ATP1通過調節(jié)氧化應激促進白念珠菌逃逸巨噬細胞殺傷的研究

呂妍 張艷麗 張展鵬 趙亞婧 張藝山 李水秀 張宏

暨南大學附屬第一醫(yī)院皮膚科 暨南大學附屬第一醫(yī)院真菌病研究所，廣州510632

白念珠菌是人類正常菌群，也是致死性真菌感染重要病原體，侵襲性白念珠菌感染即使接受抗真菌藥物治療，病死率仍接近40%［1-2］。是否能夠適應宿主微環(huán)境是白念珠菌能否存活并產生致病性的關鍵。在感染過程中，白念珠菌會遇到宿主各種環(huán)境壓力，如固有免疫細胞（巨噬細胞、樹突細胞或中性粒細胞等）爆發(fā)性產生活性氧［如過氧化氫（H2O2）、羥自由基、超氧化物離子］，專門誘導氧化應激反應以殺滅入侵的菌體［3］。為此，白念珠菌進化出多種快速適應機制以有效應對宿主免疫細胞內氧化應激等反應，從而逃逸宿主殺滅。

線粒體復合物V（F1Fo-ATP 合酶）是線粒體氧化磷酸化過程的終端酶和關鍵酶。研究顯示，F(xiàn)1Fo-ATP 合酶在沙門菌對抗吞噬細胞的殺傷中起促進作用［4］。前期我們已報道F1Fo-ATP 合酶α 亞基編碼基因ATP1 是白念珠菌致病的關鍵基因，其缺失后白念珠菌對小鼠完全不具致死性［5］。那么，ATP1是否會影響菌體與宿主相互作用而致病呢？宿主吞噬細胞是系統(tǒng)性真菌感染的第一道中心屏障［6-7］，巨噬細胞是最重要的吞噬細胞之一［8］，而且組織中巨噬細胞又是抗真菌的關鍵效應細胞［7］。因此，我們擬以前期發(fā)現(xiàn)為基礎，探索ATP1促進白念珠菌逃逸巨噬細胞殺傷以及氧化應激的機制，為進一步確認ATP1編碼的蛋白Atp1p是否為藥物新靶點提供扎實的基礎。

材料與方法

一、材料

（一）菌株、細胞株、實驗動物

白念珠菌親本株SC5314 由普林斯頓大學Amanda M.Gillum教授惠贈；ATP1缺失株由課題組前期首先構建［5］，與親本株相比，ATP1缺失株缺少ATP1基因，且毒力因子等表型降低，氧化磷酸化功能受抑制。實驗菌株保存于-80 ℃甘油中，實驗前將受試菌株連續(xù)2 次轉種于酵母浸出粉胨葡萄糖（YPD）固體培養(yǎng)基中30 ℃培養(yǎng)，以保證菌株的活力和純度。小鼠巨噬細胞RAW264.7（ATCC）產自上海蓋寧生物科技有限公司。45 只SPF 級健康純系雌性BALB/c 小鼠（動物質量合格證編號44002100017582），5 ～6 周齡，體重18 ～22 g，來自廣東省實驗動物中心，分為3 組，分籠飼養(yǎng)（每籠3 只），所有動物均于暨南大學醫(yī)學院中心實驗室動物室（動物實驗許可證號20180824-06）在20 ℃～24 ℃、光/暗周期12 h/12 h的環(huán)境中飼養(yǎng)。

（二）主要試劑和儀器

酵母提取粉、蛋白胨、瓊脂粉（美國BD 公司），RAW264.7 細胞專用培養(yǎng)基（武漢普諾賽生命科技有限公司），乳酸脫氫酶（LDH）實驗試劑盒（英國Abcam 公司），2′，7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFHDA，美國Sigma 公司），SYBR primer Ex Taq 擴增體系（日本Takara公司），細胞計數(shù)儀（美國Amersham公司），實時熒光定量PCR 儀（美國Perkin Elmer 公司），多功能酶標儀（美國Thermo Scientific公司），流式細胞儀（美國Becton Dickinson 公司），NanoDrop 2000c分光光度計（美國Thermo Scientific公司）。

二、方法

（一）白念珠菌體內和體外細胞活性測定

1.體外細胞活性：收集對數(shù)生長期白念珠菌液，用滅菌磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3 次。用YPD液體培養(yǎng)基重懸菌體并調整至1.0×106細胞/ml，于30 ℃、150 r/min振搖培養(yǎng)。于第1、2、3、4、5天吸取菌液，連續(xù)10倍倍比稀釋5個濃度梯度，吸取各濃度菌液100 μl點樣至YPD固體培養(yǎng)基上，晾干，于30 ℃靜置培養(yǎng)48 h，計數(shù)菌落數(shù)量［9］。實驗重復3次。

2. 體內細胞活性：收集對數(shù)生長期白念珠菌液，生理氯化鈉溶液洗滌菌體3 次，并調整親本株和ATP1 缺 失 株 分 別 至1.0 × 106細 胞/ml 和1.0 ×107細胞/ml。將小鼠隨機分為親本株組、ATP1缺失組和陰性對照組，每組3只，按照分組分別將菌液尾靜脈注射，親本株組和ATP1 缺失組小鼠每只分別接種親本株菌液0.1 ml（1.0×105細胞）和ATP1缺失株菌液0.1 ml（1.0×106細胞），陰性對照組注射生理氯化鈉溶液0.1 ml。分別于感染后第1、2、3、4、5天取出小鼠的腎，稱重并研磨，10 倍系列稀釋后取0.1 ml接種于YPD固體培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)，48 h后計數(shù)菌落數(shù)量［10］。實驗重復3次。

（二）菌體與巨噬細胞相互作用實驗

1.白念珠菌存活率實驗：將小鼠巨噬細胞RAW264.7 傳代1 d 后收集，調整細胞為1.0 ×105個/ml 加入96 孔板，每孔100 μl ，置培養(yǎng)箱過夜。向含有巨噬細胞的96孔板中每孔分別加入白念珠菌親本株菌液或ATP1 缺失株菌液100 μl［感染復數(shù)（MOI）5∶1］，置于培養(yǎng)箱37 ℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)24 h，吹打混勻后吸取上述菌液倍比稀釋后接種于YPD 固體培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)48 h，計算白念珠菌單菌落數(shù)。白念珠菌存活率=含巨噬細胞孔的白念珠菌菌落數(shù)/不含巨噬細胞孔的白念珠菌菌落數(shù)×100%［11］。實驗重復3次。

2.巨噬細胞損傷率實驗：巨噬細胞處理同上，分為實驗組和陽性對照組，實驗組中分別加入白念珠菌親本株菌液或ATP1 缺失株菌液100 μl（MOI 5∶1），置于培養(yǎng)箱（37 ℃、5%CO2）培養(yǎng)4 h；陽性對照組加入15 μl 裂解液，置于培養(yǎng)箱37 ℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)45 min。處理完成后，將上清液分別轉至新的96 孔板中，加入等量細胞裂解液CytoTox96試劑，避光30 min。加終止液，檢測A490 值，計算LDH釋放百分比［11］。實驗重復3次。

（三）H2O2對菌體細胞活性的影響

1.點板實驗：收集對數(shù)生長期白念珠菌菌液，PBS重懸菌體并調整白念珠菌至1.0×106細胞/ml，連續(xù)10 倍倍比稀釋5 個濃度梯度。吸取各濃度菌液5 μl點樣至含H2O2（6 mmol/l）的YPD固體培養(yǎng)基上，將平板晾干，于30 ℃靜置培養(yǎng)48 h，觀察菌落生成狀態(tài)并拍照［12］。實驗重復3次。

2.H2O2對菌體的殺死率：收集對數(shù)生長期白念珠菌液，用YPD 液體培養(yǎng)基重懸并調整新鮮白念珠菌菌體至1.0 × 106細胞/ml，分為實驗組和對照組，將100 ml 實驗組白念珠菌液和68 μl 30%H2O2溶液（終濃度為6 mmol/L）加入250 ml 的玻璃錐形瓶里，對照組僅將白念珠菌液加入玻璃錐形瓶中，于30 ℃、150 r/min 振搖培養(yǎng)6、12、24 h 后吸取菌液，連續(xù)10 倍倍比稀釋5 個濃度梯度，吸取各濃度菌液100 μl 點樣至YPD 固體培養(yǎng)基上，晾干，于30 ℃靜置培養(yǎng)48 h，計數(shù)菌落數(shù)量，H2O2對菌體的殺死率=（1-含H2O2的白念珠菌菌落數(shù)/不含H2O2的白念珠菌菌落數(shù)）×100%［12］。實驗重復3次。

（四）白念珠菌細胞內活性氧水平測定

采用DCFH-DA 染色測定。巨噬細胞處理同上，向含有巨噬細胞的96 孔板中分別加入白念珠菌親本株菌液或ATP1 缺失株菌液100 μl（MOI 5∶1），置于培養(yǎng)箱（37 ℃、5% CO2）中培養(yǎng)1 h。收集菌體，用PBS洗滌菌體3次。采用流式細胞儀測定熒光值（激發(fā)光：595 nm；發(fā)射光：488 nm）。

此外，用YPD 液體培養(yǎng)基調整白念珠菌至1.0×107細胞/ml，加入H2O2（終濃度為1.6 mmol/L）后，于30 ℃、150 r/min振搖培養(yǎng)6 h。離心收集菌體，用滅菌PBS洗3次，并用PBS調整至1.0×107細胞/ml。加入DCFH-DA 染色液（終濃度為20 mg/L），37 ℃靜止避光培養(yǎng)20 min。離心收集菌體，用PBS 洗滌菌體3次。采用流式細胞儀測定熒光值（激發(fā)光：595 nm；發(fā)射光：488 nm）［12］。實驗重復3次。

（五）實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測過氧化氫酶1（CAT1）基因、超氧化物歧化酶4（SOD4）基因和超氧化物歧化酶5（SOD5）基因mRNA水平

收集對數(shù)生長期白念珠菌液，用YPD 液體培養(yǎng)基調整至2.0 × 106細胞/ml，加入H2O2（終濃度為1.6 mmol/L）后，于30 ℃，150 r/min 振搖培養(yǎng)6 h。離心收集菌體，參照文獻［13］提取白念珠菌RNA。用NanoDrop 2000c 分光光度計測RNA 濃度并用Thermo Scientific 反轉錄試劑盒進行反轉錄。以2 μl cDNA 為模板，加入SYBR primer Ex Taq 10 μl，正反向引物各0.5 μl，雙蒸水7 μl，RT-qPCR擴增（95 ℃變性10 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸15 s，共40 個循環(huán)）。由系統(tǒng)軟件（Bio-Rad）監(jiān)測并計算Ct值，應用2-△△Ct法計算基因mRNA表達水平［13］。實驗重復3次。

（六）統(tǒng)計學方法

采用SPSS13.0 和Graphpad Prism 6.0 軟件進行統(tǒng)計分析、繪圖。采用重復測量設計的方差分析統(tǒng)計白念珠菌體內外細胞活性；采用重復測量設計的方差分析和Student t檢驗分析H2O2對菌體細胞活性的影響；采用Student t檢驗分析菌體與巨噬細胞相互作用；采用雙因素方差分析統(tǒng)計實時熒光定量PCR的結果。P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

圖1 ATP1對白念珠菌體外和體內細胞活性的影響 1A：在YPD液體培養(yǎng)基中的細胞活性；1B：白念珠菌尾靜脈接種小鼠后腎臟載菌量。CFU：菌落形成單位

結 果

一、ATP1 缺失后白念珠菌體外和體內細胞活性降低

對白念珠菌在體外形成菌落數(shù)進行重復測量設計方差分析，結果顯示，時間效應有統(tǒng)計學意義（F=1 277.80，P=0.021）；時間與處理交互效應也有統(tǒng)計學意義（F=612.81，P=0.030）；菌落數(shù)隨時間呈線性增長（F=138.46，P ＜0.001），親本株組和ATP1 缺失組隨時間變化趨勢不同（F = 90.12，P =0.001）；ATP1缺失組在體外培養(yǎng)第3天菌落數(shù)約是親本株組的10%（F=481.84，P ＜0.001）（圖1A）。

對小鼠每個時間點腎臟組織形成菌落數(shù)進行統(tǒng)計分析，結果顯示，小鼠腎臟組織形成菌落數(shù)隨時間變化（F=538.10，P=0.032）；親本株組和ATP1缺失組比較，腎臟組織形成菌落數(shù)隨時間變化的趨勢不同（F=609.41，P=0.030）；親本株組腎臟組織形成菌落數(shù)隨時間呈線性增加趨勢，但ATP1 缺失組隨時間呈線性減少趨勢（F=11.79，P=0.026）；兩組間腎臟組織形成菌落數(shù)不同，ATP1缺失組顯著低于親本株組（F=78.27，P=0.001）（圖1B）。

二、ATP1 缺失后白念珠菌與巨噬細胞相互作用減弱

存活率實驗結果顯示，白念珠菌細胞與小鼠巨噬細胞共培養(yǎng)后，ATP1 缺失組菌體存活率為（62.67 ± 3.51）%，親本株組為（82.33 ± 2.52）%，兩組差異有統(tǒng)計學意義（t=7.88，P=0.001）。損傷率實驗顯示，與ATP1 缺失組共培養(yǎng)的巨噬細胞LDH釋放百分比為（27.80±3.54）%，與親本株組共培養(yǎng)的巨噬細胞為（87.78±0.17）%，兩者差異有統(tǒng)計學意義（t=33.89，P ＜0.001）。

三、ATP1缺失后白念珠菌對H2O2敏感性增強

點板實驗結果顯示，在YPD 固體培養(yǎng)基中，ATP1 缺失株與親本株生長無明顯差異；在含H2O2的YPD 固體培養(yǎng)基中，親本株生長與在YPD 中比較無明顯差異，而ATP1 缺失株明顯受抑制（圖2A）。

重復測量設計的方差分析顯示，白念珠菌細胞活性在H2O2作用下隨時間顯著變化（F = 18.85，P=0.02）；時間與處理交互效應無統(tǒng)計學意義（F=7.29，P = 0.07）；白念珠菌細胞活性隨時間呈線性減少趨勢（F=40.60，P=0.003），ATP1缺失株細胞活性隨時間減少趨勢比親本株更明顯（F=12.63，P=0.024）；兩組間細胞活性不同，ATP1 缺失組顯著低于親本株組（F=3 440.65，P ＜0.001）。另外，采用非配對t檢驗分別對每個時間點的細胞活性進行分析，發(fā)現(xiàn)ATP1 缺失組H2O2的殺菌率均明顯高于親本株組，差異有統(tǒng)計學意義（6 h：t=7.100，P=0.002；12 h：t = 10.830，P = 0.001；24 h：t = 16.400，P=0.001）（圖2B）。

四、ATP1缺失株細胞內活性氧水平升高

析因設計的方差分析顯示，與巨噬細胞共培養(yǎng)后白念珠菌細胞內活性氧水平高于單獨白念珠菌培養(yǎng)（F1，8=32.44，P ＜0.001）；ATP1 缺失組細胞內活性氧水平高于親本株組（F1，8=7.84，P=0.023）；此外，巨噬細胞對白念珠菌細胞內活性氧水平的影響與ATP1基因有關（F1，8=9.23，P=0.016）。

圖2 ATP1 缺失對白念珠菌對H2O2敏感性的影響 2A：白念珠菌在不含或含H2O2的YPD 固體培養(yǎng)基上生長情況 自左向右各孔白念珠菌菌液濃度分別為105、104、103、102、10 個細胞/ml；2B：YPD 液體培養(yǎng)基中H2O2對白念珠菌殺死率隨時間變化情況。兩組間比較，a：P＜0.01；b：P＜0.001

此外，在通過H2O2建立的模擬巨噬細胞內氧化應激模型中，H2O2組白念珠菌細胞內活性氧水平比未用H2O2組高（F1，8=154.5，P ＜0.001）；ATP1 缺失組也比親本株組高（F1，8=85.62，P ＜0.001）。此外，H2O2對白念珠菌細胞內活性氧水平的影響與ATP1基因有關（F1，8=82.02，P ＜0.001）。

五、ATP1 缺失株細胞氧化應激和活性氧清除相關基因的mRNA表達水平降低

見表1。析因設計的方差分析顯示，H2O2作用于白念珠菌后H2O2酶基因CAT1 mRNA 水平高于未用藥組（F1，8= 114.80，P ＜0.001）；ATP1 缺失組CAT1 mRNA 水平低于親本株（F1，8= 287.10，P ＜0.001）；H2O2對白念珠菌CAT1 mRNA 水平的影響與ATP1 基因有關（F1，8=41.54，P ＜0.001）。此外，H2O2作用于白念珠菌后超氧化物歧化酶基因SOD4和SOD5 mRNA 水平均高于未用藥組（F1，8=11.00，P = 0.011；F1，8= 1 033.00，P ＜0.001），ATP1 缺失組均低于親本株組（F1，8= 12.80，P = 0.008；F1，8=1 398.00，P ＜0.001），H2O2對白念珠菌SOD4 和SOD5 mRNA 水平的影響與ATP1 基因有關（F1，8=12.36，P=0.008；F1，8=1 155.00，P ＜0.001）。

討 論

前期我們發(fā)現(xiàn)，ATP1 缺失后高劑量（1.0×106細胞）白念珠菌對小鼠完全不致死［5］，雖然ATP1缺失株在體外細胞活性比親本株降低大約10 倍，但其對小鼠不致死的機制不能簡單地用ATP1缺失后白念珠菌生長缺陷解釋。為此，我們通過尾靜脈接種中劑量（1.0×105細胞）親本株和10 倍于親本株劑量（1.0×106細胞）的ATP1 缺失株菌體到小鼠體內，發(fā)現(xiàn)接種親本株的小鼠于18 d 時全部死亡，而接種10 倍于該劑量的ATP1 缺失株菌體小鼠90 d時全部存活，而且一般狀態(tài)、生命體征與接種生理氯化鈉溶液組小鼠無明顯差異［5］。提示ATP1缺失后白念珠菌對小鼠完全不致死不能完全歸因于生長缺陷。為了進一步驗證該結論，我們進一步觀察中劑量親本株和10 倍于其劑量的ATP1 缺失株菌體在小鼠體內的細胞活性。結果顯示，親本株組腎臟組織形成菌落數(shù)隨時間呈線性增加趨勢，而ATP1缺失組腎臟組織形成菌落數(shù)隨時間呈線性減少趨勢，甚至在接種第3天時檢測不到菌體。提示ATP1缺失后白念珠菌對小鼠完全不致死與其被清除有關。前期病理檢測結果顯示，ATP1 缺失株對小鼠組織不產生損害，進一步驗證了該推論。

表1 ATP1對白念珠菌CAT1和SOD4、SOD5基因mRNA水平的影響（±s）

表1 ATP1對白念珠菌CAT1和SOD4、SOD5基因mRNA水平的影響（±s）

注：CAT1，過氧化氫酶1；SOD4，超氧化物歧化酶4；SOD5，超氧化物歧化酶5

組別n 33 CAT1 H2O2（-）1 0.20±0.02 H2O2（+）2.31±0.23 0.53±0.13 SOD4 H2O2（-）1 1.04±0.18 H2O2（+）8.06±3.57 0.84±0.19親本株組ATP1缺失組SOD5 H2O2（-）1 0.67±0.06 H2O2（+）7.40±0.31 0.49±0.11

當病原體侵入機體后，以巨噬細胞為代表的吞噬細胞立即響應，識別、吞噬病原體并調動還原型輔酶Ⅱ氧化酶體和線粒體向吞噬泡內釋放大量活性氧以實現(xiàn)對病原體的殺滅和清除。那么，ATP1缺失株是否未能逃逸免疫細胞殺傷而被宿主清除？為了驗證該假設，我們在體外將菌體與巨噬細胞共培養(yǎng)，進一步檢測菌體細胞活性以及巨噬細胞LDH水平，結果顯示，ATP1缺失后菌體存活率及其對巨噬細胞損傷均明顯降低。說明ATP1在白念珠菌逃逸巨噬細胞殺傷中起促進作用。

嚴重的氧化應激是真菌病原體吞噬過程中的主要免疫防御反應［3，14］，那么ATP1是否通過介導氧化應激以逃逸巨噬細胞殺傷呢？通過點板實驗和測定白念珠菌在模擬巨噬細胞內氧化應激模型下細胞活性，我們發(fā)現(xiàn)，ATP1缺失后白念珠菌對H2O2敏感性增強。此外，我們通過化學發(fā)光測定白念珠菌在H2O2作用下細胞內活性氧水平，發(fā)現(xiàn)ATP1 缺失后白念珠菌清除活性氧能力顯著降低。上述結果均提示，ATP1 在白念珠菌中抵抗氧化應激和清除活性氧的功能。

活性氧累積增加不能簡單地用ATP1缺失后白念珠菌形態(tài)轉換缺陷解釋。Lopes da Rosa等［15］研究發(fā)現(xiàn)，Rtt109缺失后菌株雖然形態(tài)轉換缺陷，但活性氧累積無差異。在感染過程中，免疫細胞爆發(fā)性產生活性氧來殺滅入侵病原體，白念珠菌通過上調吞噬細胞內H2O2酶和活性氧解毒酶——超氧化物歧化酶來對抵抗這種攻擊［3］。我們推測，ATP1缺失后菌體抵抗氧化應激和清除活性氧降低的表型極有可能歸因于下調H2O2酶和超氧化物歧化酶編碼基因。RT-qPCR數(shù)據(jù)驗證了該推測，ATP1缺失后白念珠菌H2O2酶和超氧化物歧化酶基因表達降低。

總之，本研究表明ATP1 缺失后分別通過下調氧化應激和活性氧清除相關基因表達使白念珠菌抵抗氧化應激和清除活性氧能力明顯減弱，從而不能逃逸巨噬細胞監(jiān)督而被宿主清除。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突