廣金錢草多糖指紋圖譜的建立、含量測定及其對α-葡萄糖苷酶的抑制活性研究

程軒軒 陳亮元 鄭詩嘉 唐曉敏 楊全

中圖分類號R284.1

文獻標(biāo)志碼A

文章編號1001-0408（2020）02-0183-07

DOI

10.6039/j .issn.1001-0408.2 02 0.02.11

摘要 目的：建立廣金錢草多糖的指紋圖譜，分析其單糖組成及含量，并考察廣金錢草多糖對α一葡萄糖苷酶的體外抑制作用。方法：采用水提醇沉法提取廣金錢草多糖，經(jīng)三氟乙酸水解、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生化后，采用高效液相色譜法（HPIC）建立指紋圖譜（以葡萄糖峰為參照），并進行單糖組成及含量分析。含量測定色譜柱為Phenomenex LunaC18，流動相為乙腈-0.05mol/L磷酸二氫鉀溶液（用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至6.8），梯度洗脫，流速為0.8 mL/min，檢測波長為250 nm，柱溫為30℃，進樣量為10μL。以阿卡波糖為對照，采用對硝基苯-a-D-葡萄糖吡喃苷法考察廣金錢草多糖對α一葡萄糖苷酶的體外抑制活性。結(jié)果：18批藥材樣品的HPLC指紋圖譜有9個共有峰，其中15批藥材樣品的相似度大于0.90;共指認(rèn)甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖等7個共有峰。其中，鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖的含量分別為0.471- 2.092、1.379-8.919、2.560-35.679、1.194- 6.905、0.566-4.158 mg/g;以鼠李糖為基準(zhǔn)，其余4種單糖的摩爾比分別為1.58-4.07、2.26-19.95、2.20-4.21、1.31-2.86。廣金錢草多糖對α一葡萄糖苷酶的抑制活性呈現(xiàn)隨劑量升高而增強的趨勢，其半數(shù)抑制濃度為0.70 mg/mL，低于陽性對照阿卡波糖（7.76 mg/mL）。結(jié)論：不同批次廣金錢草的多糖組成均以葡萄糖為主，各單糖含量有所差異。廣金錢草多糖對α一葡萄糖苷酶具有明顯的體外抑制作用，且活性強于阿卡波糖。

關(guān)鍵詞 廣金錢草多糖;單糖;含量;指紋圖譜;高效液相色譜法;α一葡萄糖苷酶;抑制活性步研究證實。

廣金錢草為豆科植物廣金錢草[Desmodium styraci-folium （Osb.） Merr.]的干燥地上部分，味甘、淡，性涼，歸肝、腎、膀胱經(jīng)，具有利濕退黃、利尿通淋之效，主治黃疸尿赤、熱淋、石淋、小便澀痛等癥[1]。廣金錢草中的黃酮類成分因具有利尿、抗氧化、抑制大鼠腎結(jié)石形成、改善大鼠離體心臟缺血再灌注損傷等廣泛的藥理活性，是評價藥材質(zhì)量的指標(biāo)性成分，備受學(xué)者關(guān)注[2-5]。除黃酮類成分外，多糖在廣金錢草中的含量也較高，但其相關(guān)藥理學(xué)研究較少。考慮到植物多糖在抗腫瘤[6]、抗衰老[7]、免疫調(diào)節(jié)[8]、降血脂[9]等方面獨特的生物活性，開發(fā)前景良好，故本研究擬從廣金錢草藥材中提取多糖，采用1一苯基一3一甲基-5一吡唑啉酮（PMP）柱前衍生化一高效液相色譜法（HPIC）分析其單糖組成，并建立不同產(chǎn)地廣金錢草多糖的指紋圖譜;在測定多糖含量的基礎(chǔ)上，初步評價其對α一葡萄糖苷酶的抑制作用，旨在為全面開發(fā)利用該藥材資源提供依據(jù)。

l 材料

1.1 儀器

LC-20AT型HPLC儀，配有SPD-M20A型二極管陣列（DAD）檢測器、SIL-20A型自動進樣器、CT0-20A型柱溫箱、DGU-20A3型真空脫氣機、LC-20AT型溶液傳輸單元（日本Shimadzu公司）;BP211D型十萬分之一電子天平（德國Sartorius公司）;TG-16WS型臺式高速離心機（長沙湘智離心機儀器有限公司）;UV-5200PC型紫外一可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）;Multi-skan GO型酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）;Biosafer-20TB型實驗室級超純水器[賽飛（中國）有限公司];XMTD-8222型電熱恒溫水浴鍋、PH27-9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）;ST2100型實驗室pH計[奧豪斯儀器（常州）有限公司];N-1100D-WD型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本Eyela公司）。

1.2 藥品與試劑

葡萄糖對照品（批號：AF7022401）、阿拉伯糖對照品（批號：AF8051683）均購自成都埃法生物科技有限公司;甘露糖對照品（批號：40708）、半乳糖對照品（批號：10509）、鼠李糖對照品（批號：30521）均購自德國Dr. Eh-renstorfer GmbH公司;半乳糖醛酸對照品（上海金穗生物科技有限公司，批號：20180422）;木糖對照品（上海麥克林生化科技有限公司，批號：C10026034）;α一葡萄糖苷酶對照品（美國Sigma公司，批號：SLBX6245）;阿卡波糖對照品（批號：J1824027）、對硝基苯-a-D-葡萄糖吡喃苷（ PNPG）對照品（批號：E1828029）均購自阿拉丁試劑（上海）有限公司;上述對照品的純度均大于98%。0.1mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS） （pH 6.8，福州飛凈生物科技有限公司）;乙腈、磷酸二氫鉀（KH2P04）、PMP等均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 藥材

廣金錢草藥材（編號：SI～S18）采自廣東省各栽培基地，經(jīng)廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院中藥資源系楊全教授鑒定為豆科植物廣金錢草[D.styracifolium（ Osb.） Merr.]的地上部分。藥材樣品來源見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex Luna C18（ 250 mm×4.6 mm，5μm）;流動相：乙腈（A相）-0.05 mol/L KH2PO4溶液（用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至6.8，B相），梯度洗脫（0～30 min，17%A→ 19%A;30～50 min，19%A）;流速：0.8 mL/min;檢測波長：250 nm;柱溫：30℃;進樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合單糖對照品貯備液及其衍生化溶液

精密稱取鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖對照品各適量，置同一量瓶中，加水配制成質(zhì)量濃度分別為0.33、0.88、1.89、0.82、0.45 mg/mL的混合單糖對照品貯備液。精密吸取上述混合單糖對照品貯備液200 μL，置于具塞試管中，依次加入0.3 mol/L氫氧化鈉溶液200 μL和0.5 mol/L PMP甲醇溶液200 μL，混勻，密封，于70℃反應(yīng)1h，取出，冷卻至室溫;精密加入0.3mol/L鹽酸溶液200 μL調(diào)pH至中性，加入12.5%KH2PO4溶液200 μL，搖勻，再加入等體積氯仿萃取3次;棄去氯仿液，上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，即得混合單糖對照品衍生化溶液，備用。

2.2.2 粗多糖及其供試品溶液

采用水提醇沉法提取廣金錢草多糖。稱取廣金錢草藥材樣品適量，粉碎，取粉末5 9，用沸水200 mL回流提取3次，每次1h;趁熱濾過，合并濾液，濃縮后以5 000r/min離心10 min;取上清液，加適量乙醇至含醇量為80%（V/V），于4℃冰箱中放置過夜;以5 000 r/min離心5 min，收集沉淀，凍干，即得粗多糖。精密稱取上述粗多糖50 mg，置具塞試管中，加入2 mol/L三氟乙酸溶液2 mL，混勻，密封，于100℃水解8h，蒸干，殘渣加甲醇1mL，蒸干，重復(fù)3～5次;殘渣加水8 mL復(fù)溶，即得多糖水解液。取上述多糖水解液200 μL置于具塞試管中，按“2.2.1”項下方法進行衍生化處理，即得供試品溶液，備用。

2.2.3 陰性對照溶液

按“2.2.1”項下方法制備不含單糖對照品的陰性對照溶液，備用。

2.3 HPLC指紋圖譜的建立

2.3.1 方法學(xué)考察

（l）精密度試驗：取“2.2.2”項下供試品溶液（編號：S16）適量，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，以葡萄糖峰為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，9個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3%（n=6），表明該方法的精密度良好。

（2）穩(wěn)定性試驗：取“2.2.2”項下供試品溶液（編號：S16）適量，分別于室溫下放置O、4、8、12、16、24 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以葡萄糖峰為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，9個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于5%（n=6），表明供試品溶液于室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

（3）重復(fù)性試驗：取藥材樣品（編號：S16）適量，粉碎，精密稱取粉末適量，共6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以葡萄糖峰為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，9個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于5%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.3.2 HPLC指紋圖譜生成與相似度、共有峰相關(guān)分析

（l） HPLC指紋圖譜的生成：取18批藥材樣品各適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012版）對18批藥材樣品的HPLC指紋圖譜進行分析，得HPLC指紋圖譜，詳見圖1、圖2。

（2）相似度評價：采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012版），以藥材樣品的HPLC對照指紋圖譜為對照，進行整體相似度評價。結(jié)果顯示，18批藥材樣品中，有15批相似度大于0.90，詳見表2。

（3）共有峰的指認(rèn)及相關(guān)分析：18批藥材樣品有9個共有峰，通過與混合單糖對照品衍生化溶液（按“2.2.1”項下方法配制，甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖的質(zhì)量濃度分別為0.24、0.13、0.35、0.76、0.33、0.07、0.18 mg/mL，其HPLC圖見圖3A）比對，指認(rèn)出1、4、5～9號峰依次為甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖。由于6號峰信號強且峰形好，故以其保留時間和峰面積為參照，計算其他色譜峰的相對保留時間和相對峰面積，詳見表3、表4（表中，P1～P9依次對應(yīng)1～9號峰）。

2.4 廣金錢草多糖的單糖含量測定

由于7個共有峰中，有2個單糖（甘露糖、木糖）的含量偏低（低于本方法檢測限），故本研究只檢測了其余5個單糖的含量。

2.4.1 方法學(xué)考察

（l）專屬性：取“2.2”項下混合單糖對照品衍生化溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果，對照品和供試品溶液的色譜峰峰形良好，陰性對照溶液對測定無干擾，詳見圖3。

（2）線性關(guān)系考察：精密吸取“2.2.1”項下混合對照品貯備液0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.O mL，分別置于2 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，混勻。再分別精密吸取上述稀釋后的混合對照品溶液各200 μL，按“2.2.1”項下方法進行衍生化處理，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定。以待測物質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進行線性回歸，得鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖的回歸方程分別為y=13 534x - 63 714 （r=0.999 8）、y=17 053x - 94 675 （r=0.999 6）、y=16 639x+25 588（ r=0.999 4）、y=20 818x-9 100.9 （r=0.999 7）、y=20 065x-42 258（r=0.999 6）.上述各單糖檢測質(zhì)量濃度的線性范圍分別為8.25～330.00、22.00～880.00、47.25～1 890.00、20.50～820.00、11.25～450.00 μg/mL。

（3）檢測限與定量限考察：精密吸取“2.2.1”項下混合單糖對照品衍生化溶液適量，以水為溶劑倍比稀釋，并按“2.1”項下色譜條件進樣測定，分別以信噪比3：1和10：1計算檢測限和定量限。結(jié)果，鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖的檢測限分別為2.06、2.75、2.36、1.03、2.25 μg/mL;定量限分別為4.13、11.00、5.91、2.56、5.63 μg/mL。

（4）精密度試驗：精密吸取“2.2.1”項下混合單糖對照品衍生化溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖峰面積的RSD分別為1.48%、3.49%、0.33%、0.64%、0.41%（n=6），表明儀器精密度良好。

（5）穩(wěn)定性試驗：取“2.2.2”項下供試品溶液（編號：S16）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖峰面積的RSD分別為1.53%、2.99%、3.68%、5.82%、4.99%（n=6），表明供試品溶液于室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

（6）重復(fù)性試驗：取藥材樣品（編號：S16），共6份，粉碎，精密稱取粉末適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算樣品含量。結(jié)果，鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖含量的RSD分別為4.53%、4.72%、4.25%、4.71%、4.43%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

（7）加樣回收率試驗：精密稱取已知含量的樣品（編號：S16）6份，每份50 mg，分別精密加入鼠李糖100μg、半乳糖醛酸240 μg、葡萄糖500μg、半乳糖240 μg、阿拉伯糖150 μg，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率。結(jié)果，鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖的平均加樣回收率分別為100.77%、102.61%、98.78%、100.60%.101.93% ，RSD分別為3.18%、2.08%、1.70%、1.83%、2.61%（n=6），表明該方法的準(zhǔn)確度良好。

2.4.2 單糖含量測定與摩爾比計算

分別取18批廣金錢草藥材各適量，粉碎，精密稱取藥材粉末5 g，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定。采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算樣品含量[以每克藥材中所含單糖質(zhì)量（mg）計];參考文獻方法[10]，以含量最低的單糖為基準(zhǔn)，計算各單糖的摩爾比。結(jié)果，不同批次廣金錢草藥材中的多糖均以半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖為主，鼠李糖含量均最低，詳見表5、表6。

2.5 廣金錢草多糖對α一葡萄糖苷酶的體外抑制活性采用PNPG法進行考察。

2.5.1阿卡波糖對照品溶液的制備

精密稱取阿卡波糖對照品適量，加水溶解并稀釋，制得質(zhì)量濃度分別為2.50、5.00、7.50、10.00、15.00、20.00、25.00 mg/mL的對照品系列溶液。

2.5.2 多糖供試品溶液的制備

精密稱取“2.2.2”項下廣金錢草粗多糖20 mg，加水400 μL使溶解，得粗多糖貯備液。分別量取上述貯備液各適量，加水稀釋，制得質(zhì)量濃度分別為0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、4.00 mg/mL的多糖供試品溶液。

2.5.3 測定方法及結(jié)果

精密吸取“2.5.1”“2.5.2”項下的阿卡波糖對照品系列溶液和供試品溶液各10 μL，置于96孔板中，加入PBS 60 μL，再加入2U/mLα一葡萄糖苷酶水溶液10 μL，混勻，于37℃孵育15 min;隨后加入5 mmol/L PNPG水溶液20 μL，于37℃孵育20 min，加入0.1 mol/L碳酸鈉溶液50 μL終止反應(yīng)。以水為空白對照，以阿卡波糖為陽性對照，于405 nm波長下測定各孔光密度（OD）值，計算抑制率和半數(shù)抑制濃度（ICso）：抑制率（%）=（OD空n - OD 樣品）/OD空白×100%[11]。各樣品均重復(fù)測定3次，結(jié)果見表7。由表7可知，阿卡波糖和廣金錢草多糖對α一葡萄糖苷酶的抑制活性均呈現(xiàn)隨著劑量升高而增強的趨勢;廣金錢草多糖對α一葡萄糖苷酶抑制活性明顯（IC50=0.70 mg/mL），且強于陽性對照阿卡波糖（IC50=7.76 mg/mL）。

3 討論

3.1 衍生化條件的優(yōu)化 本課題組前期以單糖峰面積為評價指標(biāo)，分別對廣金錢草多糖的酸水解時間、PMP衍生化溫度及衍生化時間進行優(yōu)化，得到最佳的柱前衍生化條件（即酸水解8h，70℃下衍生化1 h）。在PMP衍生化過程中，本課題組還比較了磷酸鹽（ KH2P04）的加入對樣品HPLC色譜圖的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，于氯仿萃取前在供試品液中加入適量KH2P04溶液，可明顯抑制PMP峰，改善基線狀態(tài)，有利于單糖的定量分析。

3.2 單糖檢測方法的選擇

生物多糖中單糖組成分析常用的方法包括薄層色譜法、氣相色譜峰、HPLC法等。其中，薄層色譜法樣品處理繁瑣，鑒別能力弱，已逐漸被儀器分析方法取代;氣相色譜法對中性單糖的分離效果較好，而對酸性多糖的分離效果較差，且前期處理復(fù)雜、耗時，易出現(xiàn)色譜峰異構(gòu)化裂分;HPLC法可較好地對中性、酸性多糖進行分離鑒定[12]。故本研究采用PMP柱前衍生化-HPLC法對廣金錢草多糖的單糖組成進行定性、定量分析。結(jié)果顯示，所建HPLC法重復(fù)性、穩(wěn)定性良好，且靈敏度較高。

3.3 色譜條件的優(yōu)化

本課題組分別比較了乙腈一乙酸銨溶液和乙腈一KH2P04溶液等兩種流動相體系，發(fā)現(xiàn)后者的分離效果更優(yōu)。進一步對KH2P04溶液的濃度（0.01、0.02、0.05mol/L）進行篩選后發(fā)現(xiàn)，以0.05 mol/L KH2P04溶液（用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至6.8）作為有機相時，各待測物色譜峰峰形的對稱性良好。此外，本課題組還考察了各單糖在YMC-Pack ODS-AQ、Inertsil ODS-3、Phenomenex Lu-na C18等色譜柱上的分離效果，最終確定了本文中的色譜條件。

3.4 指紋圖譜的結(jié)果分析

本研究建立了18批廣金錢草藥材多糖的HPLC指紋圖譜，確定了9個共有峰，并指認(rèn)了其中7個。18批樣品中有15批的相似度超過0.9，表明廣金錢草多糖具有較好的穩(wěn)定性，可作為藥材質(zhì)量控制的指標(biāo)之一。

3.5 單糖定量分析結(jié)果分析

本課題組在18批廣金錢草藥材多糖中共檢測了5種單糖成分的含量，分別為鼠李糖0.471～2.092 mg/g，半乳糖醛酸1.379～8.919 mg/g，葡萄糖2.560～35.679mg/g，半乳糖1.194～6.905 mg/g，阿拉伯糖0.566～4.158 mg/g;以鼠李糖為基準(zhǔn)，半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖的摩爾比分別為1.58～4.07、2.26～19.95、2.20～4.21、1.31～2.86。結(jié)果表明，不同產(chǎn)地廣金錢草的多糖組成均以葡萄糖為主，鼠李糖的含量最低，且各單糖含量存在差異，可能與產(chǎn)地的土壤、氣候等環(huán)境因素有關(guān)。

3.6 α一葡萄糖苷酶抑制活性的結(jié)果分析

PNPG經(jīng)α一葡萄糖苷酶催化可生成對硝基苯酚（PNP），PNP在400 nm左右波長處有最大紫外吸收，測定此波長下PNP的OD值，可用以計算抑制劑對α一葡萄糖苷酶的抑制率[13]?；诖?，本研究以PNPG為底物、以阿卡波糖為陽性對照，初步評價了廣金錢草多糖對α一葡萄糖苷酶的抑制作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，廣金錢草多糖對α一葡萄糖苷酶具有明顯的體外抑制作用，且活性強于陽性對照阿卡波糖，可為后續(xù)其降血糖作用研究提供依據(jù)。

4 結(jié)語

本研究采用PMP柱前衍生化-HPLC法分析了18批廣金錢草藥材多糖中的單糖組分，并建立了廣金錢草多糖的HPLC指紋圖譜;在此基礎(chǔ)上，通過對單糖組分的定性、定量分析，初步探討了18批廣金錢草藥材多糖的組成特征、單糖含量及摩爾比。本研究還發(fā)現(xiàn)，廣金錢草多糖對僅一葡萄糖苷酶的體外抑制活性強于陽性對照阿卡波糖，提示其可能具有降血糖作用。但本研究尚未對廣金錢草多糖的藥效學(xué)進行分析，有待后續(xù)研究進一步完善。

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（收稿日期：2019-05-24修回日期：2019-10-18）

（編輯：張元媛）

△基金項目：國家發(fā)展和改革委員會新興產(chǎn)業(yè)重大工程包/國家中醫(yī)藥管理局中藥標(biāo)準(zhǔn)化行動計劃項目（No.ZYBZ-Y-GD-13/ZYY-2017-099）

*副教授，博士。研究方向：中藥化學(xué)成分與藥理活性。電話：020-39352176. E-mail： gdyxycxx@126.com

#通信作者：教授，博士。研究方向：道地藥材質(zhì)量及形成機制。電話：020-39352353.

E-mail： yangquan7208@vip.163.com