池州野生黑靈芝多糖的提取及性質(zhì)研究

劉 靜，汪 雨，黃勁松，郭 軍

（1.安徽省宿州市食品藥品檢驗檢測中心，安徽宿州 234000；2.池州學院材料與化學工程系，安徽池州 247100）

靈芝是我國的寶貴中草藥文化遺產(chǎn)，含有多種活性成分，對靈芝活性成分研究不但可以提高我國中草藥利用價值，還可以發(fā)揚傳統(tǒng)優(yōu)秀文化在當代的價值[1-3]。靈芝多糖具有抗腫瘤作用，靈芝多糖可以通過促進白細胞介素Ⅱ的生成，通過促進單核巨噬細胞的吞噬功能，通過提升人體的造血能力尤其是白細胞的指標水平，以及通過其中某些有效成分對癌細胞起到抑制作用，成為抗腫瘤及癌癥輔助治療的優(yōu)選藥物[4-6]。研究結果表明，靈芝多糖的抗腫瘤活性可能與其對宿主機能的影響有關，且水溶性多糖也可能起著很重要的作用，并且靈芝多糖有其合適的分子量范圍，它的分子量越大，抗腫瘤活性越強[7-9]。此外，靈芝多糖具有一定的免疫調(diào)節(jié)功能，經(jīng)腹腔注射或經(jīng)口服靈芝多糖，能增強對蛋白質(zhì)抗原延遲超過敏化[10]。靈芝多糖能促進T淋巴細胞的轉(zhuǎn)化而增強細胞免疫力；促進淋巴細胞的形成反應，從而增強體液免疫力；增強淋巴細胞內(nèi)DNA聚合酶的活性，促進細胞的增殖、分裂，導致白細胞介素的合成和分泌，從而恢復因衰老而導致的免疫力下降。再次，靈芝多糖有保護心腦血管的功能[11-12]。研究結果表明，靈芝多糖有明顯的強心降壓作用，對動脈粥樣硬化有預防和治療作用；其降低血糖原理可能是由于血漿胰島素水平被提高，使葡萄糖的代謝速度加快，外周組織和肝的葡萄糖利用也加快，從而達到血糖降低的作用。還有研究表明，靈芝多糖可有效地擴張冠狀動脈，增加冠脈血的流量，改善心肌微循環(huán)，加強心肌氧和能量的供給，可明顯使血膽固醇、甘油三酯和脂蛋白降低，可以防止動脈粥樣硬化斑塊的形成[13-16]。

靈芝多糖能促進血清、肝臟和骨髓的核酸及蛋白質(zhì)的生物合成，因此可以有效地抗病毒；靈芝多糖可顯著提高SOD活性，有效清除機體產(chǎn)生的自由基，從而阻止自由基對機體的損傷，防止機體的過氧化，保護了細胞組織，延緩了細胞衰老。靈芝多糖能顯著促進細胞核內(nèi)DNA合成能力，并可增加細胞的分裂代數(shù)[17-19]。這些作用都能延緩機體的衰老，所以，靈芝多糖的抗衰老功能十分強大。除了具有上述保健功能外，還有其他的藥用效果，如平緩咳嗽、化痰止咳，緩解支氣管哮喘癥狀、慢性支氣管炎?？墒惯^敏反應介質(zhì)的釋放被阻斷，使過敏反應減輕；對于中樞神經(jīng)系統(tǒng)有較強的調(diào)節(jié)作用，可以安神補腦，保證良好的睡眠質(zhì)量；可以使其他降壓藥物的效果更延長和穩(wěn)定。靈芝多糖還可以保持和調(diào)節(jié)皮膚水分，恢復和保持皮膚彈性，使皮膚中黑色素的形成和沉淀的速度延緩[20]。

池州黑靈芝產(chǎn)于皖南山區(qū)，應用為保健食品已有2 000多年的傳統(tǒng)，但是目前利用現(xiàn)代科學研究方法對其進行研究較少，從提取、結構等方面進行初步研究。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

乙醇、苯酚、硫酸、葡萄糖、乙醚、石油醚、正丁醇、氯仿，以上試劑均為分析純，國藥集團上海試劑公司提供。

R201D型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海廣英儀器有限公司產(chǎn)品；WD750B型微波爐，順德市格蘭仕電器實業(yè)有限公司產(chǎn)品；Delta-320型pH計，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司產(chǎn)品；BSZ-100A型分部收集器、HL-1B型恒流泵，上海滬西分析儀器廠產(chǎn)品；SYC-15型恒溫水浴鍋，河北潤聯(lián)科技有限公司產(chǎn)品；WK-150A型超微粉碎機，濟南達威機械有限公司產(chǎn)品；FTIR 8700型傅里葉變換紅外光譜儀，美國Thermo Nicolet公司產(chǎn)品。

1.2 試驗步驟

1.2.1 靈芝多糖的脫蛋白

采用Sevage法脫除蛋白。稱取少量靈芝粉樣品加少量水溶液（大約有10 mL），取樣品液10 mL，加入氯仿-正丁醇（預先配成一定體積比的混合液比例為1∶4）2.5 mL，置于萃取裝置中，充分振蕩，取上層清液。反復脫蛋白3次效果最佳。

1.2.2 靈芝多糖的透析

（1）透析袋的處理。將透析袋放在裝有50%的乙醇的熱水中煮1 h，在蒸餾水中潤洗。

（2）透析處理。將脫蛋白后的多糖液裝入透析袋內(nèi)，用夾子封口，然后將透析袋放入裝有大量蒸餾水的大容器中，透析2～3 d，乙醇沉淀、離心、低溫干燥，得到靈芝多糖。

1.2.3 靈芝多糖提取率的測定

采用分光光度法進行測定。多糖類成分在硫酸作用下，首先水解成單糖，同時迅速脫水生成糖醛衍生物，然后與苯酚縮合成有色化合物，490 nm處有最大吸收波長[12]。

精密稱取葡萄糖20 mg，定容于400 mL容量瓶中，配置成50 μg/mL。取上述溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mL分別于6支試管中，加蒸餾水至2.0 mL，加入1.0 mL，15%苯酚溶液（苯酚與蒸餾水的比例為15∶85），搖勻后迅速加入5.0 mL濃硫酸，搖勻后靜置10 min，置沸水浴中加熱15 min，迅速冷卻至室溫，以蒸餾水的反應液作空白，于波長490 nm處比色測定A值。以A490為橫坐標，對應的糖量值為縱坐標做標準曲線。使用最小乘法做線性回歸，得到吸光度（A）與葡萄糖質(zhì)量濃度（C） 的曲線。靈芝多糖提取率按以下公式計算：

稱取靈芝多糖5.0 mg，加熱水溶解后定容至100.0 mL，取2.0 mL按上述方法測定A490，查標準曲線，計算結果。

1.2.4 靈芝多糖的測定

粉碎50 g靈芝，由于靈芝多糖易溶于熱水中，因此采用熱水提取法。對于靈芝多糖的提取工藝，主要從以下4個因素來考慮對提取率的影響，為正交試驗設計的水平提供有意義的取值范圍。

（1）溫度對靈芝多糖提取率的影響。稱取1 g靈芝粉5份，加入30 mL水，置于溫度不同的水浴鍋中，控制溫度分別為50，60，70，80，90℃，浸提30 min，過濾，濾液離心，苯酚-硫酸法測定靈芝多糖質(zhì)量濃度，計算提取率。

（2）料液比對靈芝多糖提取率的影響。稱取1 g靈芝粉5份，分別加入水15，20，25，30，35 mL置于80℃的水浴中，浸提30 min，過濾，濾液離心，計算提取率。利用苯酚-硫酸法測定靈芝多糖質(zhì)量濃度。

（3）提取時間對靈芝多糖提取率的影響。稱取1 g靈芝粉5份，加入30 mL水，控制溫度80℃，分別浸提20，25，30，35，40 min，抽濾，濾液經(jīng)離心后用苯酚-硫酸法測定靈芝多糖質(zhì)量濃度，計算提取率。

（4）提取次數(shù)對靈芝多糖提取率的影響。稱取1 g靈芝粉5份，加入30 mL水，控制溫度80℃，分別提取1，2，3，4，5次，每次30 min，合并提取液，濾液離心，計算提取率。

2 結果與分析

2.1 提取溫度對靈芝多糖提取率的影響

圖1 提取溫度對靈芝多糖提取率的影響

提取溫度對靈芝多糖提取率的影響見圖1。

由圖1可知，伴隨提取溫度的升高，多糖的提取率漸漸升高，這表明溫度越高對靈芝細胞的破壞作用越大，有利于多糖的浸出。由圖1可知，提取溫度為80℃時，靈芝多糖的提取率最高，因此最適宜提取溫度為80℃。

2.2 料液比對靈芝多糖提取率的影響

料液比對靈芝多糖提取率的影響見圖2。

圖2 料液比對靈芝多糖提取率的影響

隨著料液比的增加，多糖提取率逐漸降低，料液比為1∶20，1∶25時，多糖提取率都為最大。而容積體積的增加會延長濃縮時間，能量消耗較大，生產(chǎn)成本增加，所以料液比為1∶20較好。

2.3 提取次數(shù)對靈芝多糖提取率的影響

提取次數(shù)對靈芝多糖提取率的影響見圖3。

圖3 提取次數(shù)對靈芝多糖提取率的影響

由圖3可知，提取次數(shù)對靈芝多糖提取率的影響也較為突顯。當提取次數(shù)1～3次時，多糖提取率增加較快；3～5次時，多糖提取率上升相當遲緩。此外，提取次數(shù)較多時，提取液較稀，濃縮過程能耗大。所以，提取次數(shù)選3次為宜，是從節(jié)約成本和提高效率的方面考慮的結果。

2.4 提取時間對靈芝多糖提取率的影響

提取時間對靈芝多糖提取率的影響見圖4。

圖4 提取時間對靈芝多糖提取率的影響

由圖4可知，靈芝多糖提取率隨著浸提時間的增加而逐漸增加，30 min后，提取率減少，而隨著時間的延長，生產(chǎn)時間也相應延長，生產(chǎn)成本會增加，因此浸提時間為30 min。

2.5 水提法提取靈芝多糖的正交優(yōu)化

因素與水平設計見表1。

表1 因素與水平設計

通過單因素試驗，利用三水平三因素正交L9（34）試驗對工藝進行了優(yōu)化。

靈芝多糖提取正交設計見表2。

表2 靈芝多糖提取正交設計

按正交試驗設計，共進行9次提取，各個因素影響靈芝多糖提取率的排列順序為C＞B＞A，最佳的提取條件為C2B3A2，即提取溫度80℃，提取時間35 min，料液比1∶20，靈芝多糖的提取率可達到5.45 mg/g。提取溫度為80℃時，水分子運動劇烈，使靈芝多糖運動加快，靈芝細胞膨脹，細胞壁對多糖的束縛力減弱，多糖在胞內(nèi)和胞外的滲透壓差變大，溶液內(nèi)外濃度平衡較快。提取時間低于35 min時，胞內(nèi)外多糖沒達到平衡；提取時間大于35 min時，較高的溫度將破壞多糖，引起多糖降解。料液比大于1∶20時，溶液過稀，給后續(xù)濃縮帶來困難；料液比小于1∶20時，胞內(nèi)多糖浸出較困難。

2.6 紅外光譜圖鑒定

靈芝多糖的紅外光譜圖見圖5。

圖5 靈芝多糖的紅外光譜圖

由圖5可知，在波長3 000～3 800 cm-1處出現(xiàn)一個較寬的糖分子內(nèi)部或分子之間氫鍵O-H伸縮振動引起的峰[13]，2 950 cm-1處的吸收是亞甲基（-CH2）的C-H伸縮振動峰，1 637cm-1處應為-CHO的C=O伸縮振動引起的吸收峰，而1 390 cm-1處的尖銳峰可能為C-H變角振動，與2 950 cm-1處的吸收振動峰構成了糖類的特征吸收峰[14]。1 130 cm-1處的吸收峰可能為糖環(huán)的特征吸收峰，是由多糖中鏈接單糖的C-O糖苷鍵振動引起[15]。此光譜圖表明所得產(chǎn)品是多糖。

3 結論

通過正交優(yōu)化試驗確定靈芝多糖的最佳工藝提取條件為提取溫度80℃，提取時間35 min，料液比1∶20，提取次數(shù)3次，靈芝多糖產(chǎn)率可達到5.45 mg/g。在這些條件之中溫度的改變對多糖提取率的影響相對較大，其次是提取時間、料液比。目前，此方法僅限于實驗室提取靈芝多糖，對其在體內(nèi)的代謝及對細胞修復方面需進一步深入研究。