湖南雪峰山天麻多糖提取工藝優(yōu)化研究

趙湘蓉 ， 方 偉 ，3，4，劉勝貴 ，3，4，田玉橋 ，陳三春 ，鄒 娟 ，3，4，邱小燕 ，3，4，伍賢進 ，3，4

（1.懷化學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，湖南懷化 418008；2.湖南省博世康中醫(yī)藥有限公司，湖南懷化 418008；3.民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點實驗室，湖南懷化 418008；4.湘西藥用植物與民族植物學(xué)湖南省高校重點實驗室，湖南懷化 418008）

0 引言

天麻（Gastrodia elata） 為蘭科天麻屬多年生草本植物，又名赤箭、白龍皮、明天麻等，常以干燥的塊莖入藥，據(jù)《本草綱目》記載：“赤箭辛、溫、無毒，主治諸風(fēng)濕痹、四肢拘攣、癱瘓不遂、眩暈頭痛等癥?！碧炻橹饕炻樗?、對羥基苯甲醇、蛋白質(zhì)、多糖和微量元素等化學(xué)成分。越來越多的科學(xué)研究表明，其中天麻多糖具有清除自由基[1]、抗腫瘤[2]、抗衰老[3]、降血壓[4-5]、調(diào)血脂[6]、免疫調(diào)節(jié)[7-8]等作用。2018年4月，國家衛(wèi)健委公布的《關(guān)于征求將黨參等9種物質(zhì)作為按照傳統(tǒng)既是食品又是中藥材物質(zhì)管理意見的函》中提到，擬將天麻按照食藥物質(zhì)管理并進行為期2年的試生產(chǎn)。這無疑為天麻產(chǎn)業(yè)發(fā)展帶來了新的契機，開發(fā)天麻健康食品、提升產(chǎn)品附加值將會成為天麻產(chǎn)業(yè)發(fā)展的新亮點。天麻的化學(xué)成分除了受品種、采收、產(chǎn)地、菌材等因素影響外，還與加工工藝密切相關(guān)。目前，關(guān)于雪峰山天麻方面的研究報道還較少。試驗以湖南雪峰山天麻為樣品，以多糖產(chǎn)量為衡量指標(biāo)，探究天麻多糖提取的最佳工藝，以期為天麻藥食兩用產(chǎn)業(yè)化加工奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料和設(shè)備

天麻，采挖于湖南綏寧。電熱恒溫鼓風(fēng)干燥器、電子分析天平、高速粉碎機等。

1.2 天麻預(yù)處理

采用蒸制法處理天麻樣品。取100 g左右的新鮮雪峰山天麻塊莖，洗凈后晾干水分，隔水蒸制20 min，瀝水切片，于80℃下熱風(fēng)烘干至恒質(zhì)量后粉碎過篩待測。

新鮮雪峰山天麻干凈塊莖→蒸制切片→80℃下烘干恒質(zhì)量→粉碎至80目→天麻粉末→超聲波提取→過濾→離心→上清液→蒸發(fā)濃縮→醇沉→離心取沉淀→低溫烘干→天麻多糖。

1.3 多糖提取試驗

天麻粉末置于烘箱中45℃條件下烘干至恒質(zhì)量，粉碎并過100目篩，得到天麻粉后固定其他條件，分別考查料液比（1∶4，1∶8，1∶12，1∶16，1∶20）、提取溫度 （30，35，40，45，50 ℃）、提取時間 （10，20，30，40，50 min） 對產(chǎn)量的影響。

1.4 天麻多糖含量的測定

1.4.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取在105℃下干燥至恒質(zhì)量的無水葡萄糖對照品33 mg，精確稱定，置于100 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度線，搖勻，得到每1 mL含無水葡萄糖0.33 mg的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

精確吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液 0，1，2，3，4，5，6 mL，分別置于7個10 mL具塞刻度試管中，先分別加蒸餾水 2.0，1.9，1.8，1.7，1.6，1.5，1.4 mL，搖勻，在冰水浴中緩慢滴加0.2%的蒽酮-硫酸溶液（精確稱取蒽酮0.2 g，溶于100 mL濃硫酸中即可） 8 mL，混勻，放冷后沸水浴10 min，取出立即置于冰水浴中冷卻10 min，取出。用分光光度計在波長582 nm處測定吸光度。

以吸光度（Y） 為縱坐標(biāo)，葡萄糖質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程：

1.4.3 樣品中多糖含量的測定

精確稱取在80℃下干燥至恒質(zhì)量的天麻粉末0.25 g，置于圓底燒瓶中，加入80%乙醇150 mL，進行1 h的回流提取，回流水浴溫度100℃，趁熱過濾，殘渣用80%熱乙醇洗滌3次，每次10 mL，將殘渣淹及濾紙置燒瓶中，加水150 mL，置沸水浴中加熱回流1 h，趁熱過濾，殘渣及燒瓶用熱水洗滌4次，每次10 mL，合并濾液與洗液，放冷，轉(zhuǎn)移至250 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，精密量取1 mL，置10 mL具塞干燥試管中，加蒸餾水1 mL，搖勻，再在冰浴中緩慢滴加0.2%蒽酮-硫酸溶液8 mL，混勻，放冷后置于沸水浴中加熱10 min，取出，立即置于冰水浴中冷卻10 min，用分光光度計在波長582 nm處測定吸光度。重復(fù)3組，取平均值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可求得樣品中多糖的含量。計算公式如下：

式中：C——有標(biāo)準(zhǔn)曲線上得到的多糖含量，μg/mL；

V總——提取液的總體積（250 mL）；

V測——測定時取用樣品的體積（1mL）；

n——稀釋倍數(shù)；

W——樣品質(zhì)量，g；

106——樣品質(zhì)量單位由g換算成μg。

2 響應(yīng)面設(shè)計與結(jié)果分析

2.1 響應(yīng)曲面優(yōu)化試驗設(shè)計及結(jié)果

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，考慮到試驗因素對含量的影響是曲線關(guān)系，故采用響應(yīng)面法尋找最佳工藝條件。根據(jù)響應(yīng)面Box-Behnken設(shè)計原理，選取料液比（A）、提取溫度（B）、提取時間（C）共3個對含量有影響的參數(shù)因子，以單因素試驗中最佳水平作為響應(yīng)面設(shè)計的0水平設(shè)計試驗方案，取得試驗結(jié)果后，采用三因子三水平的響應(yīng)面分析法，得到二次回歸方程，并找出最佳工藝參數(shù)。

Box-Behnken設(shè)計因素編碼水平見表1，Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

表1 Box-Behnken設(shè)計因素編碼水平

2.2 方差分析

模型整體方差分析表明，F(xiàn)值為42.421，p遠小于0.001，說明模型是成立的，有統(tǒng)計學(xué)意義。失擬合項方差分析表明，F(xiàn)值為2.091，p大于0.05，說明模型合理，無需擬合更高次項方程，不需要引入更多自變量。模型決定系數(shù)為0.982，調(diào)整決定系數(shù)為0.959，說明響應(yīng)值的變化98.2%來源于所選因素。變異系數(shù)（Coefficient Variability，CV%） 表示不同水平的處理組之間的變異程度，一般小于5%，該模型變異系數(shù)為2.42%，變異極小，說明模型的可信度高，試驗數(shù)據(jù)合理，可重復(fù)性好。信噪比（Adeq precision）是表示信號與噪聲的比例，通常希望該值大于4。該模型中信噪比值為16.23，說明了模型的充分性和合理性，模型具有足夠高的精確度，能準(zhǔn)確反映試驗結(jié)果。

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果

A2，B2，C2和料液比 （A）、提取時間 （C）、提取溫度（B）對含量影響在0.01水平顯著，BC，AB交互作用對含量影響在0.05水平顯著。說明A，B和C因素對含量影響主要是二次方效應(yīng)，A，B，C因素還存在線性效應(yīng)，因素間還存在交互效應(yīng)。

回歸方程模型的方差分析見表3，模型擬合分析見表4。

表3 回歸方程模型的方差分析

代碼方程為：

含量（%） =1.33+0.049A+0.046B+0.047C+0.045AB-0.013AC-0.047BC-0.17A2-0.13B2-0.073C2.

表4 模型擬合分析

2.3 因素總體效應(yīng)分析

試驗所選因素對含量影響存在二次方效應(yīng)、線性效應(yīng)和交互效應(yīng)。圖1顯示，A，B，C因素對含量的影響呈現(xiàn)曲線效應(yīng)，隨著因素水平的增加，響應(yīng)值呈現(xiàn)先快速上升后降低趨緩的趨勢，從3個因素波動圖的變化幅度和陡峭程度可見，A因素高于B因素，B因素高于C因素，總體上對含量的影響由高到低為A，B，C因素。

因素總體效應(yīng)分析波動圖見圖1。

圖1 因素總體效應(yīng)分析波動圖

2.4 不同因素間交互作用分析

響應(yīng)面分析圖是由響應(yīng)值和各試驗因子構(gòu)成的立體曲面圖，圖1中顯示了料液比、提取溫度、提取時間中任意1個因素取零水平時，其余2個因素對含量的影響。

響應(yīng)面圖坡度越大，該因素對含量的影響也越大，但2個因素存在交互作用時，一個因素在另一個因素的不同水平對含量的影響過程有差異。研究響應(yīng)面圖均呈現(xiàn)開口向下的鐘罩形，即隨著因素水平的增加，含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。

不同因素間交互作用分析見圖2。

2.4.1 A和B因素交互作用

由圖2（a）可知，A和B因素等高線呈現(xiàn)橢圓形，說明A和B因素存在交互作用，且A因素等高線密集程度高于B因素，表明A因素對含量的影響高于B因素。

A和B因素響應(yīng)面圖顯示，隨著A因素水平的增加含量增加，超過一定值（1∶7～1∶9） 時，含量開始下降，由于交互作用的存在，在B因素的不同水平，A因素水平的增加導(dǎo)致含量變化有差異：在B因素低水平時，隨著A因素的增加，含量快速上升后快速下降；在B因素高水平時，隨著A因素的增加，含量快速上升后緩慢下降。

圖2 不同因素間交互作用分析

由圖2（b）可知，隨著B因素的增加含量增加，超過一定值（39.5～41.5℃） 時，含量開始下降，由于交互作用的存在，在A因素的不同水平，B因素的增加導(dǎo)致含量變化有差異：在A因素低水平時，隨著B因素的增加，含量快速上升后快速下降；在A因素高水平時，隨著B因素水平的增加，含量快速上升后緩慢下降。

2.4.2 A和C因素交互作用

由圖2（c）可知，A和C因素等高線呈現(xiàn)圓形，說明A和C因素不存在交互作用，且A因素的等高線密集程度高于C因素，表明A因素對含量的影響高于C因素。

由圖2（d）可知，A和C因素響應(yīng)面圖顯示，隨著A因素水平的增加含量在增加，超過一定值（1∶7.5～1∶9）時，含量開始下降。隨著C因素的增加含量在增加，超過一定值（30～35 min）時，含量開始下降。

2.4.3 B和C因素交互作用

由圖2（e）可知，B和C因素等高線呈現(xiàn)橢圓形，說明B和C因素存在交互作用，且B因素的等高線密集程度高于C因素，表明B因素對含量的影響高于C因素。

B和C因素響應(yīng)面圖顯示，隨著B因素水平的增加含量在增加，超過一定值（39～42℃）時，含量開始下降，由于交互作用的存在，在C因素的不同水平，B因素水平的增加導(dǎo)致含量變化有差異：在C因素低水平時，隨著B因素的增加，含量快速上升后緩慢下降；在C因素高水平時，隨著B因素的增加，含量緩慢上升后緩慢下降。

由圖2（f）可知，隨著C因素的增加含量增加，超過一定值（30～35 min）時，含量開始下降，由于交互作用的存在，在B因素的不同水平，C因素的增加導(dǎo)致變化有差異，在B因素低水平時，隨著C因素的增加，含量快速上升后緩慢下降，在B因素高水平時，隨著C因素的增加，含量緩慢上升后緩慢下降。

2.5 理論最佳工藝參數(shù)

對擬合的二次方程以最大含量為目標(biāo)進行求解，得出最佳生產(chǎn)條件，當(dāng)A因素為1∶8.18，B因素為39.86℃，C因素為31.29 min時，含量達到最佳，理論預(yù)測值為14.968 8%。

2.6 最佳工藝條件驗證

根據(jù)理論最佳條件，結(jié)合實際情況，選取A因素1∶8.2，B因素40℃，C因素31.3 min時，試驗3次，測定含量平均值，結(jié)果為14.89%±0.83%，與理論預(yù)測值非常接近，誤差小于5%，證明該最佳工藝條件合理可行，在該工藝下含量最佳。

2.7 模型診斷

殘差概率正態(tài)圖見圖3，預(yù)測值與實際值散點圖見圖4。

殘差正態(tài)圖顯示，殘差緊緊圍繞對角線分布，滿足正態(tài)性，表明模型合理可用（圖3（a））。

圖3 殘差概率正態(tài)圖

2.8 實際值與預(yù)測值

預(yù)測值與實際值見表5。

表5 預(yù)測值與實際值

根據(jù)所建立的模型進行預(yù)測，結(jié)果可見預(yù)測值與實際值非常接近，模型合理可用。實際值和預(yù)測值散點均可見（圖3（b）），散點緊緊圍繞對角線分布，預(yù)測值與實際值擬合極好。

3 結(jié)論

雪峰山天麻多糖的最佳工藝為料液比1∶8.2，提取溫度40℃，提取時間31.3 min，在此條件下進行驗證試驗得到天麻多糖含量為14.89%。

天麻提取物富含天麻素，對羥基苯甲醇和多糖等諸多營養(yǎng)成分，可應(yīng)用到醫(yī)藥、食品、日用品等多個領(lǐng)域。作為準(zhǔn)藥食兩用的新資源食品，隨著消費者對消費認識的提高和對健康飲食的追求，天麻產(chǎn)業(yè)鏈將不斷延伸，天麻產(chǎn)業(yè)不再依賴于鮮天麻和初加工產(chǎn)品的銷售，而是轉(zhuǎn)向精深加工的產(chǎn)品開發(fā)，進而激活天麻市場潛能，延伸產(chǎn)業(yè)鏈，帶動民族藥食植物資源開發(fā)，促進地方經(jīng)濟發(fā)展。

圖4 預(yù)測值與實際值散點圖