高效液相色譜法測定6個不同產(chǎn)地的牡丹葉中丹皮酚和芍藥苷含量

孫晶, 魏永利，李克明，梁昆

(1. 新泰市中醫(yī)醫(yī)院，山東 新泰 271200； 2.山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，山東 濟南 250014; 3.山東省中醫(yī)藥研究院，山東 濟南 250014; 4.中國中醫(yī)科學院望京醫(yī)院，北京 100102)

牡丹為芍藥科芍藥屬多年生落葉灌木，栽培品種以河南洛陽、山東菏澤、甘肅等地為主[1]。牡丹干燥根皮作為傳統(tǒng)中藥丹皮入藥，始載于東漢 《神農(nóng)本草經(jīng)》，其味苦微寒，具有清熱涼血、活血化瘀的功效[2]，適用于熱入營血、吐衄發(fā)斑、無汗骨蒸、痛經(jīng)閉經(jīng)、跌撲損傷、瘡癰腫毒等癥[3]。

現(xiàn)代藥理研究表明，牡丹具有降血糖、抗炎、鎮(zhèn)痛、抑菌、調節(jié)心血管系統(tǒng)、抗腫瘤、清除自由基、抗氧化等作用[4-6]。除根皮外，其葉、花瓣、花粉、種子及籽粕均可入藥[7]，目前對于牡丹的研究主要以牡丹皮、牡丹花為主，而對于牡丹葉的研究則較為少見。我們前期研究認為牡丹葉對于原發(fā)性痛經(jīng)[8]、慢性痛風性關節(jié)炎[9-10]等疾病具有很好的療效。本研究通過高效液相色譜法測定6個不同產(chǎn)地來源的牡丹葉中丹皮酚、芍藥苷的含量，以期對牡丹葉的進一步開發(fā)應用提供科學依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 實驗儀器

Waters H-Class UPLC(美國沃特世公司)；KQE-400B型超聲清洗機(昆山超聲儀器有限公司)； Metter Toledo EL2401電子天平(瑞士梅特勒公司)。

1.2 實驗藥品與試劑

牡丹葉(產(chǎn)地分別為山東菏澤、安徽亳州、安徽銅陵、甘肅武威、四川墊江、山西運城)；丹皮酚對照品(上海源葉生物科技有限公司，批號B20266，純度98%以上)；芍藥苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號107D021，純度95%以上)；甲醇為色譜純；乙腈為色譜純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

2.1.1 丹皮酚測定色譜條件

色譜柱Waters Xbridge shield RP18 (5 μm, 4.6 mm×150.0 mm)；流動相為甲醇-水(體積比45:55)，檢測波長275 nm；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量為10 μL。

2.1.2 芍藥苷測定色譜條件

色譜柱Waters Xbridge shield RP18 (5 μm, 4.6 mm×150.0 mm)；流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液(體積比15:85)，檢測波長230 nm；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量為10 μL。

2.2 對照品溶液的制備

2.2.1 丹皮酚對照品溶液的制備

精密稱取丹皮酚對照品8 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL含有丹皮酚800 μg的對照品溶液。

2.2.2 芍藥苷對照品溶液的制備

精密稱取芍藥苷對照品20 mg，置25 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL含有芍藥苷800 μg的對照品溶液。

2.3 樣品溶液的制備

2.3.1 測定丹皮酚的樣品溶液制備

取牡丹葉樣品，粉碎后，取約0.5 g，精密稱定后，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.2 測定芍藥苷的樣品溶液制備

取牡丹葉樣品，粉碎后，取約0.1 g，精密稱定后，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇20 mL，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用稀乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系考察

分別配置濃度為12.5，25.0，50.0，200.0和400.0 μg/mL的丹皮酚對照品溶液，精密吸取10 μL注入液相色譜儀。以對照品濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得到丹皮酚的回歸方程y=56 403x+84 446(R2=0.999 9)，結果表明丹皮酚標準品在濃度12.5～400.0 μg/mL內與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關系(圖1)。

分別配置濃度為50.0，100.0，200.0，400.0和800.0 μg/mL的芍藥苷對照品溶液，精密吸取10 μL注入液相色譜儀。以對照品濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得到芍藥苷的回歸方程y= 6 805.6x-102 292，R2=0.999 5，結果表明芍藥苷標準品在濃度50.0～800.0 μg/mL內與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關系(圖2)。

圖1 丹皮酚標準曲線圖Fig.1 Standard curve of paeonol

圖2 芍藥苷標準曲線Fig. 2 Standard curve of paeoniflorin

2.5 精密度實驗

按照2.3.1的方法，取丹皮酚對照品溶液，進樣量10 μL，連續(xù)進樣6次，記錄峰面積；按照2.3.2的方法，取芍藥苷對照品溶液，進樣量10 μL，連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。結果丹皮酚、芍藥苷峰面積相對標準偏差分別為1.62%、1.15%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性實驗

取牡丹葉適量，按照2.3.1的方法，分別于0.0，1.0，2.0，4.0，6.0，12.0 h進行進樣測定，記錄峰面積；取牡丹葉適量，按照2.3.2的方法，分別于0.0，0.5，1.0，2.0，18.0，24.0 h進行進樣測定，記錄峰面積。結果可知，丹皮酚的峰面積相對標準偏差為0.54%，芍藥苷的峰面積相對標準偏差為1.89%。表明供試品溶液在室溫下24 h穩(wěn)定性良好。

2.7 重復性實驗

取6份樣品，按照2.4、2.5的方法，進行測定，記錄峰面積，結果可知，丹皮酚的峰面積相對標準偏差為0.25%，芍藥苷的峰面積相對標準偏差為0.91%，總黃酮吸光度的相對標準偏差為1.56%，總多糖吸光度的相對標準偏差為1.56%，表明本方法重復性良好。

2.8 加樣回收率實驗

精密稱定已知含量的樣品粉末0.5 g，共6份，分別加入適量丹皮酚對照品，按照既定方法制備供試品溶液，記錄峰面積，計算回收率。

精密稱定已知含量的樣品粉末0.1 g，共6份，分別加入適量芍藥苷對照品，按照既定方法制備供試品溶液，記錄峰面積，計算回收率。

結果可知，丹皮酚、芍藥苷的平均回收率分別為99.96%、101.66%，回收率相對標準偏差分別為0.34%、2.01%，表明該方法準確度良好。

2.9 樣品含量測定

采用 2.3的方法制備樣品溶液，采用2.1色譜條件分別進樣分析，得出丹皮酚和芍藥苷的相應峰面積，根據(jù)2.4方法中回歸方程算出各化合物的含量，平行 3次取平均值，對6個不同產(chǎn)地的牡丹葉進行了含量測定，結果見表1和圖3、圖4。

表1 6個不同產(chǎn)地牡丹葉中丹皮酚、芍藥苷的含量

圖3 丹皮酚標準品和牡丹葉樣品色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of paeonol standard and Paeonia suffruticosa leaf sample

圖4 芍藥苷標準品和牡丹葉樣品色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of paeoniflorin standard and Paeonia suffruticosa leaf sample

3 討論與結論

本研究通過高效液相色譜法測定6種牡丹葉中丹皮酚、芍藥苷的含量，關于色譜條件，參照《中國藥典》2015版一部[11]。在測定丹皮酚含量時確定了甲醇-水(體積比45:55)作為流動相，檢測波長275 nm，流速1.0 mL/min，進樣量為10 μL；在測定芍藥苷含量時確定了乙腈-0.1%磷酸水溶液(體積比15:85)作為流動相，檢測波長為230 nm，流速1.0 mL/min，進樣量為10 μL。

供試品的制備方法直接影響含量測定的準確性，因此本研究對提取溶劑進行了篩選，根據(jù)《中國藥典》2015版一部，牡丹皮中丹皮酚的含量測定方法和白芍中芍藥苷中的測定方法，分別選擇甲醇和稀乙醇作為丹皮酚和芍藥苷測定的提取溶劑。從實驗結果可以看出，目標峰峰面積與濃度呈良好的正相關線性關系，實驗的精密度、穩(wěn)定性、重復性和回收率的測定均符合實驗要求。

經(jīng)測定，6個產(chǎn)地牡丹葉中均含有丹皮酚及芍藥苷成分，不同產(chǎn)地來源的牡丹葉化學成分含量有所差別。實驗結果可用于牡丹葉中丹皮酚及芍藥苷等化學成分含量的測定，為質量綜合評價及藥效的科學解釋提供了準確、快速的定量分析方法，為合理的藥物來源選擇提供了證據(jù)支持，也為其質量控制提供了科學依據(jù)。