ORFV感染羔羊后的組織定位及其病毒載量分析

許國洋，高廣亮，余遠迪，牟 豪，付利芝，沈克飛，白運川，楊 柳*

(1. 重慶市畜牧科學院，重慶 402460；2. 重慶市獸用生物制品工程技術研究中心，重慶 402460；3. 酉陽縣動物疫病預防控制中心，重慶 酉陽 409800)

【研究意義】羊口瘡又稱羊傳染性膿皰(Orf)，是由羊傳染性膿皰病毒引起的一種接觸性人獸共患病，主要感染山羊和綿羊，也可感染馴鹿和駱駝等野生動物，偶爾感染人類[1-2]。羊傳染性膿皰病毒屬于痘病毒科副痘病毒屬，對紫外線、乙醚和氯仿較為敏感，潮濕和高溫環(huán)境可導致其活性降低[3-4]。羊傳染性膿皰在山羊和綿羊中的發(fā)病率較高，各個階段的羊均可感染，春秋季節(jié)多發(fā)[5]。該病主要侵染羊的口唇部、尾根部、乳房等，受感染部位常出現(xiàn)丘疹、水皰、膿皰和結(jié)成疣狀結(jié)痂，破損后常繼發(fā)感染多種病原菌，加速病情惡化，造成動物機體抵抗力下降、進食困難、食欲廢絕等，嚴重者出現(xiàn)死亡，是引起羔羊死亡的主要病原之一[6-7]。目前，開展的羊傳染性膿皰病原學研究較多，但國內(nèi)尚無可有效防治該病的商品化疫苗產(chǎn)品[8]，因此，開展羊傳染性膿皰的病原學研究依然十分必要。【前人研究進展】McKeever D J等研究綿羊的口瘡病毒，主要闡述了口瘡病毒感染綿羊后對其皮膚組織的損傷機制[9]。周銘等將痂皮中的病毒在犢牛睪丸細胞中進行盲傳，發(fā)現(xiàn)盲傳至第4代開始出現(xiàn)細胞病變[10]。 高晶暉等利用犢牛睪丸細胞對痂皮中的羊傳染性膿皰病毒進行分離，發(fā)現(xiàn)盲傳至第5代出現(xiàn)細胞病變[11]。于永忠等利用MDBK細胞從患病山羊口唇部痂皮中分離到一株羊傳染性膿皰病毒，同時，開展了動物回歸試驗，但僅對攻毒后羔羊的臨床癥狀和血常規(guī)進行了檢測[12]。目前，關于羊傳染性膿皰病毒的組織分布及病毒載量未見報道。此外，筆者通過長期對重慶地區(qū)羊傳染性膿皰的研究發(fā)現(xiàn)從痂皮樣品分離純化疫苗候選毒株概率較低，這可能與痂皮中病毒的含量、死活及其細胞適應性有關。此外，口唇部創(chuàng)口暴露于外界環(huán)境，常導致病原菌的混合感染，產(chǎn)生的內(nèi)毒素和外毒素給病毒在細胞上的純化培養(yǎng)造成潛在威脅?！颈狙芯壳腥朦c】為了解決以上難題，筆者嘗試對病死羔羊的多個組織進行羊傳染性膿皰病毒的常規(guī)PCR檢測，發(fā)現(xiàn)其舌、上顎、尾根部、淋巴結(jié)、鼻甲骨等組織均出現(xiàn)陽性樣本，檢出率有一定差異，但表明這些組織中可能有病毒的存在，這可能與個體差異、發(fā)病程度和檢測方法有關，而關于羊傳染性膿皰病毒在羔羊體內(nèi)的分布情況未見報道。【擬解決的關鍵問題】本研究擬利用免疫組化方法和相對熒光定量PCR技術對病毒在羔羊體內(nèi)分布情況進行分析，以期為羊傳染性膿皰疫苗候選毒株的分離純化及其致病機制的深入研究提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

組織病毒基因組提取試劑盒、2×TaqPCR Master Mix、DL2000 DNA marker購自寶生物工程(大連)有限公司，TransStrat?Top Green qPCR SuperMix 熒光定量試劑盒購自北京全式金生物技術(TransGen Biotech)有限公司，設計引物F1L-F/F1L-R進行羊傳染性膿皰F1L基因的常規(guī)PCR擴增，引物F1L-f/F1L-r進行相對熒光定量PCR時F1L基因的擴增，引物GAPDH-f/GAPDH-r進行相對熒光定量PCR時內(nèi)參基因GAPDH的擴增，序列均由生工生物工程有限公司合成。

1.2 動物攻毒

選取4只未接種羊痘疫苗的健康斷奶羔羊，避免羊痘疫苗產(chǎn)生交叉免疫保護，羔羊由重慶某羊場提供。隨機選取3只羔羊，在其口腔下唇粘膜和尾根部皮膚進行羊傳染性膿皰病毒的劃痕接種，接種量為0.2 mL/只(TCID50=10-4.5/0.1 mL)，接種后，輕輕搓揉，使病毒液充分吸附，1只羔羊接種PBS 0.2 mL，設為對照組。正常飼喂，觀察記錄羔羊發(fā)病情況。

1.3 樣品處理

待山羊出現(xiàn)明顯的羊傳染性膿皰病毒感染癥狀時，放血處死，采集唇部、上顎、鼻甲骨、頸前淋巴結(jié)、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腸系膜淋巴結(jié)和尾根部組織樣品，各取5 g，利用組織勻漿機研磨處理，3000 r/min離心10 min，取上清提取基因組，利用F1/R1引物，擴增山羊傳染性膿皰病毒F1L全長基因序列，進行PCR鑒定；對PCR鑒定為陽性的組織樣品，另取5 g固定，參照褚秀玲等[13]的方法處理樣品，并送往重慶醫(yī)科大學進行免疫組織化學染色分析。

1.4 組織病毒載量測定與分析

1.4.1 組織病毒載量測定 利用組織病毒基因組提取試劑盒提取各組織樣品基因組，進行熒光定量PCR檢測，每個組織樣品基因做3個重復孔，熒光定量PCR反應體系為：2×qPCR SuperMix 10 μl，F(xiàn)1L-F/GAPDH-f(10 μmol/L) 0.5 μl，F(xiàn)1L-R/GAPDH-r (10 μmol/L) 0.5 μl，Template DNA 2 μl，RNase Free dH2O 7 μl；反應條件為：94 ℃ 預變性30 s，94 ℃變性5 s，61 ℃延伸35 s，40個循環(huán)；相對熒光定量PCR數(shù)據(jù)采用2-△△Ct法處理。

表1 引物序列信息

1.4.2 病毒增殖情況分析 依據(jù)不同組織中病毒載量情況，對病毒載量最高的組織樣品和痂皮樣品進行研磨處理，制備病毒懸液，按10 %接種量，感染OFTu細胞，觀察細胞病變情況，對比分析高病毒載量的組織樣品和痂皮中病毒的增殖情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床癥狀

試驗組羔羊在攻毒后10 d均出現(xiàn)典型的臨床癥狀，唇部內(nèi)側(cè)和尾根部出現(xiàn)皰疹，14 d唇部均開始出現(xiàn)疣狀結(jié)痂(圖1)，對照組正常。

A.唇部病變(10 d)；B.尾根部病變(10 d)；C.唇部病變(14 d)A.Lip lesions(10 days)；B.Tail root lesion(10 days)；C.Lip lesions(14 days)

2.2 羊傳染性膿皰病毒的組織分布

利用引物F1L-F/F1L-R對采集的樣品組織進行羊傳染性膿皰病毒的PCR鑒定，發(fā)現(xiàn)試驗組羔羊的唇部、上顎、鼻甲骨、腸系膜淋巴結(jié)、頸前淋巴結(jié)和尾根部均檢出羊傳染性膿皰病毒，而心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟均為陰性(圖2)。

M：DL2000 DNA marker；1.唇部；2.上顎；3.鼻甲骨；4.頸前淋巴結(jié)；5.心臟；6.肝臟；7.脾臟；8.肺臟；9.腎臟；10.腸系膜淋巴結(jié)；11.尾根部M：DL2000 DNA marker；1.Lip; 2.Palate; 3.Turbinate bone; 4.Anterior cervical lymph nodes; 5.Heart; 6.Liver; 7.Spleen; 8.Lung; 9.Kidney; 10.Mesenteric lymph node; 11.Tail root

2.3 免疫組化

通過對不同組織的免疫化學分析，發(fā)現(xiàn)試驗組羔羊唇部、上顎鼻甲骨、頸前淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)和尾根部組織細胞中均出現(xiàn)陽性印跡(圖3)，可見棕黃色顆粒彌散性分布，其中，唇部、尾根部、鼻甲骨、上顎反應強烈，為強陽性，頸前淋巴結(jié)表達量適中，腸系膜淋巴結(jié)表達量較低。

A：唇部；B：上顎；C：鼻甲骨；D：頸前淋巴結(jié)；E：腸系膜淋巴結(jié)；F：尾根部A:Lip; B: Palate; C: Turbinate; D: Anterior cervical lymph node; E: Mesenteric lymph node; F: Root of tail

2.4 組織病毒載量

對陽性組織樣品進行相對熒光定量PCR檢測，發(fā)現(xiàn)陽性檢出率均為100 %。羊傳染性膿皰病毒在唇部、口腔上額、鼻甲骨、頸前淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)、尾根部的含量(單位：2-△△Ct)分別為(17.59±0.14)、(22.73±0.1)、(24.41±1.9)、(2.75±0.16)、(0.15±0.02)、(19.29±0.51)，即在唇部、口腔上顎、尾根部的含量較高，在鼻甲骨的含量最高，在頸前淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)的含量較低。

2.5 病毒增殖情況

將處理后的鼻甲骨和唇部痂皮病毒懸液接種OFTu細胞后，發(fā)現(xiàn)在48 h均開始出現(xiàn)少量細胞的變圓脫落，細胞間隙變寬，72 h出現(xiàn)明顯的細胞病變，其中，鼻甲骨病毒懸液引起的細胞病變更為明顯，而對照組未見細胞病變(圖4)。盲傳3代后，測定鼻甲骨源和唇部痂皮源病毒TCID50分別為10-4.1和10-5.8。

A. 對照(72 h)；B. 鼻甲骨病毒懸液(72 h)；C. 唇部痂皮病毒懸液(72 h)A. Control(72 hours); B. Virus suspension of nasal turbinate(72 hours); C. Virus suspension of lip epidermal(72 hours)

3 討 論

羊傳染性膿皰可引起山羊和綿羊的口唇部、乳房和尾根部等產(chǎn)生丘疹、水泡和疣狀結(jié)痂，對羔羊危害較大，防控不及時，常導致繼發(fā)感染，嚴重者導致死亡，威脅養(yǎng)羊業(yè)的健康發(fā)展。目前，國內(nèi)尚無商品化羊傳染性膿皰疫苗，因此對羊傳染性膿皰疫苗候選毒株的研究十分關鍵。在羊傳染性膿皰病毒分離純化中，采集的樣品多為口唇部痂皮組織[14-15]，樣品受支原體、真菌和細菌等污染風險較大，若處理不當會給病毒在細胞上的增殖造成嚴重干擾。目前，關于羊傳染性膿皰病毒的分離鑒定研究報道較多，但多數(shù)僅對痂皮組織中的病毒進行初步的細胞培養(yǎng)。筆者研究發(fā)現(xiàn)，山羊感染口瘡病毒后常繼發(fā)感染多動物鏈球菌、金黃色葡萄球菌和溶血性曼氏桿菌[16]，由于樣品比較特殊，長期暴露于外界環(huán)境中，因此，殘留在痂皮組織中的病原菌內(nèi)毒素與外毒素可能對病毒的純化培養(yǎng)造成干擾。本研究對攻毒后羔羊的不同組織器官進行病毒定位及載量分析，發(fā)現(xiàn)試驗組羔羊唇部、上顎、鼻甲骨、腸系膜淋巴結(jié)、頸前淋巴結(jié)和尾根部均檢出羊傳染性膿皰病毒，而唇部、上顎、鼻甲骨和尾根部的病毒載量較高，其中，鼻甲骨病毒含量最高。綜上所述，通過對攻毒后羊傳染性膿皰病毒在羔羊體內(nèi)的組織定位及病毒載量分析，首次明確了山羊傳染性膿皰病毒可在在患病羔羊的多個組織中定殖，其在鼻甲骨中含量最高，且該組織中的病毒更易在OFTu細胞中增殖，為山羊傳染性膿皰疫苗候選毒株的分離純化及其致病機制的深入研究提供數(shù)據(jù)支撐。