蘿卜素和葉黃素相對(duì)含量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。銀杏葉片衰老過程中，葉黃素/類胡蘿卜素相對(duì)比值上升。

表1 銀杏3種不同顏色葉片的光合色素含量和比值

2.2 3種顏色銀杏葉片吸收光譜比較

如圖1所示，銀杏3種顏色葉片吸收光譜存在明顯差異。由于不同種光合色素對(duì)可見光的吸收范圍不同，導(dǎo)致3種顏色葉片的吸收光譜相差明顯。在波長(zhǎng)400～510 nm范圍內(nèi)，銀杏3種顏色葉片對(duì)光能的吸收數(shù)量從高到低依次為綠色葉>淺綠色葉>黃色葉；在波長(zhǎng)為510～710 nm范圍內(nèi)，淺綠色葉片的光能吸收顯著低于綠色葉片，黃色葉片的光能吸收又顯著低于淺綠色葉片；在波長(zhǎng)為710～1110 nm范圍內(nèi)，不同顏色葉片的吸收光譜幾乎重合。植物光合作用中行使吸收光能功能的主要色素是葉綠素，隨著葉片的黃化，這種色素的含量顯著降低。盡管葉綠素在可見光的短波長(zhǎng)的藍(lán)紫光區(qū)和長(zhǎng)波長(zhǎng)的紅光區(qū)都有吸收峰，但是在本實(shí)驗(yàn)中，葉綠素含量降低對(duì)3種顏色銀杏葉片在長(zhǎng)波區(qū)的光吸收的影響更大。

圖1 銀杏3種顏色葉片的吸收光譜比較Fig.1 Comparison absorption spectrum with three types leaves of Ginkgo biloba L.

2.3 3種顏色銀杏葉片葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)曲線和熒光參數(shù)比較

如圖2所示，3種顏色銀杏葉片葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)曲線存在顯著差異。綠葉和淺綠葉片的O-J-I-P各點(diǎn)明顯，為典型的葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線；黃葉的葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)曲線未呈現(xiàn)經(jīng)典曲線特征，O-J-I-P各點(diǎn)不明顯，表明黃色葉片的光化學(xué)活性處于非常低的水平上。

圖2 銀杏3種顏色葉片的葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)曲線比較Fig.2 Comparison of chlorophyll fluorescence kinetics in three types of leaves with different color of Ginkgo biloba L.

3種顏色銀杏葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)明顯不同(表2)。隨葉片黃化，最大熒光Fm呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)，黃葉的Fm最低，說明葉片失綠黃化降低葉片PSⅡ的最大光反應(yīng)活性；與綠葉和淺綠葉的Fv/Fm(PSⅡ最大光化學(xué)效率)對(duì)比后發(fā)現(xiàn)，黃葉Fv/Fm極顯著降低，說明黃色葉片具有較強(qiáng)的阻止過剩光能進(jìn)入葉綠體光能轉(zhuǎn)換系統(tǒng)的能力，從而減少活性氧的產(chǎn)生；與綠葉和淺綠葉相比，黃葉的初始熒光Fo顯著降低，但下降幅度遠(yuǎn)小于Fm和Fv/Fm，說明銀杏葉片由綠色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色的過程中維持有非常強(qiáng)的光能非光化學(xué)耗散能力，而且，隨著葉片黃化，反應(yīng)中心的熱耗散DIo/RC表現(xiàn)為升高的趨勢(shì)，這表明黃化葉片的反應(yīng)中心也形成了較強(qiáng)的能量熱耗散能力。Wk(PSⅡ供體側(cè)傷害指數(shù))隨著銀杏葉片顏色變黃，表現(xiàn)為不斷升高的趨勢(shì)，說明在葉片黃化過程中PSⅡ供體側(cè)傷害程度逐漸加深。

隨著銀杏葉片的黃化，ETo/RC呈降低的趨勢(shì)，黃色葉與綠色葉呈現(xiàn)極顯著的差異，說明隨著葉片黃化光反應(yīng)復(fù)合體吸收的用于電子傳遞的能量比例也在減少。RC/CSm的趨勢(shì)呈綠色葉>淺綠色葉>黃色葉，且3種顏色葉片的差異均達(dá)到極顯著，這樣的結(jié)果表明單位面積的反應(yīng)中心數(shù)量減少是葉片黃化過程的一個(gè)重要特征。

3 討 論

在本研究中，銀杏葉片衰老過程中所有光合色素含量均下降，但是不同光合色素下降的速率存在很大差異，其中葉綠素b下降慢于葉綠素a，類胡蘿卜素慢于葉綠素，葉黃素慢于胡蘿卜素，從而導(dǎo)致在衰老過程中，葉片的葉綠素a/葉綠素b、葉綠素/類胡蘿卜素、胡蘿卜素/葉黃素比值下降(表1)。本研究結(jié)果顯示3種葉色銀杏葉片的吸收光譜有顯著差異(圖1)。在總體上，葉色越黃，可見光的吸收越少。在波長(zhǎng)為310～510 nm范圍，3種葉片的光吸收差異較小，但在510～710 nm范圍，3種葉片光吸收量的差異非常清晰，在750～1110 nm范圍內(nèi)，3種葉片又有相近的光吸收。本研究還觀察到隨著葉片黃化，F(xiàn)v/Fm(PSⅡ最大光化學(xué)反應(yīng)效率)的變化與葉綠素含量的變化趨向一致，均為顯著下降(表2)，其他葉綠素?zé)晒鈪?shù)也發(fā)生明顯變化。

葉綠素是植物光合作用的關(guān)鍵色素，其中一小部分葉綠素a是反應(yīng)中心色素，將光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能。在本研究中，隨著銀杏葉片黃化，葉綠素—主要是葉綠素a數(shù)量減少，導(dǎo)致植物光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能的能力降低[10-11]，葉片吸收的光能大部分成為無效吸收，從而導(dǎo)致光系統(tǒng)Ⅱ最大光化學(xué)反應(yīng)效率下降。這種變化與葉片黃化過程中光合速率的下降[12-13]相協(xié)調(diào)，這樣，可以防止激發(fā)能過剩而導(dǎo)致的活性氧產(chǎn)生，從而避免或減輕葉片的光氧化破壞。因此，當(dāng)環(huán)境溫度較低葉片光合作用下降時(shí)，適當(dāng)加快銀杏葉片失綠黃化可能有助于減緩衰老，從而推遲脫落，延長(zhǎng)觀賞期。

類胡蘿卜素是光合作用中的輔助色素，但不可缺少，其作用之一是將吸收的光能傳遞給葉綠素，其二是保護(hù)作用，將過剩激發(fā)能以熱能的形式耗散，防止活性氧的產(chǎn)生[14-15]。在本研究中，在銀杏葉片衰老過程中所有光合色素含量都呈下降趨勢(shì)，但是類胡蘿卜素尤其是葉黃素的比例上升。這一結(jié)果也與楊舜博在銀杏金葉呈色的調(diào)控機(jī)理研究結(jié)果相同，該實(shí)驗(yàn)鑒定出銀杏葉片黃化過程中調(diào)控類胡蘿卜素生物合成的關(guān)鍵基因ZDS、LCYE等均上調(diào)表達(dá)，同時(shí)KEGG分析中發(fā)現(xiàn)類胡蘿卜素生物合成通路存在富集現(xiàn)象，皆促進(jìn)黃色葉片中類胡蘿卜素不斷積累[16]。說明在葉片衰老階段仍會(huì)產(chǎn)生大量過剩激發(fā)能，有較多的活性氧產(chǎn)生，需要類胡蘿卜素來清除。業(yè)已證明，葉黃素循環(huán)是葉片過剩激發(fā)能熱耗散的重要途徑之一[17-18]。因此，在秋季溫度降低時(shí)，適當(dāng)維持葉片類胡蘿卜素含量將有助于延緩衰老脫落。

光系統(tǒng)Ⅱ最大光化學(xué)反應(yīng)效率是表示植物光反應(yīng)能力的重要參數(shù)，植物在受到光抑制時(shí)導(dǎo)致Fv/Fm下降[19]。有研究者發(fā)現(xiàn)光脅迫導(dǎo)致PSⅡ中的D1蛋白降解，造成電子受體銳減，也會(huì)影響光合機(jī)構(gòu)功能，導(dǎo)致光能轉(zhuǎn)化率降低[20-22]。在本研究中，淺綠葉與綠葉相比，F(xiàn)v/Fm的下降幅度較小，而黃葉與綠葉和淺綠葉相比，F(xiàn)v/Fm的下降幅度均很劇烈。然而，比較不同葉片的PSⅡ最大熒光Fm(表2)發(fā)現(xiàn)，該參數(shù)在不同葉片之間的差異遠(yuǎn)大于Fv/Fm的差異。與綠葉相比，淺綠葉的Fm下降幅度遠(yuǎn)大于Fv/Fm的下降，說明Fv/Fm不能很好的反映葉片衰老過程中光反應(yīng)的實(shí)際變化，因?yàn)樗徽f明了PSⅡ反應(yīng)中心的光化學(xué)反應(yīng)效率，不能反映葉片總體PSⅡ活性的變化情況。在葉片衰老過程中，不僅單個(gè)光系統(tǒng)的活性發(fā)生變化，而且，活性光系統(tǒng)總數(shù)也發(fā)生變化。淺綠葉和黃色葉的RC/CSm(單位面積活性反應(yīng)中心數(shù)量)均顯著低于綠色葉片。這暗示我們?cè)谟肍v/Fm衡量衰老葉片的光化學(xué)變化時(shí)，需要參考Fm和RC/CSm的變化。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)一個(gè)難以解釋的現(xiàn)象，即盡管3種顏色銀杏葉片的光合色素含量有較大差異，但在310～500和750～1110 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)，3種葉片光能吸收量的差異較小，與光合色素含量變化幅度不一致。這種現(xiàn)象尚未見合理的解釋。我們推測(cè)這可能與色素蛋白復(fù)合體結(jié)構(gòu)變化有關(guān)。在衰老進(jìn)程中，銀杏葉片色素蛋白復(fù)合體解體，色素分散，有利于吸收光能。因此，盡管在黃化葉片中光合色素含量較低，但仍能吸收較多的光能。黃化葉片的這種特性可能有利于其在白天提高葉片溫度，有助于葉片內(nèi)含物的分解和向外轉(zhuǎn)運(yùn)。不過，這個(gè)特性可能引起葉片衰老脫落加快，不利于其觀賞期的維持。